3.2 FUNDAMENTO DE LOS MTODOS CROMATOGRFICOS. 3.2.1 INSTRUMENTACIN BSICA. Cromatgrafo.

Equipo instrumental que se utiliza actualmente para realizar una separacin y cuantificacin mediante cromatografa de elucin en columna. Partes bsicas de un cromatgrafo. 1. La fase mvil o eluyente (lquido, gas o fluido supercrtico) que tiene como misin transportar a los componentes de la muestra a travs de la fase estacionaria. 2. El sistema de regulacin y medida del flujo o presin de la fase mvil. 3. El inyector o sistema de introduccin de la muestra en la corriente de la fase mvil. El proceso de introduccin de la muestra en el cromatgrafo comnmente se denomina inyeccin. 4. La columna cromatogrfica, tubo estrecho generalmente de metal o slice fundida, con dimetro interno y longitud variables, en cuyo interior se encuentra la fase estacionaria. Es, por tanto, en su interior donde los componentes de la muestra se separan. La columna puede unirse directamente al inyector y al detector (cromatografa de gases, GC) o bien estar conectada a otras partes del equipo mediante tubos conectores (cromatografa de lquidos de alta eficacia, HPLC). 5. Un sistema de termostatizacin que permite mantener la temperatura de la columna constante. 6. El detector, que es la parte del instrumento que mide de manera continua una propiedad fsica o qumica del fluido que sale de la columna (eluato) y la transforma en una seal elctrica. 7. Un sistema de amplificacin y tratamiento de la seal elctrica generada por el detector, de manera que se obtenga una seal que pueda ser entendida por el analista (por ejemplo, la aparicin del cromatograma en la pantalla del ordenador.

Fig. 1 Esquema de la instrumentacin bsica en un cromatgrafo.

3.2.2 TEORA CROMATOGRFICA. Elucin. Proceso mediante el cual la fase mvil pasa continuamente a travs de la fase estacionaria, en la cual se introduce la muestra en una cantidad conocida.

Fig. 2 Esquema del principio de Elucin.

Principio Cromatogrfico. Los diferentes componentes de la muestra, en funcin de las diferentes afinidades que presentan por ambas fases, se mueven a diferentes velocidades y eluyen, por tanto a diferentes tiempos. As los componentes con mayor afinidad por la fase estacionaria quedarn retenidos durante ms tiempo, por lo que tardarn en eluir ms que aquellos componentes que presentan menor afinidad por dicha fase. Esta diferencia de afinidad ocasiona que los componentes se separen en bandas diferenciadas que al pasar por el detector, den una seal que se registra en forma de bandas o picos. Cromatograma. La representacin grfica de la seal obtenida en funcin del tiempo (o volumen) de elucin.

Fig. 3. Ejemplo de Cromatograma

Como se puede observar en la figura 3, los picos cromatogrficos se pueden asemejar a curvas gaussianas o de distribucin normal. Esto es debido a que cuando las distintas molculas de un mismo analito se mueven por la columna, no todas se mueven con la misma velocidad, si no que se produce una dispersin simtrica de las velocidades alrededor de un valor medio, el cual representa el comportamiento ms frecuente de las molculas (mximo del pico). Adems la anchura de las bandas aumenta a medida que stas se mueven por la comuna, de manera que cuanto ms tiempo tarde en salir un analito de la columna mayor dispersin se producir en la velocidad de las molculas del analito y mayor ensanchamiento de la banda. 3.2.2.1 PARMETROS RELACIONADOS CON LA RETENCIN DEL ANALITO. Un cromatograma aporta una serie de parmetros importantes relacionados con la retencin del analito. Tiempo de retencin (tr). Es el tiempo que transcurre desde el momento en que el analito entra en el sistema cromatogrfico (inyeccin) hasta el momento en que el la mayora de las molculas de ese analito (que viene representado por el mximo de banda) alcanzan el detector.

tm

B A

Fig. 4. El tiempo de retencin del compuesto A es menor que el tiempo de retencin del compuesto B. Lo que indica que A tiene menor afinidad por la fase estacionaria que B.

Tiempo muerto (tm). Es el tiempo que tardan las molculas de la fase mvil en recorrer el sistema cromatogrfico y alcanzar el detector. Ya que la fase mvil no interacciona con la fase estacionaria, el tm se calcula experimentalmente como el tiempo que transcurre desde el momento en que un analito que no presenta afinidad por la fase estacionaria entra en el sistema cromatogrfico hasta el momento en que la mayora de las molculas de ese analito alcanzan el detector. En la figura 4 el tm se calcula a partir de que sale el compuesto C. Tiempo de retencin corregido (tr). Es la diferencia entre el tiempo de retencin, tr y el tiempo muerto tm, e indica el tiempo que el analito est retenido en la fase estacionaria. Un parmetro alternativo al tiempo de retencin sera: Volumen de retencin (Vr). Es el volumen de fase mvil necesario para transportar la mayora de las molculas de analito desde el inyector hasta el detector, se obtiene multiplicando el tr por el

volumen de fase mvil que pasa por la columna por unidad de tiempo (caudal o flujo volumtrico de la fase mvil, F, normalmente mL/min). Volumen muerto (Vm). El volumen de fase mvil que hay en el interior del sistema cromatogrfico. Volumen de retencin corregido (Vr). Es la diferencia entre Vm y Vr, volumen de fase mvil necesario para desplazar el analito de la fase estacionaria. Velocidad lineal media (u, cm/min). Cuando una banda cromatogrfica progresa a lo largo de una columna y la fase mvil circula por ella a una velocidad lineal media.

Velocidad lineal media de la banda cromatogrfica (v, cm/min). Es igual o inferior a la de la fase mvil.

Las velocidades se relacionan por: v=R*u Donde R es el factor de retardo cuyos valores estn comprendidos entre 0 (para las sustancias que se quedan retenidas en la columna de manera irreversible) y 1 (para las no retenidas).

En las ecuaciones anteriores L es la longitud de la columna, generalmente expresada en cm. En la columna debe existir un equilibrio de distribucin establecido por el analito, es decir. Analito fase mvil=Analito fase estacionaria En este equilibrio existe un coeficiente de distribucin o de reparto (K)

Donde Cs es la concentracin molar del analito en la fase estacionaria y Cm es la concentracin molar del analito en la fase mvil. De esta manera cuanto mayor sea el valor de K para un analito, mayor ser la concentracin en la fase estacionaria (mayor afinidad del analito por esa fase) con respecto a la fase mvil. Factor de retencin (k). Es un parmetro ms universal para expresar la retencin del analito.

Donde es la relacin de fases, el cociente entre el volumen de fase mvil (Vm) y fase estacionaria (Vs) que hay dentro de la columna. Este parmetro es til para comparar la retencin de los analitos en diferentes sistemas cromatogrficos, ya que es independiente de las caractersticas de la columna, flujo, etc. Y solo depende de la interaccin del analito en ambas fases.