REPUBLICA DE COLOMBIA UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD ESTUDIOS DE PREGRADO ASIGNATURA: BIOQUIMICA PROFESOR: MARTIN

NUEZ

DETERMINACION DE PROTEINAS

REALIZADO POR: Kendrys Aileth Ruiz Mayorga Eugenia Castilla Karen Gonzlez Jess Quintero

Valledupar-septiembre-09-2013

OBJETIVO

Determinacin parcial o total de protenas.

MATERIALES Y REACTIVOS Gradilla Trpode Malla Goteros Pipetas Probetas Tubos de ensayo Beacker Erlenmeyer Esptula Mechero Acido clorhdrico Acido ntrico Acido pcrico Acido tnico Acido fosfotusntico Acido actico Nitrato de plata Sulfato de cobre Cloruro de mercurio Nitroprusiato de sodio Hidrxido de sodio Hidrxido de amonio Cetona Reactivo de milln Reactivo de biuret Huevos

MARCO TEORICO Las protenas son compuestos a base de carbono, hidrgeno, oxgeno, nitrgeno y generalmente azufre y fsforo. El elemento caracterstico es el nitrgeno. Todas las enzimas, algunas hormonas y muchos componentes estructurales importantes de la clula son protenas. Las molculas de protena son muy grandes y contienen miles de tomos; su estructura es extremadamente compleja. Gran parte de las protenas intracelulares son enzimas, sustancias que regulan la rapidez con que se han de tener numerosas reacciones celulares. Las molculas de protena estn formadas por componentes ms simples llamados aminocidos. Puesto que cada protena puede tener cientos de aminocidos combinados en ciertas proporciones y orden es posible una variedad prcticamente infinita de molculas de protena. Se han ideado mtodos de anlisis para reconocer la disposicin exacta de aminocidos en una molcula protenica. La insulina, hormona secretada por el pncreas y utilizada en el tratamiento de la diabetes, fue la primera protena cuya estructura se conoci. La ribononucleasa, secretada por el pncreas, fue la primera enzima de la cual se conoci el orden exacto de aminocidos. Pueden distinguirse varios niveles de organizacin en la molcula de protena. El primer nivel es la llamada estructura primaria, que depende de la serie de aminocidos en la cadena de polipptidos. Esta serie, est determinada a su vez, por la serie de nucletidos de RNA y DNA del ncleo de la clula. Un segundo nivel de organizacin de las molculas protenicas supone la adopcin de la forma de hlice u otra configuracin regular por la cadena de polipptidos. Estas cadenas ordinariamente no se encuentran planas en una molcula de protena, sino que adoptan formas espiralazas para dar una estructura tridimensional. Una de las estructuras secundarias comunes de las molculas protenicas es el hlice en , que se supone una formacin espiralaza de la cadena de polipptidos bsica. La hlice en es una estructura geomtrica muy uniforme con 3.6 aminocidos que ocupan cada vuelta de la hlice. La estructura helicoidales determinada y mantenida por la formacin de enlaces de hidrgeno entre residuos de aminocidos en vueltas sucesivas de espiral. Un tercer nivel de estructura de molculas protenicas es el desdoblamiento de la cadena de pptidos sobre s misma para formar protenas globulares. De nuevo enlaces dbiles como enlaces de hidrgeno, inicos e hidrofbicos se forman entre una parte

de la cadena de pptidos y la otra parte, de modo que la cadena se desdobla de una manera especfica para dar una estructura general especfica de la molcula protenica. Enlaces covalentes como los de disulfuro (-S-S-) son importantes en la estructura terciaria de muchas protenas. La actividad biolgica de una protena depende en gran parte de la estructura primaria especfica que es mantenida junta por esos enlaces. Cuando una protena se calienta o trata con cualquiera de una variedad de productos qumicos, se pierde la estructura terciaria. Las cadenas de pptidos espiralazas se desdoblan para dar una configuracin aleatoria acompaada por una prdida de la actividad biolgica de la protena. Este cambio se llama desnaturalizacin. 20 aminocidos aminados que suelen encontrarse en las protenas poseen todos un grupo amino (-NH2) y un grupo carboxlico (COOH), pero sus cadenas laterales son distintas. El ms simple de todos, la glicina, tiene como cadena lateral un H; la alanina, un grupo CH3. El grupo amino permite al aminocido aminado actuar como base y combinarse con cidos; el grupo cido, le permite combinarse con las bases. Los aminocidos y las protenas sirven de amortiguadores y pueden resistir a cambios de acidez y alcalinidad. Los aminocidos se unen entre s para formar protenas mediante un enlace peptdico entre el grupo amino de una molcula y el grupo carboxilo de la otra. Los aminocidos puros obtenidos de las protenas tienen sabor dulce. Cuando se ingieren protenas son hidrolizadas a aminocidos antes de ser absorbidas a la corriente sangunea. Los aminocidos son llevados a todas las regiones del organismo, donde sirven para la elaboracin de nuevas protenas, o son metabolizados para liberar energa. Lasprotenas tienen importancia primordial como componentes es tructurales de las clulas y como constituyentes funcionales de enzimas y algunas hormonas, pero pueden servir tambin como combustible para produccin de energa. Los aminocidos pierden primero su grupo amino por una reaccin enzimtica llamada desaminacin. El grupo amino reacciona con otras sustancias para formar urea, que se excreta. El resto de la molcula puede transformarse por una serie de fases intermedias en glucosa, que se utiliza pronto como combustible, o almacenarse como glucgeno.

Las plantas pueden sintetizar todos los aminocidos a partir de sustancias simples. Los aminocidos que los animales no pueden sintetizar y que deben obtener en su alimentacin se llaman aminocidos esenciales. Debe comprenderse que estos aminocidos no son ms esenciales que otros; slo lo son respecto a la alimentacin, pues no es posible sintetizarlos.

PROCEDIMIENTO Experimento 1. Obtencin de albumina Se preparo una solucin de albumina de huevo, batiendo la clara de huevo por un tiempo aproximado de 5 minutos, mezclndolo con 5 veces su volumen en agua. Se realizo el proceso de filtracin. Experimento 2. Coagulacin En 5 tubos de ensayo se coloco porciones aproximadas de 2 ml de albumina y se calentaron Al tubo 1: 2 gotas de acido actico Al tubo 2: 2ml de etanol Al tubo 3: 1 ml de solucin concentrada de NaOH Al tubo 4: 1 ml de HCL concentrado Al tubo 5: 1m de HNO3 Se observo e indico cuales sufren el proceso de coagulacin. Experimento 3. Reaccin de Biuret A un tubo de ensayo se le agregaron 2 ml de albumina y 3 ml de reactivo de Biuret, se mezclo y se llevo a bao de Mara durante 10 minutos. Se dejo enfriar, se observo y anoto. Experimento 4. Reaccin Xantoproteica A un tubo de ensayo se le agrego 4 ml de solucin de albumina y 2 ml de acido ntrico concentrado, se observo. Se calent por 10 minutos, se enfri y agrego 4 ml de solucin de NaOH. Experimento 5. Reacciones de milln A un tubo de ensayo se agrego 3 ml de albumina, ms 5 gotas del reactivo de milln, se calent en un bao de agua hirviendo durante 10 minutos, luego se dejo enfriar a temperatura ambiente y se adicionaron 5 gotas de nitrito de sodio.

Experimento 6. Desnaturalizacin Acidos fuertes: se agrego a un tubo de ensayo 1 ml de albumina y 1 ml de acido tricloroacetico, se mezclo y observo. Iones metalicos pesados: se agrego a un tubo de ensayo solucin de albumina mas 5 gotas de solucin de nitrato de plata. Experimento 7. Precipitacin con reactivos de alcaloides Se prepararon 3 tubos de ensayo cada uno con 3 ml de albumina de huevo. Al primero se aadi gota a gota solucin de acido pcrico y se acidifico la solucin de protena con HCL. Al segundo tubo se le agrego acido tnico. Al tercer tubo se le agrego acido fosfotugsnico. Experimento 8. Cistena Se disolvieron unos cristales de cistena, se le adiciono 0.5 ml de solucin de nitroprusiato de sodio y 0.5 ml NH4OH.

CUESTIONARIO 1. Que es la desnaturalizacin de una protena y cul es la estructura responsable. Es un cambio estructural de las protenas o cidos nucleicos, donde pierden su estructura nativa, y de esta forma su ptimo funcionamiento y a veces tambin cambian sus propiedades fsico-qumicas. 2. Cules son los principales componentes de las distintas fracciones proteicas. Seroalbumina 3500 - 4500 sangre, transporte de cidos grasos. 1-Globulinas adrenocorticales. Regulacin del volumen de la

300 - 600 Transporte de lpidos, tiroxina, hormonas

2-Globulinas 400 - 900 Transporte de lpidos y cobre. - Globulinas 600 - 1100 Transporte de lpidos, Fierro y actividad de anticuerpos. Globulina 700 - 1500 La mayor parte de los anticuerpos. Fibringeno 3000 Precursor de los cogulos de la fibrina de la sangre. Protombina 100 Precursor de la trombina para la coagulacin.

La seroalbmina est formada por 585 aminocidos.

3. Cules son los principales mtodos de protenas totales? Los principales mtodos empleados para la determinacin de protenas totales son los siguientes: Mtodo de Biuret En solucin alcalina el Cu+2 reacciona con el enlace peptdico de las protenas dando un color purpreo que se cuantifica espectrofotomtricamente (540nm). Como estndar se utiliza una solucin de albmina. Protena + Cu+2 Complejo Cu-Protena (prpura) Muestra: suero o plasma (heparina o EDTA). Separar el suero del cogulo o el plasma de las clulas antes de 3h. Si el paciente est acostado durante la extraccin el resultado ser menor. Mtodo de Lowry Dependen de la concentracin de tirosina y triptfano de la muestra. Consiste en dos reacciones: 1. Reaccin de Biuret

2. Reaccin de Folin: caracterstica de los grupos OH reductores de los aminocidos tirosina y triptfano que, junto con los complejos Cu+2, reducen el reactivo de Folin generando un color azul. Est sujeto a muchas interferencias. Se utiliza fundamentalmente en orina. Turbidimetra Medicin de la turbidez resultante de la precipitacin de protenas Absorcin en el ultravioleta Se mide la absorbancia a 270nm originada fundamentalmente por los anillos aromticos de triptfano y tirosina. Mtodos de unin a colorantes NOTA: para semicuantificar la concentracin de protenas en orina se utilizan tiras reactivas.

4. Cul es la funcin y estado natural del glutatin. Es un antioxidante, evitando daos a importantes componentes celulares causados por especies de oxigeno reactivas tales como radicales libres y perxidos. Es el principal antioxidante endgeno producido por las clulas, participando directamente en la neutralizacin de los radicales libres y los compuestos de oxgeno reactivos, as como el mantenimiento de los antioxidantes exgenos tales como las vitaminas C y E en sus reducidos (activo) formas. Reglamento del xido ntrico ciclo, que es fundamental para la vida, pero puede ser problemtico si no se regula Se utiliza en las reacciones metablicas y bioqumicas tales como la sntesis y reparacin del ADN, la sntesis de protenas, sntesis de prostaglandinas, el transporte de aminocidos, y la activacin enzimtica. Por lo tanto, cada sistema en el cuerpo puede ser afectado por el estado del sistema del glutatin, especialmente el sistema inmunitario, el sistema nervioso, el sistema gastrointestinal y los pulmones. Tiene una funcin vital en el metabolismo del hierro. Las clulas de levadura empobrecido en, o contienen niveles txicos de hierro GSH muestran un intenso hambre-como respuesta y el deterioro de la actividad de las enzimas extra-mitocondrial ISC, seguida de muerte.

5. Que es cromatografa de intercambio inico, de exclusin molecular, de absorcin, de particin, de afinidad. Cromatografa de intercambio inico: La Fase Estacionaria es una resina de intercambio inico que contiene grupos cargados, teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones); la Fase Mvil es generalmente una solucin amortiguadora de pH. En protenas la cromatografa de intercambio inico se basa en las diferencias en signo y magnitud de la carga elctrica neta de las protenas a un valor de pH determinado. La afinidad de cada protena a los grupos cargados de la columna est influenciada por el pH y por la

concentracin de iones en solucin (concentracin salina) que compiten con la protena en la interaccin con la matriz. La separacin de la protena de la matriz cargada puede obtenerse gradualmente cambiando el pH y/o la concentracin salina de la fase mvil, de tal forma que se genere un gradiente de concentracin. Cromatografa de exclusin molecular:

Es til para la separacin de protenas. La Cromatografa de exclusin molecular, tambin llamada de filtracin en gel, separa en funcin de su tamao. La matriz de la columna esta formada por un polmero entrecruzado con poros de tamaos determinados. Las protenas de mayor tamao migran ms deprisa a lo largo de la columna que las de pequeo tamao, debido a que son demasiado grandes para introducirse en los poros de las bolas de polmero y por tanto siguen una ruta ms corta y directa a lo largo de la longitud de la columna. Las protenas de menor tamao, entran en los poros y su marcha a lo largo de la columna es ms lenta.

Cromatografa de afinidad:

La Cromatografa de Afinidad permite la separacin de mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unin a un determinado ligando. En este caso, las protenas que se retienen en la columna son aquellas que se unen especficamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente a la matriz de la columna. Despus de que las protenas que no se unen al ligando son lavadas o eluidas a travs de la columna, la protena de inters que ha quedado retenida en la columna se eluye o libera mediante el empleo de una solucin que contiene bien ligando libre u otro compuesto que rompa la interaccin entre el ligando y la protena.

Cromatografa de absorcin:

Por este mtodo la separacin se logra por absorcin selectiva de los constituyentes en la mezcla. La fase estacionaria puede ser almina o slice,

en tanto que la fase mvil generalmente es un lquido o bien un gas. El grado de separacin depende de la superficie activa del slido, por lo tanto, el tamao de la partcula que se emplea debe ser lo ms pequea posible para tener ms superficie activa sin llegar al extremo de tener un polvo tan fino que restrinja el paso de la fase mvil. El mtodo por absorcin se emplea sobre todo en la separacin de estructuras semejantes en especial ismeros poco diferentes, incluso se ha podido aplicar en la resolucin de mezclas racmicas empleando un absorbente con poder rotatorio como la sacarosa.

6.

Como se clasifican las protenas urinarias totales.

BIBLIOGRAFIA http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/000335.htm http://javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celul ar/electroforesis.html http://es.wikipedia.org/wiki/Isoelectroenfoque http://www.ehu.es/biomoleculas/buffers/buffer4.htm http://elcuadernodecalpurniatate.blogspot.com/2012/03/el-ph-de-lasangre-un-ejemplo-de.html http://es.answers.com/Q/La_importancia_del_ph_en_el_ser_humano http://www.todoexpertos.com/categorias/ciencias-eingenieria/quimica/respuestas/1276387/amortiguadores http://www.educ.ar/dinamico/UnidadHtml__get__9481e7b0-c851-11e08287-e7f760fda940/index.htm http://ciencia-basica-experimental.net/titulacion.htm http://es.scribd.com/doc/3040663/EQUILIBRIO-ACIDOBASE http://labquimica.wordpress.com/2008/04/30/titulacion-acido-base/