UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA ESCUELA DE POST GRADO

ESPECIALIDAD EN TECNOLOGA DE ALIMENTOS

INFORME DE PRCTICA:

Extraccin y Cuantificacin de Protenas ASIGNATURA: TECNOLOGIA DE LOS ALIMENTOS AVANZADA Mg. Sc. Ing. BEATRIZ HATTA SAKODA

PROFESORA:

EJECUTORES:

LAGUNA FLORES MARIA CHAVEZ FAVIAN VANESA COMETTANT CRUZADO NATALY HUACCHO HUAMAN CARMEN

La Molina, Juliio de 2010

EXTRACCIN Y CUANTIFICACIN DE PROTENAS I. INTRODUCCION Cada clula en el cuerpo humano contiene protena. La protena es una parte muy importante de la piel, los msculos, rganos y glndulas. La protena tambin se encuentra en todos los lquidos corporales por ello es importante su ingesta en altas concentraciones. Existen numerosas fuentes de protenas, tanto procedentes del reino vegetal como del reino animal. No obstante dichas protenas no se encuentran solas sino acompaadas de una serie de otras sustancias. Entre las sustancias acompaantes estn sustancias pero tambin se positivas tales como carbohidratos, fibra, grasa, vitaminas, etc.; encuentran sustancias indeseables tales como agentes anti nutricionales y eventualmente toxinas. Por otro lado, sustancias benficas como los carbohidratos devienen en indeseables en determinadas circunstancias. Por ejemplo en la formulacin de un alimento para diabticos se requiere que no haya carbohidratos particularmente los carbohidratos simples. Por las razones anteriormente sealadas, es muy deseable poder obtener aislados proteicos. Los aislados proteicos son alimentos muy ricos en protena procedentes de alimentos de los cuales se ha separado en la medida de lo posible todas las sustancias no proteicas que acompaan a la protena.

II. OBJETIVOS Obtener aislado proteico a partir de una fuente vegetal. Cuantificacin de protenas por el mtodo de Biuret.

III. REVISION BIBLIOGRAFICA. 3.1. Soya La soya, raiernbro de la familia LEGUMINOSAE subfamilia PAPILIONOIDEAE, ha sido conocida bajo varias denominaciones, asignandosele en 1948 el nombre botanico Glycine max (L.) Merrill hasta hoy vigente (Hinson y Hartwig, 1977). El contenido medio proteico de la soya, 18 a 44% mas grande que el del resto de las leguminosas, 20 a 30%, y aun mas que el de los cereales, 8 a 15% (Snyder y Kwom, 1987). La principal protena de soya es la glicinina tambin llamada casena vegetal por disolverse igualmente en fosfatos alcalinos, precipitando por accin de los cidos minerales. Pero, a diferencia de la casena lctea, no es una fosfoprotena sino una globulina y presenta un punto isoelctrico de 4,64 (Snyder y Kwon, 1987).

3.2. Quinua A continuacion se muestra la clasificacion taxonomica de la quinua. Cuadro 1 Clasificacion taxonomica de la quinua

Fuente: Giusti,1970. La harina de quinua South garden harina de quinua en el cuadro 2 se muestra su composicion. Cuadro 2 Composicion de harina de quinua. Harina de quinua 100gr Valor diario 384 19 Energia carbohidratos proteina Grasa total Fibra alimentaria 70 14 6 2 23 19 11 8

Fuente: Envase de la harina de quinua 3.3. Aislado proteico Segn niveles crecientes de pureza se distinguen harinas a contenidos de protenas menores a 70%, concentrados con 70 a 85% y aislados con porcentajes mayores a 85% (Linden y Lorient, 1996), esta distincin involucra diferencias de orden tecnolgico. En el caso de los aislados estos se pueden obtener por los - Lquido - lquido y fijacin en un soporte "activo" y despus elusin. En el siguiente cuadro se presenta la composicin qumica proximal de diferentes aislados proteicos de quinua atomizados en su forma elctrica as como el aislado proteico de soya empleado como patrn: Cuadro3: Composicin proximal de los diferentes aislados proteicos de quinua. Aislado proteico Quinua (pH=4.8) Quinua (pH=7) Quinua (pH=8) Soya Humedad (%) 3.6 3.36 3.6 3.53 Protena (% b.s.) 85.43 88.34 88.58 93.09 Grasa (% b.s.) 0.68 0.66 0.94 0.86 Fibra (% b.s.) 3.11 2.69 2.20 0.75 Ceniza (% b.s.) 3.04 3.40 4.29 3.56 Carbohidratos (% b.s.) 7.74 4.90 3.99 1.74

Fuente: Taboada, 1990 Belitz en 1997, menciona tambin acerca de los concentrados y aislados de soya, los que se muestran a continuacin: CUADRO 4: Concentracin de los concentrados y aislados de soya. Producto Proteinas Fibra bruta Cenizas 3.5 0.2 5.5 4

Concentrado 72% aislado 95.6%

Fuente: Belitz y Grosch, 1997 3.4. Fundamento Las protenas son sustancias zwitterinicas, vale decir hbridas entre sustancias moleculares y sustancias inicas. Esto se debe a que el hidrgeno unido al cido migra hacia el amino, dejando negativo al carboxilo y positivizando el amino, tal como se ve en la figura 1 (Cheftel et al., 1989).

Figura 1. Zwitterionizacin La estructura zwitterinica a su vez es anftera. Eso se debe a que puede reaccionar como cido y como base segn (Cheftel et al., 1989):

Figura 2. Anfoterismo de los aminocidos La consecuencia de esto es que hay un punto en el que ambas tendencias estn equilibradas. A ese punto se le conoce como punto isoelctrico y se caracteriza por tener un mnimo de solubilidad. Su valor depende de las fuerzas relativas y el nmero de grupos cidos y bsicos de la molcula. En este punto la solubilidad pasa por un mnimo, lo que se aprovecha para su precipitacin fraccionada. (Devor, 1977) En la figura 3 se presenta el punto isoelctrico de la protena se soya. Se puede tomar provecho de esto para lograr el aislamiento de una protena a partir de una mixtura natural compleja. Para ello es necesario someter al alimento a un proceso como el sealado en el diagrama de la figura 5 (Cheftel et al., 1989). Los productos de protena de soya que contienen un mnimo del 70 % de protenas se conocen como concentrados de protenas. Se preparan a partir de hojuelas o harinas desgrasadas, eliminado los azcares solubles en agua, las cenizas y otros constituyentes menores, incluyendo los compuestos que producen sabor a soya cruda,

a frjol o amargo. Los concentrados se obtienen por tres mtodos: extraccin con alcohol acuoso, por medio de calor y extraccin con acido diluido a un pH de 4,5, se neutraliza antes de secar. (Desrosier, 1986). Productos aislados, son las protenas ms refinadas que existen. Se preparan por eliminacin de todos los polisacridos insolubles en agua, as como de los azucares solubles en agua, y otros constituyentes menores. Se extraen con lcali diluido (pH 7-9) a 50-55 C. Despus de separar el residuo soluble por tamizado, filtracin y centrifugacin, el extracto se ajusta a un pH de 4 o 5 con acido grado alimenticio. Este cuajo de protenas se filtra o se centrifuga, de los productos solubles y se lava. (Desrosier, 1986)

Figura 3: Punto isoelctrico de la protena de soya (Cheftel et al., 1989)

Efecto de la temperatura

Solubilidad, g/L 100

0 0 100 Temperatura, C

Figura 4. Solubilidad de la protena en funcin de la temperatura

La solubilidad de las protenas aumenta con la temperatura desde 0 C a 40 C. Por encima, la mayora de ellas tiende a desnaturalizarse, lo que conlleva a una perdida de solubilidad. La desnaturalizacin trmica cambia la solubilidad de las protenas porque hay un incremento de los grupos hidrfobos en la superficie de la protena. En estado nativo estn orientados hacia el interior de las molculas, el desdoblamiento altera el balance entre protena-protena y protena disolvente (Desrosier, 1986). En la obtencin del aislado proteico se divide en tres etapas Estabilizacin.

Potencimetro. 4.1.4. Reactivos

Solucin de hidrxido de sodio 1 N Solucin de cido clorhdrico 1 N Reactivo de Biuret Reactivo blanco de Biuret Agua destilada

Se mezclo 50 g de harina de soya o quinua con 750ml de agua (1:15) y homogenizo.

Figura 5. Muestras utilizadas para la prctica.

Se ajusto lentamente el pH hasta 9 con hidrxido de sodio 1N, con agitacin continua durante 40 minutos. Se centrifugo a 3000 rpm durante 15 minutos. Y se separa el sobrenadante del residuo por filtracin. Se ajusto el pH del sobrenadante a 4,5 con cido clorhdrico 1 N, con agitacin continua por 15 minutos. Y se Centrifugo a 3000rpm durante 15 min. Posteriormente se separo el sobrenadante y el precipitado. Transferir el precipitado a una placa petri previamente pesada. Se coloco la placa en una estufa (Temperatura = 50 C tiempo = 24hr.; hasta peso constante). Se guarda el aislado proteico para los anlisis de protena correspondientes.

Figura 6: Obtencin de aislado proteico a partir de harina de soya /quinua

Harina de soya/quinua 50g. harina de soya + 750ml Agua destilada (1:15) Homogenizar Ajustar con NaOH-1N pH = 9 Agitacin x 40 min.

Agua destilada

Hidratacin

Agitacin Ajuste pH

Precipitado

Filtrado

3000rpm x 15 min. Filtrar

Sobrenadante

Agitacin Ajuste pH

Ajustar con HCl-1N pH = 4.5 Agitacin x 15 min.

Centrifugado

3000rpm x 15 min. Obtencin del precipitado

en una serie prueba de tubos y 5 ml del blanco de Biuret en una serie Blanco. Se pipeteo 100ul de extracto de protena de soya y quinua en cada tubo de la serie, tambin se preparo un blanco

de muestra, mediante la adicin de 100ul de agua a 5ml del reactivo de Biuret. Se fijo la absorbancia en cero a 540nm y se procedi a leer las absorbancias de la serie blanco, luego la del blanco de muestra y la serie prueba. Se calculo de la siguiente manera: o Restar tanto los blancos de reactivo y el blanco de muestra de las absorvancias (A) obtenidas para la serie prueba.

a. Calculo:

Donde: A = absorvancia [Estndar] = concentracin del estndar (g/L) [Muestra] = Concentracin de la muestra (g/L) Si el resultado excede los 120 g/L repetir el ensayo diluyendo el espcimen con un volumen igual de 0.15 mol/L de NaCl y multiplicar el resultado por 2.

Fotografas de la prctica

Figura 6 Se est llevando a pH 9 a la suspensin de soya agua

Figura 8 El aislado procedente de la centrifugacin.

Figura 9 El aislado ya seco. Ntese como el ligero tono cremoso del aislado ahora prevalece. Esto se debe a la Y DISCUSIONES V. RESULTADOSreaccin de Maillard.

Figura 10 Anlisis de biuret, se observa en los tubos como el blanco de biuret es transparente.

V.

RESULTADOS Y DISCUSIONES

Despues de la extraccion alcalina a pH 9 se obtuvo un extracto proteico; 590ml y 650ml para la soya y quinua respectivamente. Al realizar la determinacion de proteina por el metodo de Biuret se obtuvo las siguientes absorvancias que se detallan en el cuadro 5.calculando la absorbancia neta se calcula el contenido de proteinas con la ecuacion de la curva estandar de absorvancia VS concentracin de albumina bovina: Y (abs) = 0.0054 X (gr de albumina/Lt) - 0.0132 Cuadro 5. Resultados de las absorbancias del extracto proteico por el mtodo Biuret.

Absorbancias Muestras Soya Quinua Blanco reactivo 0.133 0.144 Prueba 0.279 0.164 Blanco muestra 0.144 0.021

Absorbancia Neta 0.002 -0.001

Cuadro 6. Determinacin del rendimiento terico de las proteinas en las muestras analizadas por el mtodo Biuret.

Extracto Concentracin de protenas Muestras proteico en el extracto (L) (gr /L)

Concentracion de proteina en el estracto (%)

Peso de protenas (gr)

Rendimiento tericode proteina respecto a la harina (%)

Soya Quinua

0.59 0.65

2.81 2.26

0.282 0.226

1.66 1.46

3.32 2.94

La concentrcion de proteina en el estracto proteico es 0.282% y 0.226% de soya y quinua respectivamente, estos valores eston por debajo de los valores de

concentrados proteicos considerados por Belitz (1997) deberia ser proximo a 72%; entoces se afirma que ninguno de los estractos proteicosobtenidos es un concentrado proteico. El rendimiento teorico es bajo deberia se mayor, para el caso de la soya Acha en 1997 menciona que la concentracion de proteina en la soya varia de 29 a 50% dependiendo de la calidad entoces en un estracto proteico de 50g de harina de soya se debe obtener 29g como minimo de proteina en la practica se ha obtenido solo 1.66g con lo que se afirma solo el 5% de proteina ha sido solubilizada en medio. Este valor es menor en compracion con la quinua. Lo mismo es para el caso de la harina de quinua que tiene 14% (detallado en el envase) de proteina entonces un extracto a partir de 50 gr de harina de quinua debio tener 7g de proteina pero solo se obtuvo 1.46g de proteina entonces podemos afirmar que solo se esta solubilizando 20.8% de protina en el medio alcalino a pH=9. Linden y lorent en 1996 mencionan que a pH mayor a 9 se favorece reacciones de racemizacion de aminoacidos , sintesis de enlaces peptidicos y la formacion de puentes covalentes. Se podria afirmar que tal vez al trabajar a pH 9 se rompieron los enlaces peptidicos y como el rectivo de Biuret reconoce los enlaces peptidicos ya no los pudo reconocer y por eso se obtuvo concentraciones tan bajas de proteina en los estractoss. En el cuadro 7 se muestra los rendimientos de extraccion de proteinas que se obtuvo. Cuadro 7. Determinacin del rendimiento de la extraccin de proteinas en las muestras analizadas. Muestras Soya Quinua Peso inicial harina(gr) 20 20 aislado (gr) 0.5233 0.23897 Rendimiento prctico (%) 2.62 1.19

Para 20g de harina se obtuvo 2.62% y 1.19% de proteina para la harina de soya y quinua respectivamente. Estos rendimientos son bajos comprados con 12% obtenido por Chavez en 1992, tambien es menor al rendimiento teorico que se obtiene que son 3.22 y 2.94 % para la soya y quinua respectivamente.

De la proteina solubilizada en pH alcalino se puede afirmar que solo el 78.9% (soya) y 40.4%(quinua) han precipitado en pH 4.5 esto considerano que el aislado proteico que se obtuvo realmente tiene concentraciones mayores al 90% de proteina. Fenema (2000) menciona que no todos los aminoacidos tienen su punto isoelctrico en pH 4.5 y esto podria influir en el rendimiento, pero tambien influiria mucho una inadecuada correccion del pH=4.5.

VI. CON 1.19% para la harina de soya y quinua respectivamente El rendimiento en general fue bajo para ambos harina pero tambien se nota que el rendimiento practico obtenido esta por debajo de los valores teoricos obtenidos posiblemente por una mala precipitacion de los aminoacidos presentes en el extracto proteico. Se determino el contenido de proteina en el extracto proteico en medio alcalino, se observo tambien que la solubilizacion de la proteina no fue buena estando en valores de 5% y 20% aproximadamente para la harina de soya y quinua respectivamente.

Pese a los resultados poco atrayentes, se ha logrado familiarizar a los estudiantes con la tecnologa del aislamiento de las protenas.

instrumentales. Se debe determinar el contenido de proteina que tiene el aislado proteico para poder observar la pureza y si realmente es un aislado.

del yogurt natural aflanado. Tesis para optar el ttulo de Ingeniero en Industrias Alimentarias pp. Desrosier, Norman 1983. Elementos de Tecnologa de Alimentos. Mxico, CECSA. 783 pp. Devore, G. 1977. Qumica Orgnica. Mxico, Publicaciones Cultural s.a. 734 pp. Belitz H.,Grosch W. 1997.quimica de los alimentos. Espaa. Editorial Acribia,S.A. 817pp. Giusti, K. 1970. El gnero Chenopodium en la argentina. I. Numero de cromosomas . Darwiniana 16:98 -105. Hinson, K. Harting .1997. Soybean production in the tropics .A FAO production and protection of paper. Food and Agriculture Organization of the United Nations Rome. Taboada, M. 1990. Evaluacin de las propiedades funcionales de un aislado proteico de germen de quinua desgrasado. Tesis para optar el ttulo de Ingeniero en Industrias Alimentarias Bioqumica agroindustrial y revalorizacin alimentaria de la produccin agrcola. Editorial Acribia Zaragoza Espaa.