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Western blotting

• Identifica gli antigeni verso cui reagisce un siero


• L’ identificazione avviene in base al peso
molecolare della proteina
• E’ un test molto sensibile e specifico
• E’ un test costoso e poco pratico da applicare
routinariamente
Principio del test
• L’ antigene (spesso una miscela di antigeni) viene
sottoposto ad elettroforesi su gel di poliacrilammide
• Il gel viene fissato e le diverse frazioni vengono
trasferite su matrice solida (membrana di
nitrocellulosa)
• Su tale membrana vengono saggiati i sieri (1 per ogni
striscia)
• Gli anticorpi specifici vengono visualizzati mediante
anti-IgG di specie marcate e substrato colorimetrico
1 fase: separazione elettroforetica

Polo -
L’ antigene
viene
denaturato in Stacking
presenza di
SDS ed agenti resolving
riducenti. Le
proteine
migrano verso
il polo + e si
separano in
base al peso
molecolare
Polo +
1 fase: separazione elettroforetica

Polo -

Marker di peso
molecolare

Polo +
1 fase: separazione elettroforetica

Polo -

Fronte di
corsa

Polo +
1 fase: separazione elettroforetica

Polo -
NB:
Le proteine
del campione
non sono
visibili in
questa fase

Fronte di
corsa

Polo +
2 fase: trasferimento su membrana
gel membrana

Tempone tris,glicina
metanolo

Polo - Polo +

Carta assorbente
3 fase: preparazione delle strisce di
nitrocellulosa

Si identifica la
parte superiore
della membrana
con un linea
colorata

La membrana viene bloccata per saturare i siti attivi


3 fase: preparazione delle strisce di
nitrocellulosa

1 2 3 4 5 6 7 8

La membrana viene tagliata in strisce verticali


Ogni striscia contiene tutto il pool di proteine separate
mediante elettroforesi
4 fase: immunostaining

a) Gli anticorpi presenti nel siero si legano ai rispettivi antigeni


Y Y Y segue lavaggio

b) Anti-IgG di specie marcati con enzima si legano agli anticorpi


Y Y Y
Y Y Y
segue lavaggio

c) L’ aggiunta di un substrato insolubile provoca la colorazione


delle bande proteiche rilevate dagli anticorpi Y
Y Y
Y Y Y
Interpretazione dei risultati

1 2 3 4 5 6 7 8
Variante a pozzetto unico

Polo -
L’ antigene
viene
denaturato in Stacking
presenza di
SDS ed agenti resolving
riducenti. Le
proteine
migrano verso
il polo + e si
separano in
base al peso
molecolare
Polo +
separazione elettroforetica

Polo -
NB:
Le proteine
del campione
non sono
visibili in
questa fase

Fronte di
corsa

Polo +
preparazione delle strisce di nitrocellulosa

Si identifica la
parte superiore
della membrana
con un linea
colorata

La membrana viene bloccata per saturare i siti attivi


preparazione delle strisce di nitrocellulosa

La membrana viene tagliata in strisce verticali


Ogni striscia contiene tutto il pool di proteine separate
mediante elettroforesi
Test rapido per la ricerca della PrPsc

La PrPc viene
Digestione con Proteinasi K degradata mentre
la PrPsc viene
solo parzialmente
catabolizzata

campione
separazione elettroforetica

M + + - Polo
- -- - - -
NB:
Le proteine
del campione
non sono
visibili in
questa fase

Fronte di
corsa

Polo +
Dopo trasferimento elettroforetico la membrana
viene bloccata ed incubata con un Ac
monoclonale marcato specifico per la PrP (sc o c)
Dopo sviluppo si identifica la PrP proteasi
resistente sotto forma di tre bande (glicoforme) di
peso molecolare caratteristico

+ + - - - - - - -