Purificao de Carboidratos

Profa Dra Marisa A. Nogueira Diaz

Disciplina: Bioqumica de Carboidratos

Anlise de Carboidratos
Polissacardeos Oligossacardeos

Hidrlise cida total, derivatizao e Cromatografia gasosa

Composio de monossacardeos
Metilao Posio das ligaes glicosdicas Hidrlise enzimtica com glicosidases especficas Sequncia de monossacardeos Posio das unidades monossacardicas RMN e espectrometria de massa

Confirmao dos dados de metilao

Posio e configurao das ligaes glicosdicas

Mtodos de Isolamento de Biomolculas

Mtodos baseados em caractersticas fsico-qumicas das biomolculas: 1. Tamanho Massa Densidade (ex: centrifugao, dilise, gel-filtrao)

2. Carga eltrica (ex: cromatografia de troca inica, eletroforese)

3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel, fase reversa) Mtodos baseados em afinidade biolgica, que exploram a interao entre duas molculas: 4. Cromatografia de afinidade (pressupe que uma das molculas do par que interage um reagente de fcil obteno, disponvel comercialmente)

Que caractersticas devem ter as resina cromatogrficas para possibilitar separaes de molculas baseadas em diferentes propriedades ?
Cromatografia de permeao em gel ou gel-filtrao: separao de molculas pela massa molecular gis so porosos, funcionando como peneiras ou filtros

Cromatografia de troca inica: separao de molculas pela carga eltrica gis apresentam grupos carregados positiva ou negativamente
Cromatografia de partio (fase reversa ou hidrofbica): separao de molculas pela solubilidade relativa em meio aquoso gis possuem carter hidrofbico Cromatografia de afinidade: separao de molculas pela capacidade de interagir com um ligante gis possuem ligante especfico ligado covalente resina

Purificao de Carboidratos
Oligo e polissacardeos podem ser purificados por mtodos cromatogrficos como: Excluso ou gel filtrao Troca inica HPLC Eletroforese

Eletroforese capilar

Funcionamento Bsico de uma Coluna Cromatogrfica

Uma coluna um tubo cilindrco aberto nas duas extremidades e preenchido com a resina ou matriz ou gel cromatogrfico. A coluna constantemente alimentada com lquido (tampo/solvente), banhando a resina e forando o contacto desta e as molculas que esto sendo analisadas.

Abaixo est representado o esquema geral de uma cromatografia:

Tempo zero
Amostra com diferentes componentes Resina embebida em solvente

Tempo 1

Tempo 2

Tempo n

Mais solvente colocado na coluna, forando os componentes da amostra a interagirem com a resina

Componentes da amostra se separam e saem da coluna com diferentes volumes de solvente

Lquido que sae da coluna recolhido em tubos de um coletor de fraes

Os componentes da mistura so separados por interao diferenciada com a resina, com base em propriedades moleculares como: massa molecular carga eltrica solubilidade afinidade

Coletor de fraes

Um cromatograma, como o grfico ao lado, a maneira usual de se representar o resultado de uma cromatografia.

Concentrao

Tempo ou volume

Amostra

Tampo poroso

Compostos separados

Cromatografia Centrnfuga (Chromatroton)

Chromatotron

uma cromatografia em camada delgada preparativa e acelerada centrifugamente. Substitui as CCD preparativas, pequenas colunas e HPLC. Com dimensies ~ 30 cm.

A amostra a ser separada aplicada como uma soluo no centro do disco giratrio umedecido com o solvente.

A eluio com solvente gera bandas circulares de separao dos componentes que so removidos juntamente com o solvente para um tubo de recepo.

Cromatografia de excluso ou gel filtrao

Cromatografia de gel filtrao ou peneira molecular

amostra grande

Molculas com massas diferentes

amostra pequena
Solvente empurra molculas atravs da resina

Fluxo do solvente

gro da resina poroso

tubos gros (beads) da resina com poros

Na gel-filtrao, os carboidratos que penetram nos poros da resina precisam diferentes volumes de solvente para sarem da coluna, conforme suas massas moleculares, percorrendo os canais internos dos gros. Quanto maior o nmero de gros que cada molcula entra durante o percurso atravs da coluna, maior o volume necessrio para sua sada. Compostos maiores que o dimetro dos poros no so separadas e saem da coluna com pouco solvente, correspondente apenas ao volume da coluna externo aos gros, tambm chamado de volume morto (Vo). Compostos menores que o dimetro dos poros no so separadas e saem da coluna com um volume de solvente correspondente ao volume interno (Vi, volume total menos o volume do prprio gel).

Cromatografia de troca inica

Cromatografia de troca inica

A resina para cromatografia de troca inica apresenta carga eltrica, positiva ou negativa, em uma ampla faixa de pH.

DEAE
Trocadora de nions

CM
Trocadora de ctions

Existem dois tipos bsicos: resinas trocadoras de nions (possuem carga positiva), como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de ctions (possuem carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose

Cromatografia de troca inica

---

O grfico mostra que essas resinas mantm suas cargas em uma ampla faixa de pH. Assim, o DEAE-celulose pode ser utilizado em pH abaixo de 10, enquanto que o CM-celulose utilizado em pH acima de 4, condies em que pelo menos 50% dos grupos dessas resinas esto carregados.

Como funciona a Cromatografia de Troca Inica A cromatografia de troca inica compreende duas etapas:
1) adsoro das amostras com carga contrria resina, e sada da coluna das amostras com a mesma carga; 2) eluio das amostras adsorvidas.

Para a eluio, as condies de adsoro da coluna (pH ou fora inica) so alteradas para neutralizar a interao entre as amostras e a resina.

No exemplo, como funciona uma resina catinica ou trocadora de nions, como o DEAE-celulose):

Adsoro
+ + +

+
+ + + +

+ +

+ +

+
+ +

+ +

+
+

Molculas com a mesma carga, ou sem carga, no interagem com a resina, sendo as primeiras a sair da coluna.

Na+Cl- +
+
+ + + +

Eluio

+
+ +

Na+Cl- +

Adio de sal ao tampo resulta em competio entre os ons em soluo e as molculas adsorvidas na resina.

Duas Modalidades de Cromatografia de Troca Inica

Eluio NaCl
+

Eluio NaCl
_
(+) 0. 10 M

0. 10 M
++

(-)
0. 15 M 0. 20 M

0. 15 M

CM
(-)

(-)

(-)

+ + +

DEAE
(+)

(+)
(+)

_ =

0. 20 M

_ = _ =

No retidas

+ + +

No retidas

Carboximetil~celulose (trocadora de ctions)

Dietilaminoetil~celulose (trocadora de nions)

HPLC

HPLC: high performance (pressure) liquid chromatography

Inicialmente desenvolvida para cromatografia de fase reversa em coluna, hoje em dia abrange aplicaes para todos os tipos de cromatografias. Caracterstica diferencial da cromatografia convencional: partculas de resina com dimetro muito pequeno (poucos microns) aumento da eficincia da separao em funo do nmero maior de gros de resina em um mesmo volume da coluna fase mvel - necessita bomba de alta presso para ter fluxo atravs da coluna
Desenho bsico de um HPLC

Detector Controle e anlise dos dados

Duas bombas gradiente

permitem

eluio

em

Detector: ndice de refrao, absorbncia UV ou Vis, fluorescncia, etc.

Coluna pode ser aquecida para melhorar a eluio diferencial na fase reversa
Coletor de fraes

bombas

Injetor de amostra

Coluna e forno

Automtico

Manual

Fase reversa: resinas de slica derivatizadas com hidrocarbonetos de 2 C a 18 C

Absorbncia a 214 nm

Molculas no retidas

Molculas retidas

100

Tempo ou volume de reteno

Cromatograma de uma coluna de fase reversa, com eluio por um gradiente de acetonitrila
Fase estacionria Funo

C18 C8 tC2 Aminopropyl Cyanopropyl Diol

CN Fenil

Si (CH3)2 C18 H37 Si (CH3)2 C8 H17 Si C2 H5 Si (CH2)3 NH2 Si (CH3)2 (CH2)3CN Si (CH2)3 OCH2CH(OH)CH2OH
NH2 C4 C8 C18

Condio de equilbrio: em meio cido (0.1% de cido trifluoroactico) para aumentar hidrofobicidade (protonar as carboxilas)
Eluio com gradiente crescente de solvente orgnico miscvel com gua - acetonitrila, metanol, propanol

Reteno na coluna: aumenta com o tamanho da cadeia

% de acetonitrila

Fases Estacionrias

Colunas

Tipos de Colunas
Analticas e semi-preparativas
Dimetros 4.6 X 250 mm Partculas de 5 10 20 Tamanho de poro 50 a 10^6 Fases: C5 C18 C8 CN SILICA PHENYL NH2 SCX Para processos analticos Preparativas Dimetros 15 21,2 30 50 mm Tamanho de 50 600 mm Partculas de 10 e 15 m Vrias fases disponveis Para processos de Purificao

Bombas

Quando se usa um s eluente

Isocrtica

Quando se usa mais de um eluente

Gradiente

Detectores

UV/VIS

Fluorescncia

ndice de Refrao

Eletroqumico

Condutividade

Cromatografia Lquida/Espectrmetro de Massas LC/MS

Cromatografia Lquida/Espectrmetro de Ressonncia LC/RMN

Chromatographic separation of oligosaccharides

HPLC RI chromatograms: (A) standard 100 mg/L, (B) sample B, (C) sample B spiked with tetraose (3 mg/L) and (D) sample B spiked with pentaose (3 mg/L).

Eletroforese Capilar

Envolve a aplicao de alta voltagem, tipicamente 5 a 30 kV em um capilar de dimetro reduzido gerando correntes na faixa de 10 a 100 mA.

As separaes em EC so baseadas na presena de um fluxo eletricamente induzido, denominado fluxo eletroosmtico (FEO), um fenmeno eletrofortico que gera o fluxo da soluo dentro do capilar, que faz com que os solutos se movimentem em direo ao detector. Este fluxo pode reduzir significativamente o tempo de anlise ou forar um on a reverter a sua tendncia de migrao em direo a um eletrodo, pelo qual est sendo atrado, devido ao sinal de sua carga.

Fluxo Eletroosmtico
A parede do capilar de slica contm grupos silanis (SiOH) os quais se ionizam (SiO- + H+) quando em contato com solues tampo com pH altos. Esta dissociao produz uma superfcie carregada negativamente. Uma camada de contraon (ctions) ento formada prxima parede do capilar a fim de manter a eletroneutralidade. Isto forma a dupla camada e cria uma diferena de potencial muito prxima parede e este fenmeno conhecido como potencial zeta.

Este movimento de ons resulta no movimento das espcies em direo ao detector e pode ser considerado como um fluxo eletricamente dirigido.

Gera o movimento das espcies apesar da carga para a mesma direo

Figura - Migrao dos ons metlicos em direo ao ctodo

Abaixo de pH 4, a ionizao dos grupos silanis pequena e o FEO no significante, enquanto que acima de pH 9 os silanis ficam completamente ionizados e portanto o FEO alto.

A dependncia do fluxo eletroosmtico em funo do pH

Saem mais rpido, so atridos pelo ctodo

Saem mais lento, so atridos pelo nodo

Exemplo de um eletroferograma

CLAE

EC

Figura - Perfil do fluxo eletroosmtico, comparado com o do fluxo pressurisado

EC, diferentemente das tcnicas cromatogrficas (Cromatografia GasosaCG e Cromatografia Lquida de Alta Eficincia-CLAE), a amostra no injetada e sim introduzida no capilar pelo lado mais distante do detector.

Esquemas para a introduo de amostras

Injeo eletrocintica
Insero do capilar e do eletrodo no frasco da amostra seguida da aplicao de uma voltagem, sendo que solutos neutros so arrastados pelo FEO, ao passo que solutos carregados iro migrar para dentro do capilar, por causa do FEO e tambm da migrao eletrofortica.

Volumes tpicos de injeo so de 10 a 100 nL. O modo de injeo mais empregado em EC o denominado hidrodinmico, onde o capilar mergulhado em um frasco contendo a amostra o qual em seguida pressurizado, submetido ao vcuo ou erguido (efeito sifo) provocando a entrada de um certo volume de amostra no capilar

Eletroforese Capilar em Soluo Livre (ECSL)

A separao de ons a forma mais simples de EC e denominada eletroforese capilar em soluo livre. A separao em ECSL
Baseia-se nas diferenas nas mobilidades eletroforticas resultantes das diferentes velocidades de migraes de espcies inicas no tampo, contido dentro do capilar.

Eletrocromatografia Capilar Micelar (ECCM)

A ECCM foi inicialmente desenvolvida para a resoluo de compostos neutros, os quais no podem ser separados usando simplesmente a ECSL.
A separao baseada na partio das molculas entre a fase micelar (pseudo-fase estacionria) e o tampo aquoso. As micelas de SDS tm carga negativa e migram contra o FEO.

Dodecil-sulfato de sdio

Detectores
O detector mais frequentemente utilizado em EC o espectrofotomtrico de absoro no UV/Vis devido sua natureza quase universal, ou seja, pode ser aplicado na deteco de vrias classes de substncias

Capillary electrophoresis has emerged as a highly promising technique for the analysis of mono- and oligosaccharides

Para carboidratos neutros necessrio fazer a ionizao dos grupos hidroxilas;

Complexao das hidroxilas vicinais ou das hidroxilas alternadas com grupos boratos;
Derivatisao com ionizveis. reagentes que possui grupos

Electropherograms of a standard solution containing sucrose, glucose and fructose with a concentration of 5.0 105 mol L1, under the optimal CZE-AD conditions: (a) sucrose; (b) glucose; (c) fructose.

Electropherograms of the honey (sample 1) being diluting 10,000 times under the optimal CZE-AD conditions: (a) sucrose; (b) glucose; (c) fructose.

Peak identification: 1, galactose; 2, glucose; 3, rhamnose; 4, mannose; 5, arabinose; 6, xylose. The peak of methanol indicates the electroosmotic flow (EOF). Separation conditions: +17 kV, detection at 270 nm with direct mode, injection pressure 0.5 psi for 6 s, capillary 50/60 cm (Ldet/Ltot), separation temperature 20 C. Electrolyte solution: 130 mM NaOH36 mM Na2HPO42H2O (pH 12.6).