Muerte celular programada o apoptosis: significado biolgico diagnstico durante el desarrollo embrionario

A!T"#$%&' Celestinos A., Marco, Dr. (M. V. Z). Snchez R., Alfonso, Dr. (M. V.; M.Sc.) Escuela de ()TA raduados. !acultad de Ciencias Veterinarias. "ni#ersidad Austral de Chile

TecnoVet, Ao 8 N2, agosto 2002

Celestinos A., Marco; Snchez R., Alfonso. Muerte celular $ro%ra&ada o a$o$tosis' si%nificado (iol)%ico * dia%n)stico durante el desarrollo e&(rionario. +EC,- VE+' A.o / ,01, a%osto 1221 htt$'33444.tecno#et.uchile.cl3CDA3tecno#et5articulo32,6728,SC9D:1;<D8=<7:1;1=9S9D:1;<D7>6,22.ht&l

Introduccin En los organismos superiores se reconocen dos formas de muerte celular: Necrosis y Apoptosis. La primera, tal vez la ms conocida, es el resultado de dao tisular grave (trauma, toxinas, u!micos" y afecta a grupos celulares, causando dilataci#n celular y ruptura de la mem$rana plasmtica, condiciones ue inducen una respuesta inflamatoria en las c%lulas sanas adyacentes. El mecanismo de la necrosis se gatilla sin intervenci#n activa de las c%lulas. &or otra parte, la muerte celular programada o apoptosis, tam$i%n llamada 'suicidio celular', afecta s#lo a c%lulas individuales o aisladas y no se asocia a inflamaci#n. La apoptosis (uega un rol determinante en la eliminaci#n de c%lulas daadas o peligrosas para el organismo (c%lulas infectadas con virus, c%lulas del sistema inmune, c%lulas con dao en el A)N, c%lulas cancer!genas" y tam$i%n es necesaria para un adecuado proceso de divisi#n celular (mitosis" en estructuras en desarrollo, ya ue al remover c%lulas no deseadas permite un adecuado $alance para la mantenci#n de un n*mero celular #ptimo. El o$(etivo del presente art!culo es entregar una visi#n $reve y actualizada a cerca de la muerte celular programada y su relaci#n con el desarrollo em$rionario, as! como de las t%cnicas para el diagn#stico de apoptosis empleadas en la producci#n de em$riones in vitro. Cambios celulares durante la apoptosis +no de los aspectos ms estudiados y conocidos respecto de la apoptosis, se refiere a los cam$ios morfol#gicos y $io u!micos ue ocurren en la c%lula (,igura -". Los primeros signos consisten en la separaci#n de las c%lulas preapopt#sicas de sus vecinas, con lo cual ad uieren una forma ms redondeada. En el n*cleo, inicialmente la cromatina (A)N . prote!nas" se agrupa o condensa en grandes masas, y luego el A)N se fragmenta de$ido a la acci#n de enzimas (endonucleasas".

Figura 1. )iagrama de los cam$ios morfol#gicos y $io u!micos ue ocurren durante la apoptosis. A nivel citoplasmtico se forman vacuolas y el citoplasma se fragmenta, manteni%ndose la mem$rana plasmtica intacta. Los fragmentos citoplasmticos se denominan cuerpos apopt#sicos y (uegan un papel importante en la estimulaci#n de la fagocitosis de estas c%lulas por parte de c%lulas vecinas y/o macr#fagos. En estos casos no existe respuesta inflamatoria ya ue la eliminaci#n de los fragmentos celulares se realiza sin ue 0aya li$eraci#n del contenido celular 0acia la matriz extracelular. Control de la apoptosis Los mecanismos de control de la apoptosis son comple(os e involucran una serie de seales, tanto end#genas como ex#genas, as! como un fino e uili$rio entre seales para ue la c%lula continue con vida o seales negativas para ue muera. Actualmente se admite ue existen una serie de elementos ue pueden ser comunes en la apoptosis y se 0an sealado como: induct#res, reguladores y efectores. Los inductores son a uellas seales ue inducen a la c%lula a entrar en apoptosis y pueden provenir desde dentro de la c%lula o desde el exterior. Algunos inductores poseen la capacidad de unirse a receptores en la mem$rana celular (prote!nas o p%ptidos" y otros se unen a receptores en el citoplasma (esteroides". ,actores externos como radiaci#n ultravioleta o sustancias u!micas pueden actuar como potentes inductores de apoptosis. )entro de los reguladores existen genes ue codifican para prote!nas ue pueden in0i$ir o promover la muerte celular. Los genes de la familia 1cl23 son los ue estn me(or estudiados. Estos genes codifican para prote!nas ue pueden in0i$ir o permitir la apoptosis. La proporci#n en ue se expresan unas prote!nas respecto de otras puede determinar ue la c%lula muera o no. Los efectores son los responsa$les, en *ltima instancia, de los cam$ios estructurales ue conducen a la muerte celular programada. Estos cam$ios son $astante parecidos en los distintos tipos de c%lulas. Los efectores son principalmente enzimas (endonucleasas y proteasas". 4e cree ue la activaci#n de endonucleasas dependientes de calcio y magnesio, son las responsa$les de la fragmentaci#n del A)N y de los cam$ios ue

ocurren en el n*cleo de la c%lula. Entre las proteasas ms estudiadas se encuentran las caspasas, ue son consideradas como las mol%culas efectores ms importantes de la apoptosis. 5a$e destacar ue las caspasas estn inactivas en las c%lulas sanas. En muc0os casos la activaci#n de un tipo de caspasa produce la activaci#n de otras, generando una 'cascada irreversi$le de caspasas' ue amplifican nota$lemente la seal. Apoptosis durante el desarrollo embrionario La formaci#n de un em$ri#n mam!fero compati$le con la vida, desde el estado unicelular (cigoto fertilizado" 0asta estructura multicelular diferenciada, re uiere la generaci#n de una po$laci#n celular, lo ue involucra procesos de divisi#n, diferenciaci#n y muerte celular, todos regulados por factores de crecimiento (p%ptidos". La apoptosis (uega un papel importante en los organismos, manteniendo un control so$re el n*mero de c%lulas de los te(idos, tanto durante el desarrollo em$rionario como en algunos sistemas del adulto. )e esta forma se pueden eliminar c%lulas ue tienen funciones transitorias durante determinadas etapas del desarrollo. Algunos e(emplos nota$les de muerte celular programada durante el desarrollo em$rionario se pueden ver en el 5uadro -. CUADRO 1 Ejemplos de la muerte celular programada durante el desarrollo embrionario en vertebrados

,ormaci#n de la cavidad proamni#tica 5ierre del tu$o neural )esarrollo del o(o )esarrollo del o!do 5ierre del paladar )esarrollo cardiovascular )esarrollo de miem$os 6egresi#n de tu$ulos pron%fricos renales 6egresi#n de los conductos de 78ller en el mac0o 6egresi#n de los conductos de 9ollf en la 0em$ra 5omo 0a sido sealado, la muerte celular en el em$ri#n ocurre por apoptosis y sirve para eliminar c%lulas no deseadas durante el desarrollo. La mayor cantidad de c%lulas apoptosicas se presentan en el macizo celular interno (75:" del $lastocisto en las diferentes especies. Adems, durante el desarrollo del em$ri#n la apoptosis

(uega un papel crucial en la formaci#n de la cavidad amni#tica. Diagnstico de apoptosis en embriones mam !eros En los ultimos aos la reproducci#n 0a evolucionado aceleradamente, caracterizndose por el desarrollo de una serie de t%cnicas ue contri$uyen a aumentar en forma rpida la capacidad reproductiva y el me(oramiento gen%tico. 4iendo una de ellas la producci#n de em$riones in vitro. Esta t%cnica 0ace posi$le ue #vulos no fecundados puedan ser madurados, fertilizados y desarrollados $a(o condiciones de la$oratorio. &or este medio se producen grandes cantidades de em$riones para programas de transferencia em$rionaria. Los em$riones mam!feros se caracterizan por la gran varia$ilidad morfol#gica y diferente potencial de desarrollo, lo ue podr!a verse refle(ado en porcenta(es varia$les de implantaci#n y de preez. 4e 0a o$servado ue despu%s de la fertilizaci#n in vitro, un significativo n*mero de em$riones presentan retraso del desarrollo. Em$riones normales y em$riones con atraso del desarrollo contienen diferente porcenta(e de c%lulas con signos de apoptosis, aun ue la presencia de estas tam$i%n se presentan in vivo, lo ue confirmar!a la presencia de apoptosis en el desarrollo normal. La incidencia de la muerte celular aparentemente esta correlacionada con la calidad em$rionaria. &or e(emplo del total de c%lulas en un $lastocisto de $uena calidad morfol#gica, el porcenta(e de c%lulas muertas es menos de -;< y en uno de mala calidad es de =;< aproximadamente. )esde mediados de la d%cada de los setenta se 0an 0ec0o descripciones estructurales de c%lulas muertas en em$riones preimplantados de diferentes especies incluyendo rat#n, vaca, mono y 0umano. Estas descripciones se 0an $asado en tinciones celulares ue usan marcadores fluorescentes espec!ficos y se caracterizan por teir la mem$rana nuclear, la cromatina condensada, vacuolas citoplasmticas, n*cleos y citoplasmas fragmentados. Cambios en la membrana En el em$ri#n, la integridad de la mem$rana celular se mantiene 0asta las *ltimas fases de la apoptosis, sin em$argo, tempranamente durante este proceso ocurre aislamiento de las c%lulas apopt#sicas de sus vecinas y redistri$uci#n de fosfol!pidos en la mem$rana celular. En las c%lulas sanas los fosfol!pidos (fosfatidilserina" estn distri$uidos asim%tricamente y confinados en la capa interna de la mem$rana plasmtica. En las c%lulas apopt#sicas, la fosfatidilserina se transloca a la capa externa de la mem$rana donde la prote!na anticoagulante Annexin > se puede fi(ar por su alta afinidad. Al teir estas c%lulas presentan fluorescencia y tam$i%n se puede determinar mediante citometria de flu(o. "acuolas citoplasm#ticas En las c%lulas apopt#sicas se presentan vacuolas transl*cidas, frecuentemente asociadas con condensaci#n citoplasmtica. Estas vacuolas pueden ser o$servadas con microscop!a electr#nica o con microscop!a #ptica. Condensacin de cromatina +no de los primeros cam$ios morfol#gicos indicativos de la apoptosis es la condensaci#n de cromatina dentro de la mem$rana nuclear. Este proceso 0a sido detectado en em$riones marcando el A)N con un polinucle#tido espec!fico fluorocromado como es el propidio iodado (&:" o el ?,@ diamino23fenilanido ()A&:". &or lo tanto em$riones con cromatina condensada teidos con &: o )A&: pueden ser o$servados usando microscop!a de fluorescencia. Fragmentacin nuclear En em$riones con retraso de crecimiento se pueden o$servar n*cleos condensados o fragmentados con el mismo procedimiento de marcaci#n de A)N, aun ue tam$i%n se 0a encontrado ue em$riones sanos,

presentan AB< de n*cleos fragmentados. Fragmentacin de AD$ Ctra caracter!stica de apoptosis es la degradaci#n del A)N en fragmentos, teniendo un pe ueo n*mero de c%lulas en el em$ri#n es imposi$le usar t%cnicas electrofor%ticas para o$servar el A)N fragmentado. El desarrollo de la t%cnica de D+NEL (d+D&2final DdD2mediada" posi$ilita evaluar la fragmentaci#n nuclear in situ. Esta t%cnica se $asa en la incorporaci#n de un oligonucleotido marcado con fluorescencia, permitiendo la localizaci#n y cuantificaci#n de n*cleos fragmentados. Fragmentacin citoplasm#tica % !ormacin de cuerpos apoptsicos 4e 0an evidenciado grados diversos de fragmentaci#n citoplasmtica en em$riones con retraso del desarrollo. La revisi#n de la estructura de em$riones muestra cuerpos apopt#sicos. La tinci#n de D+NEL y el uso de la microscop!a fluorescente es una 0erramienta *til en la determinaci#n de este tipo de fragmentaci#n. Fagocitosis La degeneraci#n celular resulta en la formaci#n de restos extracelulares y la presencia de mitocondrias y remanentes nucleares ue confirman el origen celular. 5on microscop!a focal se pueden o$servar $last#meros fagocitados por c%lulas adyacentes y vacuolas autofgicas a nivel estructural con microscop!a electr#nica. Algunos !actores asociados con apoptosis en embriones producidos in vitro +na de las funciones de la apoptosis durante el desarrollo es eliminar c%lulas ue no sern re ueridas. 5%lulas del 75: del $lastocisto temprano pueden regenerarse en c%lulas del trofoectodermo, aun ue estas mismas del $lastocisto tard!o no lo pueden realizar. La muerte celular es el mecanismo por el cual el $lastocisto elimina c%lulas del 75: ue a*n tienen el potencial para formar trofoectodermo, esto podr!a reducir el riesgo de una inapropiada expresi#n ectopica del trofoectodermo durante la diferenciaci#n de la capa germinal. Anormalidades cromosmicas % nucleares Los em$riones mam!feros presentan una alta incidencia de anormalidades nucleares y cromos#micas, adems, un gran porcenta(e de em$riones presentan c%lulas diploides mientras ue otras tienen un complemento cromos#mico anormal. Es posi$le ue por medio del proceso de apoptosis se eliminen estas c%lulas anormales. Escase& de !actores de crecimiento La falta de factores del crecimiento puede ser un factor en el inicio de la apoptosis. En el em$ri#n los factores de crecimiento maternos y em$rionarios (uegan un papel clave en el desarrollo. Esto se 0a o$servado en em$riones cultivados en medios suplementados con factores del crecimiento (DE,2a y :E,2:", mostrando una me(ora en el desarrollo. Esto nos 0ace pensar ue dic0a suplementaci#n incrementa el n*mero celular y disminuye el n*mero de c%lulas apopt#sicas en el em$ri#n. Cultivo subptimo La muerte celular em$rionaria no es exclusiva de em$riones producidos in vitro. 4e 0a encontrado ue ms del B;< de los em$riones normales, ue 0an sido removidos del tracto reproductor presentan uno o ms n*cleos fragmentados, variando entre -2=< en c%lulas del trofoectodermo y de -;23;< en el 75:.

'anipulacin 5ual uier em$ri#n sometido a manipulaci#n, $isecci#n, $iopsia, transferencia nuclear, inyecci#n intracitoplasmtica o cual uier otro mane(o como transferencia, cultivo, refrigeraci#n y congelaci#n 0a sufrido dao f!sico y muerte en algunas de sus c%lulas. Comentario !inal La muerte celular programada o apoptosis resulta ser un fen#meno fisiol#gico fundamental durante el desarrollo em$rionario, ya ue permite un adecuado $alance del n*mero celular del organismo en crecimiento, as! como la regresi#n de estructuras ue 0an perdido funci#n o ue no son necesarias. El estudio de la apoptosis durante el desarrollo temprano de em$riones producidos in vitro resulta una 0erramienta de gran proyecci#n para evaluar la via$ilidad de em$riones potencialmente transferi$les. (ibliogra! a

7:6FE4, &. 3;;3. 3;;- 9arGany Lecture: Do die or no to die, t0e role of apoptosis in normal and a$normal mammalian development. Deratology @H: 33B23=-. IA6)J, F. -KKK. Apoptosis in t0e 0uman em$ryo. 6evieLs of 6eproduction ?: -3?2-=?. 7AD9EE, 5., ). 1EDD4, 9. F:NE. 3;;;. Apoptosis in t0e early $ovine em$ryo. Migote, B (-": HA2 @B.

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