Cintica de Reacciones Catalizadas por Enzimas

Las enzimas son biomoleculas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones qumicas en los sistemas biolgicos. Una enzima es una protena con una bien definida estructura primaria y secundaria. La estructura primaria est determinada por la secuencia de los aminocidos, en tanto que la estructura secundaria tiene que ver con el arreglo en el espacio, el cual depende en gran manera de los puentes de hidrgeno. stas biomolculas son estables y funcionan en condiciones muy suaves, ambiente acuoso, bajas temperaturas y en muchas ocasiones pH neutro.

La catlisis enzimtica es esencial para los organismos vivos, ya que hace posible que en condiciones fisiolgicas tengan lugar reacciones qumicas, las que en ausencia de catalizador requeriran condiciones extremas de presin, temperatura o pH. La actividad cataltica depende de la integridad de su conformacin proteica nativa. Si se desnaturaliza o disocia en subunidades pierde su actividad

En 1890s, Emil Fischer propuso un modelo de llave cerradura para explicar la especificidad de las enzimas.

Muchas enzimas poseen estereo-especificidad, catalizan reacciones de sustratos en una configuracin, pero no en otra.

Una enzima puede contener uno o ms sitios activos. El sitio activo consiste solamente de unos cuantos residuos de aminocidos y el resto de la protena se requiere para mantener su integridad tridimensional.

Carboxipeptidasa A en la hidrlisis de uniones peptdicas

Grafica de la velocidad de una reaccin catalizada por enzima vs. concentracin de sustrato

v0 =

a[ S ] b + [S ]

Mecanismo de las reacciones catalizadas por enzimas. Cintica de Michaelis-Menten

E = enzima S = sustrato, ES = complejo enzima sustrato

k1 k-1

E + S ES P + E

k2

Para derivar una expresin de velocidad. Michaelis and Menten inicialmente asumieron que el paso lento es la formacin de P a partir del complejo enzima-sustrato, ES. La formacin de ES, se considerada como un proceso de equilibrio rpido.

d [ P] v0 = = k 2 [ ES ] dt 0

Cintica de Michaelis-Menten
k1 k-1

E + S ES P + E
Cuando k-1 >> k2
d [ P] v0 = = k 2 [ ES ] dt 0

k2

La constante de disociacin

Ks =

k 1 [ E ][ S ] = k1 [ ES ]

A un tiempo corto despus del comienzo de la reaccin, la concentracin total de enzima [E]0 = [E] + [ES]
Ks

([ E ]0 [ ES ])[ S ] =
[ ES ]

[ ES ] =

[ E ]0 [ S ] K s + [S ]

Sustituyendo en la expresin de velocidad:

k 2 [ E ]0 [ S ] d [ P] v0 = = dt K s + [S ] 0

Cintica de Michaelis- Menten

k 2 [ E ]0 [ S ] d [ P] v0 = = dt K s + [S ] 0
Tiene la forma de la ecuacin de la hiprbola

a[ S ] v0 = b + [S ]
a = k2[E] 0 y b = Ks

A baja concentracin de sustrato, [S] << Ks

k2 d [ P] v0 = = [ E ]0 [ S ] dt 0 K s

La velocidad depende de la [S]

Esta ley de velocidad corresponde a la porcin lineal de la grfica de v0 vs. [S]

A alta concentracin de sustrato, [S] >> Ks

d [ P] v0 = = k 2 [ E ]0 = Vmax dt 0

Bajo estas condiciones, todas las molculas de enzima estn en la forma del complejo ES. Consecuentemente, la velocidad es de orden cero en [S]

Cintica de Michaelis-Menten
Cuando todas las molculas de enzima estn complejadas con el sustrato, formando ES, la velocidad alcanza su mximo
v0 = k 2 [ E ]0 = Vmax

Representa la transicin de baja a alta concentracin

Mecanismo de las reacciones catalizadas por enzimas. Cintica del estado estacionario.
E + S ES P + E
k-1 k1 k2

En 1925 Briggs y Haldane postularon que tan pronto como la enzima y el sustrato se mezclaban, la concentracin del complejo ES alcanzaba un valor constante, de tal manera que la aproximacin del estado estacionario poda aplicarse.
concentracin

tiempo

Cintica del estado estacionario

E + S ES P + E
k-1 k1 k2

d [ ES ] = k1[ E ][ S ] k 1[ ES ] k 2 [ ES ] = 0 dt
[E]0 = [E] + [ES] [E] = [E]0 - [ES]

[ ES ] =

k1[ E ]0 [ S ] k1[ S ] + k 1 + k 2

k1k 2 [ E ]0 [ S ] d [ P] v0 = = k [ ES ] = 2 dt k1[ S ] + k 1 + k 2 0
v0 = k 2 [ E ]0 [ S ] (k1 + k 2 ) / k1 + [ S ]

Cintica de Reacciones Catalizadas por Enzimas

E + S ES P
k-1 k1 k2

Estado estacionario:
v0 = k 2 [ E ]0 [ S ] (k1 + k 2 ) / k1 + [ S ] k 2 [ E ]0 [ S ] K M + [S ] KM = k 1 + k 2 k1
KM Ks

Equilibrio:
v0 = k 2 [ E ]0 [ S ] K s + [S ] k 1 Ks = k1

v0 =

Este tratamiento define la velocidad mxima exactamente como el modelo de Michaelis Menten, Vmax = k2[E]0
v0 = Vmax [ S ] K M + [S ]

Cintica de Reacciones Catalizadas por Enzimas

Cuando la velocidad inicial es la mitad del mximo de la velocidad
v0 = Vmax V [S ] = max 2 K M + [S ]

v0

[ S ] + K M = 2[ S ]
KM = [S]
[S]

Vmax y KM pueden determinarse a partir de la grfica de v0 vs [S]

Grfica Linewaver-Burk
Muchas veces resulta complicado localizar el valor de Vmax a altas concentraciones de sustrato. Lineweaver y Burk, propusieron un mtodo mas fcil que consiste en hacer una grfica de 1/v0 vs. 1/[S].

v0 =

Vmax [ S ] K M + [S ]

1 v0 m= 1 KM 1 Vmax KM Vmax

1 KM 1 = + v0 Vmax [ S ] Vmax

1 [S ]

Grfica Eadie-Hofstee
Eadie-Hofstee propusieron otro mtodo para graficar los datos cinticos, ste mtodo consiste en multiplicar ambos lados de la ecuacin del recproco por v0Vmax
1 KM 1 = + v0 Vmax [ S ] Vmax
Vmax

v0

Vmax

vK = 0 M + v0 [S ]

m = KM Vmax KM

Rearreglando:

v0 = Vmax

v0 K M [S ]

v0 [S ]

Significado de KM
KM Es un parmetro de afinidad con el sustrato. Mientras mayor sea KM la unin es ms dbil. Representa la concentracin de sustrato a la cual la mitad de los sitios activos de la enzima estn ocupados por molculas de sustrato. El valor de KM vara considerablemente de una enzima a otra. KM depende de la temperatura, la naturaleza del sustrato, pH, fuerza inica. Por lo tanto su valor sirve para caracterizar sistema enzima-sustrato en particular. Para la mayora de las enzimas, KM est entre 10-1 M y 10-7 M

Significado de Vmax y k2
Como su nombre lo indica, Vmax representa la mxima velocidad que puede alcanzarse. De acuerdo con la ecuacin, Vmax = k2[E]0, si se conoce la concentracin de enzima, se puede determinar tambin la constante k2. k2 es una constante de primer orden y tiene unidades de tiempo-1. En cintica enzimtica k2 se conoce tambin como nmero de recambio de la enzima constante cataltica, kcat. El nmero de recambio de una enzima se define como el nmero mximo de molculas (o moles) de sustrato que se converten a producto por unidad de tiempo. La mayora de las enzimas tienen nmeros de recambio entre 1 y 105 s-1 en condiciones fisiolgicas.

Anhdrasa Carbnica

CO2 + H2O

HCO3 + H+

A 25 oC la anhdrasa carbnica tiene uno de los nmeros de recambio mas altos que se conocen, k2 = 1106 s-1. Esto indica que una solucin 110-6 M de enzima puede catalizar la formacin de 1 M de HCO3 a partir de CO2 (producido por metabolismo) y H2O por segundo. Vmax = k2[E]0 Vmax = (1106 s-1)(110-6 M) = 1 M s-1 En ausencia de la enzima, la constante de pseudo-primer orden es 0.03 s-1

Ejercicio:
De Voe y Kistiakowsky (J. Am. Chem. Soc. 1961, 83, 274) estudiaron la cintica de hidratacin de CO2 catalizada por la enzima anhidrasa carbnica
Anhdrasa Carbnica

CO2 + H2O

HCO3 + H+

En esta reaccin, el CO2 se convierte en in bicarbonato. El bicarbonato es transportado por el flujo sanguneo y se vuelve a convertir en CO2 en los pulmones, sta reaccin tambin est catalizada por la anhidrasa carbonica. Cuando la concentracin de enzima es 2.3 nM y T = 0.5 oC se midieron las siguientes velocidades iniciales.
Velocidad (M s-1) 2.78 10-5 5.00 10-5 8.33 10-5 1.67 10-4 [CO2] / mM 1.25 2.5 5.0 20.0

Determina KM y k2 para la enzima a esta temperatura

Respuesta:
1 v0

1 KM 1 = + v0 Vmax [ S ] Vmax

1 Vmax

= 4000 M 1 s m= KM = 40 s Vmax

Vmax = 2.5 10-4 M s-1

K M = (40 s )Vmax = (40 s ) 2.5 10 4 M s 1 = 10 mM

1 [S ]

Vmax = k2[E]0

Vmax 2.5 10 4 M s 1 5 1 k2 = = = 1 . 1 10 s 9 [ E ]0 2.3 10 M

Inhibicin de las enzimas

La inhibicin de algunas enzimas por metabolitos especficos constituye un elemento importante en la regulacin del metabolismo intermediario. Los tres tipos principales de inhibicin reversible de las enzimas son: Competitiva. Acompetitiva No competitiva Los tres tipos de inhibicin se pueden distinguir experimentalmente por los efectos que produce el inhibidor en la cintica de reaccin.

Inhibicin Competitiva.
Tanto el sustrato, S, como el inhibidor, I, compiten por el mismo sitio activo. Un inhibidor competitivo reacciona reversiblemente con la enzima para formar un complejo enzima-inhibidor, EI, anlogo al complejo enzima sustrato.

Mecanismo: E + S ES P

k1

k2

+ I
KI

k-1

El complejo EI no forma productos

EI
ES E EI

Inhibicin Competitiva.
k1 k2 E + S ES P + k-1 I EI
KI

KI =

[ E ][ I ] [ EI ]

Aplicando la aproximacin del estado estacionario y considerando que la concentracin total de enzima est dada por: [E]0 = [E] + [EI] + [ES]

Vmax [ S ] v0 = [I ] KM 1 + K + [S ] I
[I ] Excepto que el trmino KM est modificado por: 1 + K I

sta ecuacin tiene la misma forma que la ec. de Michaelis-Menten v0 =

Vmax [ S ] K M + [S ]

Inhibicin Competitiva. Ecuacin de Linewaver-Burk

Vmax [ S ] v0 = [I ] KM 1 + K + [S ] I

1 KM = v0 Vmax

[I ] 1 1 1 + K [ S ] + V I max
m

[I]

1 v0
[I] = 0

intercepto =

1 KM

KI K + [I ] I

1 Vmax

1 [S ]

Inhibicin Competitiva. Ecuacin de Linewaver-Burk

K m= M Vmax

[I ] 1 + K I

KM KM [I ] + m= Vmax Vmax K I
-KI

KM m' = Vmax K I
KM Vmax
[I]

Inhibicin Competitiva.

E + S ES P + I EI

Debido a que la interaccin del inhibidor con la enzima es reversible: Una disminucin en la concentracin del inhibidor desplazar el equilibrio hacia la regeneracin de la enzima libre. Dado que tanto el inhibidor como el sustrato compiten por el mismo sitio de unin, un aumento en la concentracin de sustrato, provee una segunda manera de revertir la inhibicin competitiva. Mientras mayor sea la concentracin de sustrato mayor ser la cantidad de complejo ES.

Inhibicin No Competitiva.
Un inhibidor no competitivo no se une al sitio activo de la enzima.

ES E EI k1

ESI

ESI k2

Mecanismo:

E + S ES P k-1 + + I I
KI KI

EI y ESI no forman productos

EI + S ESI

Inhibicin No Competitiva.
E + S ES P k-1 + + I I
KI KI k1 k2

EI + S ESI
Aplicando la aproximacin del estado estacionario y considerando que la concentracin total de enzima est dada por: [E]0 = [E] + [EI] + [ES] + [ESI]

Vmax [S ] [I ] 1 + K I v0 = K M + [S ]

Inhibicin No Competitiva. Ecuacin de Linewaver-Burk

Vmax [S ] [I ] 1 + K I v0 = K M + [S ]
1 KM = v0 Vmax [I ] 1 1 1 + + K [S ] V I max [I ] 1 + K I

1 [I ] intercepto = 1+ Vmax K I

1 v0

[I] [I] = 0

1 KM

1 [S ]

Inhibicin No Competitiva.
Debido a que el sustrato y el inhibidor no compiten por el mismo sitio de unin, un incremento en la concentracin de sustrato no puede revertir la unin porque tambin se incrementara el nmero de complejos que contienen inhibidor (ESI). El efecto de un inhibidor no competitivo es reducir la concentracin de complejos ES que pueden dar lugar a producto. Puesto que Vmax = k2[E]0 y la concentracin de enzima total disminuye debido a la formacin de ESI, se espera que un inhibidor no competitivo disminuya la Vmax.

Inhibicin Acompetitiva.
Un inhibidor acompetitivo no se une a la enzima libre, sino al complejo enzima-sustrato, ES. La unin del sustrato modifica la estructura de la enzima, de tal manera que la unin del inhibidor es posible. La adicin de ms sustrato no revierte el efecto inhibitorio

ES k1

ESI k2

Mecanismo:

E + S ES P k-1 + I ESI
KI

ESI no forman producto

Inhibicin Acompetitiva.
E + S ES P k-1 + I ESI
Aplicando la aproximacin del estado estacionario y considerando que la concentracin total de enzima est dada por: [E]0 = [E] + [ES] + [ESI]
k1 k2

Vmax [S ] [I ] 1 + K I v0 = KM + [S ] [I ] 1 + K I

KI

Inhibicin Acompetitiva. Ecuacin de Linewaver-Burk

Vmax [S ] [I ] 1 + K I v0 = KM + [S ] [I ] 1 + K I

1 KM 1 1 = + v0 Vmax [ S ] Vmax

[I ] 1 + K I

1 [I ] intercepto = 1+ Vmax K I

1 v0

[I] [I] = 0

m=

KM Vmax

1 KM

1 [S ]

Sin inhibicin

1 KM 1 = + v0 Vmax [ S ] Vmax

Tipo de Inhibidor Inhibicin competitiva

1 KM = v0 Vmax [I ] 1 1 + + 1 K [S ] V I max

Efecto en la grfica Linewaver-Burk La pendiente incrementa cuando [I] y la ordenada se mantiene constante

Efecto cintico

Vmax no se modifica y KM incrementa con [I]

v0

Ambas, la pendiente y la ordenada incrementan 1 KM [I ] 1 1 [I ] = + 1 + 1 + cuando [I]

Vmax K I [ S ] Vmax KI

Inhibicin no competitiva

Vmax disminuye con [I] y KM no se modifica

Inhibicin acompetitiva
1 KM 1 1 = + v0 Vmax [ S ] Vmax [I ] 1 + K I

La pendiente se mantiene constante y la ordenada incrementa cuando [I]

Vmax y KM ambas disminuyen

Ejercicio:
Un qumico midi la velocidad inicial de una reaccin catalizada por enzima tanto en ausencia como en presencia de inhibidor A, en un experimento separado estudio el efecto del inhibidor B. En ambos casos la concentracin del inhibidor fue 8.0 mM
[S]/ M 5.0 10-4 1.0 10-3 2.5 10-3 5.0 10-3 1.0 10-2 vo / M s-1 No inhibidor 1.25 10-6 2.00 10-6 3.13 10-6 3.85 10-6 4.55 10-6 vo / M s-1 Inhibidor A 5.80 10-7 1.04 10-6 2.00 10-6 2.78 10-6 3.57 10-6 vo / M s-1 Inhibidor B 3.80 10-7 6.30 10-7 1.00 10-6 1.25 10-6 1.43 10-6

a) Determina los valores de KM y Vmax de la enzima. b) Para cada uno de los inhibidores ( A y B ), determina el tipo de inhibicin y calcula el valor de KI en cada caso.

Efecto del pH sobre la actividad enzimtica

La mayora de las enzimas tienen un pH caracterstico al cual su actividad es mxima; por encima o por debajo de ese pH la actividad disminuye. El pH ptimo de una enzima no es necesariamente idntico al pH de su entorno intracelular normal, el cual puede hallarse a su vez en la pendiente ascendente o descendente de la curva. Por eso la relacin pH-actividad de una enzima puede constituir un factor en el control intracelular de su actividad.

Efecto de la temperatura sobre las reacciones enzimticas

Al igual que sucede con la mayora de las reacciones qumicas, las reacciones enzimticas incrementan su velocidad con la temperatura. La velocidad de muchas reacciones enzimticas se duplica, aproximadamente por cada 10 C de aumento de la temperatura. El pico de la grfica al representar la actividad cataltica respecto a la temperatura se debe a que las enzimas, al ser protenas, se desnaturalizan por accin del calor y se inactivan a partir de cierto punto.

A partir de los 55-60 C la mayor parte de las enzimas se inactivan. Sin embargo, las enzimas de bacterias termoflicas siguen siendo activas a temperaturas superiores a los 85 C.