Quim. Nova, Vol. 31, No.

2, 317-320, 2008 TEOR DE FLUORETOS EM INFUSES DE CH VERDE (Camellia sinensis) Mrcia Reto, Maria Eduardo Figueira, Helder Mota Filipe e Cristina M. M. Almeida* Unidade Farmacologia e Farmacotoxicologia, Faculdade de Farmcia, Universidade de Lisboa, Av. das Foras Armadas, 1600-083 Lisboa, Portugal Recebido em 7/3/07; aceito em 19/7/07; publicado na web em 26/2/08

FLUORIDE CONTENT IN GREEN TEA INFUSIONS (CAMELLIA SINENSIS). The aim of this work was to study the influence of green tea consumption on fluoride ingestion. The extraction conditions of fluorides from green tea infusions were defined and nine brands of green tea available in Portugal were analyzed. The quantification of fluorides in the green tea was preceded by the implementation and validation of the potentiometric method (commercial fluoride selective electrode). The concentration of fluorides in the samples ranged from 0. 8 to 2. 0 mg L-1. Keywords: fluoride; green tea; infusion.

INTRODUO O ch tornou-se uma das bebidas mais populares no mundo devido no s ao seu sabor e aroma agradveis mas tambm aos efeitos benficos para a sade. uma bebida de composio qumica muito variada e embora os efeitos benficos estejam predominantemente associados ao seu teor em catequinas, o ch tambm rico em vrios minerais e oligoelementos essenciais para a sade, como por exemplo, os fluoretos. Vrios estudos tm sido efectuados com o objectivo de determinar o teor destes elementos nas infuses e nas folhas de ch verde1-6. Os fluoretos no so essenciais para o crescimento e o desenvolvimento humanos, encontrando-se no corpo humano em pequenas concentraes (2,6 mg num adulto) essencialmente nos dentes e ossos (99%)7. No entanto, so benficos na preveno da crie dentria quando ingeridos na concentrao de 0,05 mg/kg de massa corporal por dia. Os fluoretos fortalecem e favorecem a reparao (remineralizao) do esmalte e dentina, no s porque reduzem a solubilidade destes compostos em meio cido, mas tambm, porque reduzem a capacidade bacteriana de produzir cidos8. De acordo com os relatrios da Organizao Mundial de Sade (OMS) as cries dentrias constituem um importante problema de sade pblica nos pases mais desenvolvidos, onde afectam cerca de 60-90% das crianas em idade escolar e um nmero representativo da populao adulta. Para combater este problema, e uma vez que os fluoretos so reconhecidos como a medida mais eficaz na preveno da crie dentria, a OMS recomenda que este elemento seja adicionado gua, ao leite ou ao sal, de modo a permitir o acesso de toda a populao aos fluoretos, sem no entanto, alterar os seus hbitos alimentares9. A maioria dos alimentos apresenta um teor baixo em fluoretos (inferior a 0,05 mg/100 g). As principais fontes alimentares de fluoretos incluem o ch e os peixes marinhos, principalmente os que so consumidos com as espinhas (por exemplo, sardinhas). Deste modo, os alimentos contribuem geralmente apenas com 0,3-0,6% da dose diria ingerida de fluoretos7. A maioria das plantas que se desenvolvem em solos ricos em fluoretos no o absorvem uma vez que no solo estes so convertidos em sais insolveis de clcio, no entanto, a Camellia sinensis de*e-mail: calmeida@ff. ul. pt

senvolve-se em solos relativamente cidos e absorve os fluoretos do solo acumulando-os nas suas folhas10-12. A concentrao em fluoretos nas folhas velhas e maduras maior comparativamente ao de outras partes da planta10,12,13. Assim, a concentrao de fluoretos poder ser indicativo da maturidade da folha. Uma quantidade substancial deste elemento liberta-se durante a infuso, sendo, por isso, o ch considerado uma boa fonte de fluoretos14,15. O teor total de fluoretos nas folhas de ch verde varia entre 217-344 mg/kg, enquanto que a concentrao na infuso se encontra entre 0,73-3,46 mg L-1 14,16. Durante a infuso cerca de 25 a 84% do teor de fluoretos existente na folha libertado para o lquido14. Deste modo, o ch pode ser um modo efectivo de fornecimento de fluoretos na cavidade bucal17. Uma ingesto apropriada de fluoretos benfica (3-4 mg/dia para adultos), uma vez que previne as cries dentrias, contudo, um consumo excessivo pode ter efeitos adversos, como por exemplo, a fluorose8. A fluorose dentria um distrbio de formao dentria provocada pela ingesto prolongada de fluoretos, tendo como consequncia, uma opacidade do esmalte18. Em pases como China, Formosa e ndia, onde o ch a bebida de maior consumo e onde preparado com gua natural ou artificialmente fluorada, tm sido desenvolvidos estudos para determinar o consumo dirio de flor por parte das populaes, de modo a controlar os efeitos inerentes ingesto excessiva de fluoretos12,14,16,19. Nos pases ocidentais o consumo excessivo de fluoretos deve-se essencialmente ingesto acidental de pastas dentrficas, consumo de alimentos infantis e bebidas preparadas com guas fluoretadas e certas bebidas e alimentos com elevados teores de fluoretos8. O elctrodo seletivo do on fluoreto muitas vezes utilizado para quantificao de fluoretos em bebidas. Este elctrodo tem como membrana sensvel um cristal de fluoreto de lantneo. Quando este est em contacto com uma soluo padro ou amostra contendo ies fluoreto estabelece-se uma diferena de potencial atravs do cristal, a qual est relacionada com a respectiva concentrao do on fluoreto. A medio influenciada pela fora inica, pelo pH e por espcies catinicas polivalentes. Os fluoretos formam complexos com os caties polivalentes, como o clcio, magnsio, alumnio e ferro20. A taxa de formao destes complexos depende do pH da soluo, da concentrao de ies fluoreto e da presena de outros compostos complexantes. A formao de cido

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fluordrico (HF) em condies acdicas reduz a concentrao de ies fluoreto em soluo. A leitura a pH 5 7 evita esta interferncia. A presena de um agente complexante mais forte que o fluoreto, como cido trans 1,2-diaminociclo-hexano-N,N,N,N tetractico, um dos componentes da soluo tampo, complexa preferencialmente os caties interferentes e liberta os ies fluoreto em soluo. Deste modo, a determinao de fluoretos sempre efectuada aps uma diluio em partes iguais com uma soluo tampo e estabilizadora da fora inica20. De modo a avaliar a contribuio do ch para a ingesto diria deste elemento estudou-se o teor de fluoretos presente nas infuses de ch verde. A quantificao do teor de fluoretos no ch verde foi precedida pela implementao e validao do mtodo potenciomtrico (elctrodo seletivo comercial). PARTE EXPERIMENTAL Amostras Seleccionaram-se nove marcas de ch comercializadas em Portugal em funo de trs critrios: volume de vendas, preo (o mais caro e o mais barato), os que apresentam descritos a indicao teraputica (folheto informativo) e o mais representativo das grandes superfcies (hipermercados). Os vrios chs foram adquiridos em lojas de produtos naturais, hipermercados e farmcias da regio de Lisboa. As diferentes marcas esto representadas por siglas as quais permitem a identificao das amostras ao longo do trabalho. As amostras TN, TV, T, B, F e D so vendidas em saquetas e as amostras G, M e S so comercializadas em folha inteira. Todas as amostras foram analisadas em triplicado. Reagentes As solues padro de fluoretos foram preparadas a partir de fluoreto de sdio (Merck, Alemanha). A soluo tampo e estabilizadora da fora inica TISAB (Total Ionic Strength Adjustment Buffer) foi preparada de acordo com os requisitos do Standard Methods20 utilizando o cido trans 1,2-diaminociclohexano-N,N,N,N tetractico (CDTA), o hidrxido de sdio (Merck, Alemanha) e o cloreto de sdio (Panreac, Espanha). As infuses e reagentes foram preparados com gua do tipo Milli-Q (Mili Q System, Millipore). Equipamento e material O teor de fluoretos foi determinado utilizando um elctrodo seletivo de fluoretos (Mettler Toledo), um elctrodo de referncia Ag/AgCl (Mettler Toledo) e um potencimetro, (GLP 2, Crison). As amostras de ch foram preparadas em Erlenmeyers de rolha esmerilada com a capacidade de 300 mL e agitadas em placas de agitao (Cole Parmer). Preparao da amostra Todas as infuses de ch verde foram preparadas no prprio dia da anlise. Num erlenmeyer de 300 mL pesaram-se 1,50 0,05 g de ch (folhas ou o contedo de uma saqueta), adicionaram-se 250 mL (o equivalente a uma chvena de ch) de gua desmineralizada fervente (100 5 C) e tapou-se o erlenmeyer com uma rolha para diminuir as perdas de gua. Aps 10 min de infuso, filtrou-se a infuso para outro erlenmeyer. A relao massa de ch/volume de gua foi determinada com base na informao descrita para a preparao dos vrios tipos de ch. Todas as amostras foram preparadas de modo a simular a preparao efectuada em casa pelos consumidores.

Determinao de fluoretos O teor de fluoretos foi determinado potenciometricamente utilizando um elctrodo seletivo de fluoretos. As amostras de ch ou das solues padro foram colocadas sobre a placa de agitao (Cole Parmer) com agitador magntico, aps terem sido diludas (1:1) com soluo tampo TISAB (este tampo permite ajustar a fora inica e o pH do meio e eliminar a interferncia dos caties, principalmente o dos caties polivalentes). Depois de mergulhar os elctrodos, efectuouse a leitura do potencial (mV) das amostras ao fim de 3 min sob agitao (tempo necessrio para que o valor da leitura seja constante). A concentrao do on fluoreto nas amostras foi determinada a partir da curva de calibrao (mV vs logaritmo da concentrao). Otimizao do mtodo de ensaio e avaliao de desempenho O desempenho do mtodo pode ser avaliado atravs do estudo e conhecimento de prametros analticos caractersticos, tais como: intervalo de linearidade; preciso; exatido; limite de deteco; limite de quantificao; seletividade/especificidade. Para determinar o intervalo de linearidade foi construda uma curva de calibrao, processo pelo qual se relacionou a resposta do sistema (sinal instrumental) com solues de concentrao crescente em fluoretos. Com este objectivo, analisaram-se 14 solues de fluoretos com uma concentrao entre 0,06-10 mg L-1. Analisaram-se os resultados pelo clculo da linha de regresso pelo mtodo dos mnimos quadrados. Embora uma anlise inicial possa ser feita com base na inspeco visual do grfico (y = bx + a) e na determinao do valor de R2 (coeficiente de determinao), uma anlise completa requer os clculos do desvio padro residual (Sy/x), desvio padro do mtodo (Sm), desvio padro do declive (Sb), desvio padro da ordenada na origem (Sa) e do coeficiente de variao do mtodo (CVm)21. O desvio padro do mtodo o parmetro que permite ao analista verificar a qualidade do seu trabalho enquanto que o coeficiente de variao do mtodo permite comparar diferentes calibraes e diferentes mtodos21. Este primeiro teste de linearidade deve ser bem interpretado, pois os coeficientes de determinao so bons indicadores de correlao, mas no necessariamente de linearidade. Sendo assim necessrio determinar em paralelo o valor teste (PG), o qual comparado com o valor tabelado da distribuio F de Snedecor/Fisher (ISO 8466-1, teste de Fisher/Snedecor ou teste Mandel), de acordo com o nmero de graus de liberdade em causa21: a) se PG F: a funo de calibrao polinomial no conduz a um ajustamento significativamente melhor, e por isso, a funo de calibrao linear; b) se PG > F: a funo de calibrao no linear e por isso a gama de trabalho deve ser reduzida tanto quanto possvel de forma a cumprir a alternativa a). Caso no seja possvel, dever ser utilizada uma funo de calibrao no linear. Aps definir o intervalo de linearidade do mtodo determinaram-se os respectivos limiares analticos (limite de deteco e limite de quantificao). Em termos quantitativos, o conceito de limite de deteco corresponde concentrao mnima que possvel distinguir do branco, isto , de uma amostra que contm a mesma matriz mas no contm o analito. O limite de deteco (LD) pode ser calculado do seguinte modo21-23:

em que Sxo o desvio padro correspondente a vrias leituras do branco ou da soluo com concentrao mais baixa da gama de linearidade21.

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Como o mtodo analtico envolve uma calibrao linear, o limite de deteco tambm pode ser calculado atravs do desvio padro residual da curva de calibrao, atravs da seguinte Equao21-23:

em que: Sy/x o desvio padro residual da curva de calibrao; b o declive da mesma. O desvio padro residual da curva de calibrao determinado atravs da seguinte expresso:

a grandeza medida provm apenas do analito. Por isso, necessrio averiguar a possvel interferncia de outras substncias eventualmente presentes na amostra. Na prtica, este prametro pode ser avaliado pela realizao de testes de recuperao e pela anlise de padres puros ou quantidades conhecidas de possveis interferncias. A seletividade de um mtodo define-se como a capacidade de identificar e distinguir um analito em particular numa mistura complexa sem interferncia dos outros componentes. Assim, um mtodo analtico pode ser considerado especfico e seletivo quando se verificar que as taxas de recuperao so prximas de 100%22. Para avaliar a preciso dos resultados procedeu-se anlise de duplicados, tendo como critrio de aceitao uma da diferena de duplicados 10%, de acordo com a seguinte equao:

sendo: N nmero de padres de calibrao; yi sinal obtido para sinal estimado pela um padro de determinada concentrao; y i funo de calibrao linear para um padro da mesma concentrao. O limite de quantificao por sua vez, corresponde mais pequena concentrao medida a partir da qual possvel a quantificao do analito, com uma determinada exatido e preciso. Tal como descrito para o limite de deteco, como o mtodo analtico envolve a utilizao de uma calibrao linear, o limite de quantificao pode ser calculado atravs do desvio padro residual da curva de calibrao, de acordo com a equao seguinte21-23:

em que: X1 resultado obtido para uma dada amostra; X2 resultado obtido para o ensaio duplicado da mesma amostra. RESULTADOS E DISCUSSO A Figura 1 e a Tabela 1 apresentam os resultados referentes implementao e otimizao das condies de anlise.

em que: Sy/x o desvio padro residual da curva de calibrao; b o declive da mesma. Para avaliar o efeito de matriz, fortificaram-se amostras de ch com concentraes conhecidas de fluoretos e determinou-se a percentagem de recuperao (Rec, %), de acordo com a equao seguinte:

em que: CR concentrao do analito na amostra fortificada; VR volume de amostra do ensaio de recuperao (VA + VP); CA concentrao do analito na amostra no fortificada; VA volume de amostra utilizada no ensaio de recuperao; CP concentrao do padro de analito utilizado para fortificar a amostra; VP volume de padro de analito utilizado no ensaio de recuperao. Este ensaio permite-nos, avaliar de forma indirecta e na ausncia de materiais de referncia certificados, a exatido do mtodo em causa e a seletividade do prprio mtodo22. Diz-se que um mtodo especfico quando permite discriminar o analito relativamente a outras substncias, eventualmente presentes na amostra a analisar, ou seja, quando oferece garantias que

Figura 1 - Curva de calibrao dos fluoretos (mV vs log da concentrao) e respectiva equao da recta (y=bx+a). (Concentrao mg/L)

Como podemos observar (Figura 1) a funo de calibrao dos fluoretos apresenta uma boa correlao no intervalo entre -1,2 (0,06 mg L-1) e 1 (10 mg L-1). O mtodo linear, R2=0,9985 e PG<F (valor tabelado de Fisher/Snedecor)21. O limite de deteco (0,01 mg L-1) e o limite de quantificao (0,05 mg L-1) permitem a anlise de fluoretos no ch. Para avaliar o efeito da matriz adicionaram-se a 24 mL de cada uma das amostras G, B e TN e 1 mL da soluo padro de fluoretos

Tabela 1. Otimizao do mtodo potenciomtrico (elctrodo seletivo) para a anlise de fluoretos. Dados relativos curva de calibrao (mV vs logaritmo da concentrao) e limiares analticos Intervalo linearidade (mg L-1) 0,06-10
2

R2 0,9985

N 14

CV (%) 1,4

a 179

EP(a) 0,57

b -68,4

EP(b) 0,75

PG 1,8

F 4,8

LD LQ (mg L-1) 0,01 0,05

R = coeficiente de determinao; N = nmero de pontos da curva; CV = coeficiente de determinao do mtodo; EP(a) = erro padro da ordenada na origem; b = declive; EP(b) = erro padro do declive; PG = Valor teste; F = valor tabelado de Snedecor/Fisher (1; 11; 0,05); LD = limite de deteco; LQ = limite de quantificao

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com a concentrao de 10 mg/L. As interferncias de matriz esto dentro dos critrios de aceitao deste tipo de mtodo (80-120%)23, uma vez que as percentagens de recuperao dos fluoretos nas infuses variaram entre os 103 e os 110% (Tabela 2). Tabela 2. Recuperao dos fluoretos nas vrias infuses de ch verde Ch verde N=3 Rec (%) TV 108 TN 106 T 107 D F B M S G

lidade do ch no foi efectuada uma vez que para os chs estudados no existia qualquer referncia sua qualidade. CONCLUSES A dose diria tolervel de fluoretos de 10 mg. Sendo assim, seria necessrio consumir cerca de 4,8 a 12,5 L das infuses das amostras de ch verde analisadas neste trabalho, para ocorrerem casos de fluorose, isto sem contarmos com outras fontes de fluoretos. Uma vez que as infuses apresentam concentraes de fluoretos entre 0,8-2,0 mg L-1, o seu consumo pode contribuir para colmatar as necessidades dirias (3-4 mg) neste elemento, especialmente em pases como Portugal onde a gua da rede de abastecimento tem valores baixos de fluoretos. Por outro lado, nos pases onde a gua artificialmente ou naturalmente fluorada, a ingesto de fluoretos mais elevada e o consumo de ch pode contribuir para um consumo excessivo deste composto26. AGRADECIMENTOS A todos os colaboradores do Laboratrio de Hidrologia e Bromatologia da Faculdade de Farmcia de Lisboa, pela disponibilidade dispensada para a realizao deste trabalho. REFERNCIAS
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103 104

110 109 104 106

Os resultados obtidos so precisos, dado que a diferena entre duplicados foi sempre inferior a 10% (3,5-9,6%)23,24. Aps otimizao das condies de anlise procedeu-se quantificao dos fluoretos nas infuses, cujos resultados esto apresentados na Tabela 3. Tabela 3. Concentrao de fluoretos nas infuses de ch verde e respectivos desvios padro (DP) Ch verde (N=3) TV TN T D F F (mg L-1 DP) 1,4 1,1 1,3 1,2 1,0 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 Ch verde (N=3) B M S G F (mg L-1 DP) 1,1 0,1 0,90 0,1 0,80 0,1 2,1 0,2

Os valores de fluoretos variam entre 0,80-2,1 mg L-1, valores similares aos obtidos por Fung (1,65-1,83 mg L-1), Chan (0,34-1,43 mgL) e Wong (0,6-1,9 mg L-1)10,14,16. Estes autores tambm utilizaram o mtodo potenciomtrico com elctrodo seletivo de fluoretos. As diferenas observadas entre as amostras analisadas so estatisticamente significativas (p<0,001). No entanto e como a quantidade de substncias extradas durante a preparao da infuso depende, entre outros factores, da relao massa de amostra/volume de gua, temperatura, tempo e agitao, torna-se por vezes difcil comparar os resultados dos diversos estudos. As diferenas observadas entre os nossos valores e os descritos na literatura, podero dever-se a esses factores. De acordo com Gulati et al.15 a extraco de fluoretos menor nos chs preparados com folhas inteiras do que os preparados com a folha moda, como o caso das saquetas. Esta afirmao levaria a pensar que os teores de fluoretos seriam superiores nas amostras TN, TV, D, T, F e B, no entanto a amostra que possui um teor mais elevado a amostra G, preparada com folha inteira, mas de origem completamente distinta das restantes. Assim, o tipo de solo onde a planta se desenvolve e a idade da folha poder ter uma maior influncia no teor de fluoretos existentes na infuso de ch, do que o seu grau de moagem (folha inteira vs saquetas). Devido aos valores elevados de alumnio e fluoretos presentes nas folhas de ch, esto a ser realizados estudos sobre o efeito da adio de sais de clcio no solo na diminuio da absoro destes compostos pela planta, sem no entanto afectar o seu crescimento. O cloreto de clcio parece ser o sal mais indicado11,14. Lu et al.25 observaram que o teor de fluoretos aumenta medida que a qualidade do ch diminui. Estes autores sugerem que o teor deste elemento presente na folha seja utilizado como indicador de qualidade. Esta comparao do teor de fluoretos versus qua-