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Prctica N5 Estructura e hidrlisis enzimtica de un polisacrido vegetal (almidn)

INTRODUCCIN
A lo largo de la historia los humanos hemos convivido con diversos organismos biolgicos, dentro de los cuales unos de los ms elementales( para la supervivivencia de todos los dems) son las plantas ya que en su mayora producen oxigeno, son y siempre han sido una gran fuente de alimentacin para todos los dems organismos. Sin embargo qu tanto sabemos de ellas? En esta prctica vamos a conocer un poco ms de la parte qumica detrs de reproduccin por medio de semillas y de qu manera este proceso se lleva a cabo. Las semillas son las unidades de dispersin y reproduccin por excelencia en las plantas. Ellas permiten tanto la continuidad de la especie, mediante la reproduccin sexual, como la posibilidad de introducir variabilidad 1 Principales tipos de semillas que se forman en las gentica de una generacin a la siguiente. Figura angiospermas La semilla es, con frecuencia, un rgano de resistencia inerte, hasta que se presentan las condiciones que le permiten iniciar su actividad y dar nacimiento a una joven planta. Este reinicio de actividad metablica, que origina una nueva generacin, constituye el fenmeno de la germinacin. Las semillas de las angiospermas constituyen de un embrin y un endosperma, resultado de la doble fertilizacin de la clula huevo y de los dos ncleos polares, respectivamente, que se encuentran englobadas por una cubierta de origen materno, que deriva de uno o de ambos integumentos del ovulo. Estos tres componentes (embrin, endosperma y cubierta seminal) forman, en conjunto, lo que se conoce como una semilla. En algunas especies, como los ctricos, se observa otro componente adicional que es la nucela, formada por restos del tejido ovular, y del cual se origina el perisperma como tejido de reserva.
Figura 2 Esquema de la semilla y el embrin de una alubia

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El desarrollo de una semilla, comprende, en general tres fases principales, que con frecuencia se traslapan: Diferenciacin y formacin del embrin. Donde se da la absorcin del agua y desarrollo en la actividad respiratoria. Fase de llenado, que consiste en la translocacin y deposicin de sustancias de reserva. Fase de maduracin y deshidratacin. El peso seco de las semillas maduras en la mayora de las especies consiste de 2 o 3 tipos principales de reserva: Carbohidratos Triacilgliceroles Protenas Estos compuestos son sintetizados durante el desarrollo y depositados en organelas discretas en los tejidos de almacenamiento. (Rodrguez, 2006) Los factores que afectan la germinacin se encuentran. La madurez de la semilla. Se dice que es una semilla madura cuando ha alcanzado su desarrollo fisiolgico completo. Viabilidad de las semillas. Se considera el periodo de tiempo durante el cual las semillas conservan su capacidad de germinacin. Dicho periodo depende mucho de las condiciones de almacenamiento de la semilla. Humedad. La cantidad de agua es vital para la germinacin. Tanto la falta como el exceso de este lquido es perjudicial. Cantidad de oxgeno. Con exceso de humedad la cantidad de oxigeno disminuye. Luz. La exposicin a la luz estimula la iniciacin de la germinacin. Temperatura. Influye sobre las enzimas que regulan la velocidad de la germinacin. Para la germinacin existen distintos lmites de temperatura. (Raven, 1992) Existen diversos tipos de germinacin y algunas difieren entre la literatura pero tradicionalmente, se ha considerado la germinacin hipogea, caracterizada por un reducido crecimiento del hipocatilo, lo que implica que los cotiledones permanezcan bajo el suelo, en contraposicin de la germinacin epigea, donde ocurre alargamiento del hipoctilo y elevacin de los cotiledones sobre el suelo. Algunos autores, proponen distinguir adems entre germinacin criptocotilar y fanerocotilar, segn si los cotiledones permanezcan ocultos entre la hojarasca o se siten por sobre esta. En la germinacin epigea. El hipocotilo empieza a elongarse, empujando a los cotiledones al exterior del suelo, exponindose a la luz del sol y adoptando el color verde, por lo que comienzan la fotosntesis. Los cotiledones les proporcionan a la plntula todos los nutrientes almacenados y se mueren. Caracterstica de dicotiledneas.

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En la germinacin hipogea el hipocotilo prcticamente no crece, por tanto los cotiledones permanecen bajo tierra y en el interior de la testa. El epicotilo empieza a crecer y empuja hacia el exterior al meristemo apical del tallo y a partir de este se forma la parte area de la planta, por el ejemplo la semilla de cebolla. Para que el proceso de germinacin ocurra como ya mencionamos anteriormente se requieren diversas condiciones climticas para romper el letargo o posicin esttica que le permiti madurar; cuando ocurren las condiciones requeridas para romper el letargo, el embrin empieza a producir las giberelinas y las citocininas necesarias para contrarrestar la accin de los inhibidores del crecimiento e iniciar este proceso. En esta etapa, si se le agrega agua, la semilla germinar.

Figura 3 Etapas de la germinacin de la semilla

Figura 4 Proceso de germinacin en semillas de cereales

OBJETIVO
Comprobar la presencia y activacin de amilasas como resultado del proceso de germinacin de semillas de maz y evaluar las diferencias en la actividad amiloltica, dependiendo de los estadios de germinacin en las semillas y de sus requerimientos energticos. Identificar y distinguir las fases de la germinacin. Observando el progreso de la misma. Haciendo uso de literatura para la respectiva identificacin. Comprobar la hidrlisis del almidn a travs de diferentes muestras de semillas. Identificando sobre una muestra de agar-agar

[Escribir el ttulo del documento] METODOLOGA

Material y equipo Para inducir germinacin: Algodn 3 Frascos de vidrio grandes (para los 3 tiempos de germinacin) Para la evaluacin de la germinacin: 1 Bistur 1 Tripi con tela de asbestos 1 Mechero (o bien plato caliente) 1 Matraz EM (para el agar) 3 Matraces aforados 3 Cajas Petri Regla o Vernier Material biolgico: 40 o ms semillas de maz Reactivos y soluciones Para inducir germinacin: Reactivo para desinfectar semillas: Hipoclorito de sodio al 1% en agua destilada Preparar y filtrar suficiente solucin para el lavado de las semillas Agua hervida y fra (para enjuagar)

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Para la evaluacin de la actividad: Solucin amortiguadora de succinato de sodio 0.02 M pH 5 Reactivo de yodo-yoduro de potasio: Yodo resublimado 500 mg Yoduro de potasio 5g
(Disolver en 100 mL de agua hasta disolucin total)

Nota: El reactivo de trabajo se prepara el da de la prctica con 1 mL de la solucin anterior en 100 mL de agua

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Gel de agar-almidn: Agar Almidn

2g 200 mg

(Disolver en 100 mL de solucin de succinato0.02 M pH 5 Llevar a ebullicin durante 2 min con agitacin normal para evitar que se queme Vaciar caliente un volumen aproximado de 10 mL a cada caja Petri)

Seguridad.
Usar bata preferentemente de algodn. No usar zapato abierto. Utilizar pantaln o prenda de ropa que cubra todas las piernas. Cabello corto o en su defecto sujetado. Emplear guantes o algn otro instrumento que nos permita manipular objetos calientes.

Tabla 1Manejo adecuado del hipoclorito de sodio

Hipoclorito de Sodio Para el manejo de este producto es necesario utilizar bata, lentes de Manejo seguridad, guantes de hule y, si la cantidad involucrada es muy grande, un respirador y botas. Para trasvasar pequeas cantidades debe usarse propipeta (perilla) , NUNCA ASPIRAR CON LA BOCA Puede provocar tos y despus la irritacin de los bronquios y su Inhalacin inflamacin, lo mismo que a la laringe, produciendo neumonitis qumica y edema pulmonar. Contacto con Lavarlos con agua corriente por lo menos durante 15 minutos, asegurndose de abrir bien los prpados. ojos Contacto con piel Eliminar la ropa contaminada, si es necesario. Lavar el rea afectada con agua y jabn.

Tabla 2 Manejo adecuado del yoduro de potasio

Yoduro de Potasio Lugares ventilados, frescos y secos. Lejos de fuentes de calor e ignicin. Almacenamiento Separado de materiales incompatibles. Rotular los recipientes adecuadamente y mantenerlos bien cerrados. Usar siempre proteccin personal as sea corta la exposicin o la Manipulacin actividad que realice con el producto. Guantes de plstico, respirador con filtro. Trasladar al aire fresco. Si no respira administrar respiracin artificial. Si Inhalacin respira con dificultad suministrar oxgeno. Mantener la vctima abrigada y en reposo. Buscar atencin mdica inmediatamente. Contacto con piel Retirar la ropa y calzado contaminados. Lavar la zona afectada con abundante agua y jabn, mnimo durante 15 minutos. Si la irritacin persiste repetir el lavado. Buscar atencin mdica.

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Contacto ojos con

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Lavar con abundante agua, mnimo durante 15 minutos. Levantar y separar los prpados para asegurar la remocin del qumico. Si la irritacin persiste repetir el lavado. Buscar atencin mdica.

Table 3 Manejo adecuado del succinato de sodio

Succinato de Sodio Almacenamiento Manipulacin. Contacto con la piel Contacto con los ojos

Recipientes bien cerrados. Ambiente seco. Utilizar guantes de plstico y gafas de proteccin en todo momento. Lavar abundantemente agua. Retirar ropa contaminada. Lavar con abundante agua manteniendo los prpados abiertos.

Disposicin de residuos.
Hipoclorito de Sodio: Utilizar Sulfito de Sodio o perxido de hidrgeno diluido para reducir el material. Desechar como oxisal. Yoduro de Potasio: Mezclar con Carbonato de Sodio para neutralizar. Una vez neutralizado desechar por el drenaje. Yodo Los residuos de este elemento no se debern desechar en ningn tipo de cloacas o sobre el agua. Contener en un recipiente especial para su futura eliminacin. Agar- Almidn Pueden ser considerados como inofensivos. No requieren eliminacin especial. sistema de

[Escribir el ttulo del documento] Procedimiento

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ACTIVACIN DEL PROCESO DE GERMINACIN Y LAS AMILASAS.

POR LAS AMILASAS ACTIVAS EN UNA SEMILLA GERMINADADesinfectar las semillas
(mnimo 15 semillas del mismo tamao por da). Remojar durante 20 minutos en la solucin con el reactivo desinfectante

Lavar con abundante agua hervida y fra.

algodn hmedo y seguir mantenindolo hmedo durante el tiempo que dure la germinacin.

El germinado debe mantenerse en las condiciones ptimas de temperatura y luz por 6 a 7 3 a 4 das.

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EXAMEN CUALITATIVO DE LA HIDROLISIS DEL ALMIDON PRODUCIDO

A 6 7 semillas germinadas de 6 a 7 das, retirar el embrin, el escueto y las racescon la ayuda del bistur.

El endospermo almidonoso cortar por la mitad, colocar de 2 a 4 mitades por cuadrante con la parte plana hacia el agar-almidn de la caja Petri, presionandoligeramente. Dejar reposar por dos horas en la caja Petri Sembrar en

Por otra parte, dejar reposar otras 2 a 4mitades por hora y media.

A otras 2 a 4 mitades dejarlas reposar por una hora. Las otras dos mitades restantes dejarlas reposar por 30 minutos.
Al finalizar la experimentacin, remover cuidadosamente las mitades de las semillas utilizadas.

Revelar la caja Petri adicionando directamente 3ml de solucin deyodo con yoduro de potasio.
Dejar reposar por cinco minutos, pasado el tiempo lavar con agua destilada.

Medir el dimetro de la zona traslucida correspondiente a cada tiempo de reposo con un Vernier.

Volver a repetir el procedimiento con las semillas de 3 a 4 das de germinacin y las de cero das de germinacin

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A) Activacin del proceso de germinacin y las amilasas (0, 3-4 y 6-7 das)

Das de Observaciones germinacin 0

Tamao del (X DE) primordio (cm) (cm) 0.374

Debido al poco tiempo de germinacin, 1,1.5,1.3,0.5 el primordio present una longitud muy corta. En algunas semillas no se present primordio. El endospermo an tena la forma de bolsa rellena.

3-4

El primordio fue muy corto. No present 5,5.5,3.5,4,4.3,2 1.137 hojas abiertas. El endospermo presentaba un volumen menor. Todas las semillas presentaban buen grado de germinacin. El grado de germinacin fue muy bueno. 9,8,3,6.3,9.2,8.7 2.176 Se present la formacin de las primeras hojas abiertas. El endospermo perdi volumen considerablemente

6-7

B) Examen visual cualitativo de la hidrlisis del almidn producido por las amilasas activas en una semilla germinada DAS DE TIEMPO DE REA DE LA ZONA TRASLCIDA (cm2) GERMINACIN HIDRLISIS ANCHO (cm) LARGO (cm) DE) 0 0 0 0 3-4 3-4 3-4 3-4 6-7 30 60 90 120 30 60 90 120 30 0.559 0.531 0.634 1.19 0.98 1.24 0.574,1.13 1.153 1.321 1.021 1.55 1.71 1.6 0.85 1.43 1.52 1.165,1.62

(X

1.61 1.57 1.62 1.26,1.6 1.45 1.42 1.39 1.22,1.42 1.29 1.3 1.8 0.45,1.46

0.974 0.984 1.72 0.3 0.58 0.92 0.43 0.36 0.45 0.91 0.71 0.93 0.31 0.6 1.1 1.03 1.3 0.34

1.34 1.44 1.55 0.86,1.44 1.2 1.31 1.25 0.88,1.25

1.18 1.34 1.22 0.88,1.24 1.03 0.91 1.23 0.33,1.05

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6-7 6-7 6-7 60 90 120 0.47 0.97 0.47 0.36 0.7 0.59 1.31 1.3

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0.92 1.21 0.47,1.14 1.89 0.99,1.998

1.96 2.1 1.3

0.517 0.61

1.17 1.21 0.53,1.22

Anlisis de grfico
Tiempo de germinacin 30 minutos 60 minutos 2 0.65 cm 1.88 cm2 2 0.657 cm 1.23 cm2 0.35 cm2 0.53 cm2

0 Das 3-4 Das 6-7 Das

90 minutos 2.01 cm2 1.1 cm2 1.96 cm2

120 minutos 1.73 cm2 1.1 cm2 0.64 cm2

2.5 2 1.5 0 Das 1 0.5 0 30 minutos 60 minutos 90 minutows 120 minutos Tiempo de germinacin 3-4 Das 6-7 Das

De acuerdo a los resultados obtenidos en el grfico, y gracias a la literatura consultada Se sabe que las semillas de cero das, tratadas para la germinacin, presentan un alto nivel de hidrolizacin. Esto quiere decir que en esta etapa, la semilla tiene que hacer uso excesivo de sus carbohidratos de reserva (almidn) para poder empezar con la germinacin. Lo cual qued confirmado con la prueba de hidrolizacin sobre el agar-agar .Despus los carbohidratos de reserva son administrados para lograr un crecimiento adecuado.

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0 das La semilla de maz slo presentaba ligeras modificaciones. Su aspecto era ms voluminoso de cmo empez. Slo una semilla tena su primera raz de advertencia. Se sabe que el volumen mayor es debido al proceso de activacin de la hidrolizacin.

3-4 das La mayora de las semillas presentaban 1 coleptilo . El endospermo perdi volumen. Lo cual concuerda con el mayor nivel de hidrolizacin. La longitud de las races no era mucha. El coleptilo no presentaba ninguna prefoliacin enrrollada.

6-7 das El endospermo perdi casi la totalidad de su volumen. El coleptilo era de tamao considerablemente grande. Se observaron las primeras prefoliaciones abiertas y en algunos casos hasta una segunda hoja.

Observaciones
Antes de iniciar la germinacin, el endospermo de la semilla del maz se asemejaba a una bolsa rellena. Las semillas de maz presentaban una avanzada edad. Al realizar la prueba de agar-agar y comparar con los resultados obtenidos a partir de semillas con otro grado de hidrolizacin, se percat que las zonas traslcidas aumentaron respecto a los das de germinacin.

Coloquialmente conocido como tallo.

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Conclusiones
El objetivo principal de la prctica se cumpli, se logr confirmar que cuando las semillas finalizan el proceso de germinacin, el almidn es degradado mediante la -amilasa, que de acuerdo a la literatura, es la encargada de romper los enlaces glucosdicos. El proceso de germinacin se da con la finalidad de proporcionar las molculas de glucosa que sern oxidadas para producir la energa que requiere el embrin para su desarrollo antes de poder realizar la fotosntesis. Con la prueba de hidrolisis sobre el agar-agar se observ la actividad enzimtica de la -amilasa sobre las reservas de almidn de la semilla. Se observ que a mayor periodo de germinacin corresponde una mayor actividad enzimtica. Gracias a la literatura se sabe que la reaccin de hidrlisis del almidn tiene como productos finales azcares como glucosa y maltosa (las cuales son azcares reductores). El indicador de agar-agar es un polisacrido de subunidades de galactosa. El cual, reaccion con las semillas hidrolizadas y la prueba de Lugol. Ayudando as, a determinar el grado de hidrolizacin.

Bibliografa
Raven, E. E. (1992). Biologa de las plantas. Espaa: REVERT. Rodrguez, E. V. (2006). Fisiologa de la produccin de los cultivos tropicales. Universidad de Costa Rica. Herrera J. (2006). Germinacin y crecimiento de la planta. 4 edicin. Editorial universidad de Costa Rica. Pgina 22-23. Bayer. (1987) Manual de Qumica Orgnica. Editorial reverte. Pgina 937.

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Cuestionario
1. Qu procesos bioqumicos suceden durante la germinacin de semillas o granos? Existen varias etapas en el proceso de germinacin: Imbibicin o rehidratacin: cuando la semilla est seca los componentes fosfolipdicos de la membrana se encuentran en la fase gel, esto provoca una salida inicial mayor de solutos y de metabolitos de bajo peso molecular hacia la solucin que rodea la semilla. La rehidratacin es una difusin que sucede cuando las semillas absorben agua por sus propiedades coloidales. La etapa se distingue por un aumento de tamao en los granos. Adems la semilla libera calor. El volumen final del cuerpo hidratado es menor que la suma de los volmenes originales del agua y del grano. La semilla absorbe agua a distintas velocidades. La parte externa del grano (tegumento) tiene una velocidad de absorcin relativamente menor a la de otras partes. El tegumento distribuye el agua del medio externo al medio interno. La hidratacin del agua de una semilla es propia de cada especia, factores como el rea de contacto agua-semilla, fuerzas intermoleculares, composicin qumica y condicin fisiolgica; determinan la velocidad de hidratacin. La rehidratacin permite que las enzimas y estructuras de la semilla deshidratada se reactiven. En esta etapa se lleva a cabo el proceso glicoltico en el citoplasma. Las enzimas del ciclo de Krebs y oxidasas terminales estn activas, esto provoca un suministro de ATP para mantener el metabolismo en fase inicial. Activacin del metabolismo. En esta etapa no existe absorcin de agua y una actividad respiratoria ms reducida. En esta etapa se lleva a cabo el ciclo de las pentosas fosfato. Esta etapa es anablica y endergnica, consume la energa disponible. Los genes que codifican para el proceso de elongacin tienden a ser activados en forma temprana (algunos por las gliberinas), en relacin con la divisin celular. Emergencia de la radcula: en esta etapa se aprecia el surgimiento de la planta y finaliza el proceso de germinacin. La radcula atraviesa varias barreras internas

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de la semilla (testa y endosperma).

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2. Por qu no se determina directamente en la semilla la actividad de las amilasas? El almidn se encuentra localizado en la capa de aleurona y en el endosperma amilceo. La -amilasa se encuentra presente en la semilla deshidratada, en forma inactiva y unida a cuerpos proteicos. La liberacin eficiente de las amilasas en el endosperma amilceo requiere la degradacin de las paredes celulares de la capa de aleurona. La capa interna de la aleurona presenta alta resistencia a la degradacin; entonces se crea una estructura que mantiene la estabilidad mecnica de la capa mientras progresa el proceso de digestin celular. La alta resistencia a le degradacin de la capa interna provoca que las amilasas no acten directamente. 3. Qu funcin tiene el reactivo de yodo-yoduro de potasio? Explicar el fundamento. La estructura helicoidal de la amilosa sirve como base de una reaccin til. El interior de la hlice tiene el tamao y polaridad adecuados para aceptar una molcula de Yodo. Cuando el Yodo se aloja en el interior de la hlice, se forma un complejo de color azul intenso. Entonces la prueba del Yodo en Yoduro de potasio sirve para identificar a los oxidantes. 4. Qu tipo de enlaces hidrolizan las amilasas? La amilasa cataliza la reaccin de hidrlisis de los enlaces 1-4 del componente Amilosa para formar azcares simples.

5. Qu amilasas se encuentran en los vegetales? En los animales? En los animales se encuentra la -amilasa (saliva, jugo pancrtico). En los vegetales se encuentra la -amilasa (grmenes de las semillas) 6. Cules son las principales amilasas empleadas en la industria de alimentos? Especificar o dar ejemplos. La -amilasa se utiliza en el aumento de valor panificador de las harinas. Un adecuado y mantenido desprendimiento de anhdrido carbnico depende de la cantidad de maltosa y glucosa presentes en la masa. La -amilasa descompone el almidn a maltosa, si se agrega maltasa esta se degrada en glucosa. Con la aplicacin de Zimasa se obtiene CO2 y alcohol. Este proceso es utilizado en la industria de la cerveza.