TECNICAS DE TINCION

Tcnica histolgica
Para empezar con la tcnica histolgica se debe obtener una MUESTRA DEL TEJ IDO
a estudiar y existen 2 formas:
Necropsia: Examen u obtencin de tejido de un organismo muerto.
Biopsia: del griego bios = vida y oasis = visin) Examen u obtencin de tejido de un
organismo vivo. Puede ser inscisional, excisional, por sacabocado, por puncin y
absorcin, por raspado, por trepanacin.
FIJACIN:
Este proceso se refiere al tratamiento del tejido con sustancias qumicas que tienen
varias finalidades:
Conservar los tejidos de forma que muestren el mayor parecido posible a su estado
in vivo.
Aumentar la dureza del tejido para facilitar la preparacin de finas pelculas de
ste.
Destruir bacterias y grmenes que pudieran encontrarse en ellos.
Interrumpir los procesos celulares dinmicos que ocurren a la muerte de la clula.
Tcnica histolgica
Esto se logra al inactivar ciertas enzimas celulares que de otra manera iniciaran la
Autolisis y llevaran a la DEGENERACIN POST MORTEM.
La fijacin mantiene las estructuras al estimular la formacin de enlaces cruzados entre las
protenas.
Los agentes ms usados para Microscopia de Luz son:
Formaldehdo al 5%, Formol al 10% o Formalina (Solucin de Formaldehdo especial)
Puede usarse con amortiguadores o con otros fijadores.
Reacciona con los grupos aminos de las protenas, formando enlaces transversales y
conservando las estructuras de la clula.
El ms usado es el Formol al 10%.
Glutaraldehdo al 2.5%, Tetrxido de Osmio, Lquido de Helly y Fijador de Bouin
Funcionan formando enlaces transversales en las protenas y manteniendo las
estructuras de la clula.
El fijador de Bouin es una solucin que contiene 75 ml de solucin acuosa saturada de
cido pcrico, 25 ml de formol y 5 ml de cido actico glacial.
El lquido de Helly es una solucin con 2.5 g de bicromato de potasio, 5 g de cloruro de
mercurio, 100 ml de agua y 5 ml de formol.
Tcnica histolgica
Cloruro de Mercurio y cido Picrico
Precipitan las protenas.
Para Microscopia Electrnica se usan:
Glutaraldehdo al 2.5%, Paraformaldehdo, Tetrxido de Osmio y Permanganato de
Potasio
Permiten conservar detalles estructurales finos, ya que otros fijadores como el
formaldehdo, son muy enrgicos en su accin con las protenas.
Actan como colorantes electrodensos, permitiendo observar al tejido con el haz de
electrones.
Una solucin de Glutaraldehdo al 2.5% en un tampn a pH 7.4, evita la violenta
desnaturalizacin de las protenas guardando detalles finos de la clula. Es el ms usado
en Microscopia Electrnica.
Regla de Oro para la Fijacin
La mejor fijacin es cuando a pasado el menor tiempo entre la muerte del tejido y la fijacin.
Tamao de la Muestra
El tamao de la muestra debe de ser de 2-3 cm. variando el estudio para lo cual de va a
utilizar.
Tcnica histolgica
DESHIDRATACIN
Despus que la muestra ha sido fijada se elimina el fijador y se deshidrata.
Debido a que una gran parte del tejido est constituida por agua, se aplica una serie
gradual de soluciones acuosas de menor a mayor de agente deshidratante, por ejemplo,
Alcohol Etlico o Acetona. Iniciando con alcohol al 50 %, luego con una solucin de 60%,
70%, 80%, 90%, 96% y alcanzando de manera paulatina el alcohol al 100 % para eliminar
el agua. Esto se hace por que si se colocara el tejido en una solucin al 100% de alcohol
inmediatamente, el agua saldra muy rpido del tejido y se deformara.
ACLARAMIENTO O DIAFANIZACIN
Luego de deshidratar el tejido, se pasa a una solucin de una sustancia que es miscible
tanto con el alcohol como con el medio de inclusin a utilizar (en la mayora de los casos
se utiliza como medio de inclusin Parafina lquida). La sustancia comnmente utilizada es
el Xileno o Xilol. De la misma manera se coloca la muestra de tejido en un recipiente de
Xilol, el Xilol solo es soluble en alcohol al 100%. Se llama aclaramiento ya que el tejido se
torna transparente o claro en el xileno, esto se debe a que cambia su ndice de refraccin.
Tambin se pueden utilizar Tolueno, Benzol o Cloroformo como medios de aclaramiento.
NOTA: El alcohol y el xileno disuelven los lpidos de la clula y por lo cual al
extraerse tambin se extraen las grasas y los lpidos de la clula.
Tcnica histolgica
INCLUSIN O IMPREGNACIN
A fin de que se puedan obtener cortes suficientemente finos para ser observados al
microscopio, los tejidos tienen que ser incluidos y envueltos por una sustancia de consistencia
firme. Las sustancias usadas para este fin son: gelatina y parafina.
El objeto de la inclusin es:
Distinguir entre s las clulas superpuestas en un tejido y la matriz extracelular.
Tener un objeto lo suficientemente duro para su manejo y corte.
La inclusin se logra al infiltrar la parafina liquida o cualquier medio de inclusin en estado
lquido al tejido, que disuelve el medio de aclaramiento y penetra en el tejido. Por lo general se
coloca la muestra de tejido en un recipiente y se le agrega la parafina fundida a 60 C,
colocando la muestra en una estufa de 30 minutos a 6 horas manteniendo la temperatura a
60 C.
Debido al calor, el xilol o el benzol se evaporan y los espacios anteriormente ocupados por
ellos son ahora ocupados por la parafina. Despus se coloca la pieza y un poco de parafina
fundida en un molde de papel o metal de forma rectangular y se deja solidificar a temperatura
ambiente, formndose un bloque slido de parafina con el trozo de tejido incluido, a este
bloque se le denomina Taco.
Los medios de inclusin para Microscopia Electrnica comnmente utilizados son resinas
polimerizadas o epoxi como:
Epon Mikropal Araldit
Tcnica histolgica
SECCIN O CORTE
El taco ahora se puede cortar en secciones lo suficientemente delgadas como para permitir el
paso de la luz. La mayor parte de los preparados para microscopia ptica tienen un grosor
entre 3 a 10 micrmetros. Para estos cortes se utiliza un aparato llamado MICROTOMO.
Cuando deseamos estudiar grasas o lpidos que se extraen en el proceso de aclaramiento o
enzimas que quedan inactivadas por el calentamiento de la inclusin, nos auxiliamos con la
Tcnica de Congelacin de Tejidos. Un tejido congelado, es los suficientemente duro para
ser cortado.
Se sumerge la muestra de tejido en Nitrgeno lquido para tener una congelacin rpida.
Luego se corta con un aparato especial denominado MICROTOMO DE CONGELACIN,
existe un aparato ms elaborado y eficiente para los cortes de congelacin llamado
CRIOSTATO. La ventaja de esta tcnica es que los cortes que se obtienen son muy rpidos,
se puede utilizar en el diagnostico de material patolgico, tomado en intervenciones
quirrgicas y el resultado se obtiene en el transcurso de una operacin.
Para Microscopia Electrnica se requieren cortes ms delgados (denominados ultra finos) de
aproximadamente 25 a 100 nm. de espesor y de 0.5 mm. de lado medio. Para esto se utiliza
un MICROTOMO CON HOJA DE VIDRIO O DIAMANTE. Una vez preparados, se montan
sobre rejillas de cobre con un dimetro de 3mm.
Micrtomo de deslizamiento
Micrtomo de rotacin
Tcnica histolgica
MONTAJE Y TINCIN
Los cortes todava no son aptos para su examen con el microscopio, puesto que los tejidos
se hallan infiltrados en parafina y carecen de color.
Los cortes se colocan sobre portaobjetos a los que se les ha agregado una pequea
cantidad de Albmina, la cual acta como adhesivo.
La parafina se elimina en un solvente orgnico, de nuevo se incluyen en Xilol, y la muestra
se rehidrata hacindola pasar por una serie de graduaciones decrecientes de alcohol etlico
hasta llegar a una solucin 100% de agua.
Ya rehidratado se TIE EL TEJIDO. Los colorantes ms utilizados son la HEMATOXILINA y
la EOSINA. Una vez teido, se deshidrata de nuevo, de tal manera que pueda fijarse de
modo permanente el CUBREOBJ ETOS con un medio adecuado para el MONTAJE (por
ejemplo una gota de Blsamo de Canad o similar). Los medios de montaje pueden ser
miscibles o no miscibles en agua, si son miscibles en agua ya no es necesaria la
deshidratacin despus del teido, se puede montarlo directamente. El cubreobjetos no solo
protege el tejido, sino que se requiere para observar el corte con un microscopio.
Los colorantes pueden agruparse en 3 clases:
Colorantes que diferencian los componentes cidos y bsicos de la clula.
Colorantes especializados que distinguen los componentes fibrosos de la matriza
extracelular.
Mtodos de coloracin:
- Coloracin directa: existe una verdadera afinidad entre el colorante y el objeto.
- Coloracin indirecta: requiere la intervencin de intermediarios o mordientes para que la
coloracin tenga lugar.
- Coloracin progresiva: se hace actuar el colorante hasta que llegue a su punto ptimo.
- Coloracin regresiva: se realiza primero una sobrecoloracin y luego se elimina el resto del
colorante por medio de diferenciadores. A este proceso se lo denomina diferenciacin.
- Coloracin simple: se colorean solamente algunos elementos del preparado (ncleo, fibras
elsticas, etc.).
- Coloracin combinada: se tien los elementos nucleares y citoplasmticos recurrindose,
generalmente, al empleo sucesivo de colores bsicos y cidos que contrastan por sus
colores.
- Coloracin panptica: es una coloracin combinada realizada sucesivamente por
colorantes neutros (May-Grnwald-Giemsa).
- Coloracin pancrmica: en un solo bao colorante actan todos los colorantes neutros que
se necesiten.
HEMATOXILINA Y EOSINA
Hematoxilina y Eosina
En los cortes
(micropreparados) teidos con
hematoxilina y eosina (H&E),
usados para la identificacin
de los tejidos y rganos con el
microscopio ptico, o en las
reproducciones
(fotomicrografas o imgenes
de otro orden) de los mismos,
es posible ver estructuras
acidflas (color rosceo) y
basfilas (color azuloso).
Tejido conjuntivo
Caractersticas clave para identificar los tejidos bsicos en cortes coloreados con
hematoxilina y eosina
TEJIDO EPITELIAL TEJIDO CONECTIVO TEJIDO
MUSCULAR**
TEJIDO NERVIOSO
DISPOSICIN DE LAS
CLULAS
ORDENADA DESORDENADA* ORDENADA DESORDENADA
FORMA Y TAMAO DE
LAS CLULAS
PEQUEAS
PLANAS, CBICAS Y
CILNDRICAS
PEQUEAS
MULTIFORMES
GRANDES
FORMA CILNDRICA
(MUSCULO ESTRIADO) O
AHUSADA (MUSCULO
LISO)
GRANDES
MULTIFORMES CON
PROLONGACIONES
DISTANCIA ENTRE LAS
CLULAS
MNIMA GRANDE MNIMA MNIMA
CANTIDAD DE
SUSTANCIA
INTERCELULAR
MNIMA ABUNDANTE ESCASA ESCASA
TINCIN
PREDOMINANTE Y
CARACTERSTICAS DEL
NCLEO
BASOFLICA
NCLEO CON FORMA
SIMILAR
A LA DE LA
CLULA
EOSINOFLICA
NCLEOS DE FORMAS
VARIADAS
EOSINOFLICA
NCLEOS GRANDES. EN
M. ESTRIADO
ESQUELETICO, EN LA
PERIFERIA DE LA
CLULA. EN M. LISO Y EN
EL CARDIACO, EN EL
CENTRO
PREDOMINANTEMENTE
BASFILA EN LA
SUSTANCIA GRIS Y
EOSINOFLICA EN LA
BLANCA.
NCLEOS DE FORMAS
VARIADAS
EN LAS FIBRAS
NERVIOSAS SE PUEDE
VER LA
NEUROQUERATINA
* En los tejidos conectivos densos regulares, la disposicin ordenada de las de las fibras y de los ncleos de las clulas en
hilera, proporcionan, sin embargo, una apariencia de ordenamiento, que no se aprecia en los dems tejidos conectivos.
**Recordar que las fibras musculares estriadas resultan de la fusin de varios mioblastos y que las lisas representan clulas individuales.
Hematoxilina y Eosina
Tejido cartilaginoso
HEMATOXILINA
Es un colorante vegetal. Para ser utilizada debe ser oxidada previamente. Los
agentes oxidantes pueden ser: el aire (varios meses de exposicin) u oxidantes
artificiales (xido de mercurio, permanganato de potasio, dicromato potsico,
etc.)
Es un colorante directo, pero en la prctica se lo utiliza en forma de lacas
hematoxilnicas (se utiliza alumbre de potasio o de sodio como mordiente para
preparar la solucin colorante), comportndose en este caso como un colorante
indirecto.
EOSINA
Es un colorante artificial (se trata de derivados hidroxixantnicos halogenados
con tres grupos arilo). Presenta autofluorescencia espontnea.
Se la emplea tanto en soluciones acuosas como alcohlicas.
PAS
PAS (REACCIN DEL CIDO PERYDICO-SCHIFF)
La reaccin de PAS nos revela todo tipo de carbohidratos (polisacridos, como
el glucgeno, mucopolisacridos, glicolpidos, glicoprotenas etc.). Se basa en
la reaccin con el reactivo de Schiff de los grupos aldehido liberados de los
grupos vic-glicol presentes en los carbohidratos tras su oxidacin con cido
perydico. El reactivo de Schiff contiene fucsina bsica o pararrosanilina que
en solucin cida y en presencia de SO2 da lugar a una forma no coloreada
(cido N-sulfnico). Este reactivo reacciona con los grupos aldehido libres
formando un compuesto insoluble de color prpura. Esta tcnica se utiliza
sobre cortes obtenidos de tejido incluido en parafina o de tejido congelado.
RESULTADOS: Los carbohidratos se tien de color prpura.
PAS
Trquea con tcnica de PAS
PAS
Intestino delgado con tcnica de PAS
PAS
Intestino delgado con tcnica de PAS
PAS
Tcnica de PAS
GIEMSA
Giemsa
NUCLEO Rojo prpura
CITOPLASMA Neutrfilos - Rojo prpura profundo
Eosinfilos - Rojo anaranjado a naranja amarronado
Basfilos - Rojo negruzco
Monocitos - Azulgrisceo (Grnulos - Rojo prpura)
Linfocitos - Azul (Grnulos azurfilos - Rojo prpura )
Eritrocitos - Marrn anaranjado
Formas policromticas - Azul violeta
Punteado basfilo- Azuloscuro
Cuerpos Howell J olly - Rojo prpura
PARASITOS
Ncleo celular - Rojo profundo
Citoplasma - Azul
Giemsa
Mastocitos teidos con tcnica de Giemsa
Giemsa
Hgado con tcnica de Giemsa
ZIEHL NEELSEN
Ziehl-Neelsen
Tcnica de Ziehl Neelsen
(fucsina fenicada calentada, decolorada con cido-alcohol y contrateida con azul de metileno )
NEGRO SUDAN
Para la determinacin histoqumica se emplean muy a menudo los denominados
COLORANTES SUDN. Estos son casi insolubles en agua. El colorante Sudn se
emplea disuelto en un solvente orgnico en el cual los lpidos sean relativamente
insolubles, y en el que tambin el colorante sea slo parcialmente soluble. Adems, el
colorante debe ser ms soluble en lpidos que en el solvente, puesto que la coloracin
tiene lugar porque las molculas del colorante se distribuyen entre los lpidos y el
solvente en relacin con su solubilidad en ambos. Para evitar la extraccin del
colorante y los lpidos, luego de la coloracin se montan los cortes en medio acuoso.
Los colorantes Sudn tien fuertemente los TRIGLICRIDOS, como por ejemplo:
ROJO DE SUDN O SUDN III, EN LA COLORACIN DE CLULAS ADIPOSAS.
EL NEGRO DE SUDN O SUDN IV, SE EMPLEA EN LA COLORACIN DE LAS
VAINAS MIELNICAS DE LAS FIBRAS NERVIOSAS COMPUESTAS POR
LIPOPROTENAS.
Finalmente hay mtodos que utilizan varios colorantes y que colorean diferentes
estructuras tisulares y que desconociendo las bases qumicas en como se unen con los
componentes se denominan Mtodos no especficos, como el Tricrmico de Mallory.
Negro Sudan
A
B
Se muestran dos preparaciones de corteza
suprarrenal humana, sin tratamiento con negro
sudan (A) y con negro sudan (B) usado para teir
colesterol, esteres de colesterol y fosfolpidos.
Negro Sudan
La tcnica de Sudan puede poner de manifiesto
gotasde lpidos dentro del tejido muscular
(flechas). Aqu se puede ver adems un gran
tringulo negro que corresponde a clulas
adiposas dentro del tabique intermuscular.
Negro Sudan
Se observan grnulos verdes o
negro verdosos en las zonas donde
se encuentran lpidos presentes.
NEUTROFILOS: Reaccin positiva
desde el estado de promielocito o
mieloblasto hasta neutrfilo
segmentado.
BASOFILOS: Tienen reaccin
variable
EOSINOFILOS: Tienen una reaccin
fuertemente positiva
MONOCITOS: Pueden presentar
algunos finos grnulos y en algunas
clulas la reaccin puede ser
totalmente negativa
LINFOCITOS, ERITROBLASTOS y
MEGACARIOCITOS: No contienen
lpidos en su interior.
Reaccin fuertemente positiva en
un promielocito sealado con la flecha
PILZE-GOMORRI
Pilze-Gomorri
AZUL DE TOLUIDINA
Azul de Toluidina
40x
Preparado de hgado que muestra la triada portal: ramas del conducto biliar,
arteria heptica y de la vena porta, clulas cebadas y cordones de hepatocitos
CLOROACETATO
Cloroacetato
Utilizando como substrato el naftol-AS-C-cloroacetato (CAE) se detecta una
esterasa que es especfica de la granulopoyesis neutrfila en la que es
positiva a partir del mieloblasto y se expresa en forma de un precipitado rojo
anaranjado muy brillante. Su utilidad diagnstica se centra bsicamente en el
reconocimiento de clulas blsticas mieloides, si bien su aparicin es ms tarda
que la de la mieloperoxidasa aunque iguala a sta en especificidad
TIOFLAVINA
Degeneracin
neurofibrilar en
neuronas de corteza
cerebral en la
enfermedad de
Alzheimer; obsrvese el
gran ovillo neurofibrilar
en el interior de una
neurona. El tejido ha
sido teido con el
colorante fluorescente
Tioflavina S (Aumento:
400x)
Tioflavina
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