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1. TEMA: EXTRACCIN Y ANLISIS DE PIGMENTOS ALIMENTARIOS NATURALES 2. OBJETIVOS: 2.1. GENERAL: Realizar La Extraccin Y Anlisis De Pigmentos Alimentarios Vegetales. 2.2. ESPECFICO: Extraer y analizar la clorofila de la acelga (Beta vulgaris var. Cicla) mediante cromatografa circular y cromatografa ascendente en tira de papel. 3. MARCO TERICO: PIGMENTOS ALIMENTARIOS NATURALES Son sustancias naturales que brindan los colores que poseen los alimentos. Es un material que viene incorporado en la textura misma, que refleja la luz de diferentes formas, generando a nuestra vista, distintos colores y tonalidades. Los pigmentos adems de existir en forma natural, pueden tambin sintetizarse y obtenerse qumicamente, para ser aplicados en la industria tanto en alimentacin, como en pinturas, barnices, cosmticos, ropa, etc. En la alimentacin natural, orgnica y macrobitica, puede verse extraccin de pigmentos de forma artesanal, con fines medicinales o simplemente como colorante natural para alimentacin y bebidas. Existen estudios que exponen las posibilidades teraputicas de estos componentes vegetales, que en su mayora aportan una cantidad de antioxidante al organismo. CLOROFILA El color verde tan uniformemente presente en los vegetales es debido a la presencia de dos pigmentos estrechamente emparentados llamados clorofila a y clorofila b. Se encuentran prcticamente en todas las plantas con semilla, helechos, musgos y algas. Pueden formarse en las races, tallos, hojas y frutos a condicin de que estos rganos estn situados por encima del suelo y queden expuestos a la luz. Determinar antocianinas en la frutilla (Fragaria vesca). Conocer el efecto de la coccin sobre los pigmentos vegetales de la zanahoria (Daucus carota). Realizar la extraccin y anlisis de betaninas presentes en la remolacha (Beta vulgaris). Extraer y analizar carotenoides a partir del achiote (Bixa orellana).

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Tambin aunque aparentemente falten en algunas hojas de color rojo o amarillo, cuando se extraen las otras sustancias colorantes de estas, puede comprobarse incluso all la presencia de las clorofilas, que estaban enmascaradas por los dems pigmentos. Las clorofilas se encuentran en las membranas de los tilacoides, que en las cianobacterias son invaginaciones de la membrana plasmtica, y en los plastos de las clulas eucariticas que son vesculas distribuidas por su interior. Las clorofilas aparecen insertas en la membrana, a las que se anclan por la cadena lateral constituida por un resto de fitol, asociadas a protenas y otros pigmentos, con los que forman los fotosistemas. ANTOCIANINAS Son pigmentos hidrosolubles que se hallan en las vacuolas de las clulas vegetales y que otorgan el color rojo, prpura o azul a las hojas, flores y frutos. Desde el punto de vista qumico, las antocianinas pertenecen al grupo de los flavonoides y son glicsidos de las antocianidinas, es decir, estn constituidas por una molcula de antocianidina, que es la aglicona, a la que se le une un azcar por medio de un enlace glucosdico. Sus funciones en las plantas son mltiples, desde la de proteccin de la radiacin ultravioleta hasta la de atraccin de insectos polinizadores. BETANINAS La Betanina, rojo remolacha es una sustancia que consiste en el extracto acuoso de la raz de la remolacha roja Beta vulgaris. Se extrae generalmente tras la coccin en agua, y presenta un color rosado. Utilizacin: Estos compuestos extrados de la remolacha son utilizados generalmente en la industria de la alimentacin como colorante para ciertos postres, como las gelatinas o el yogur de frutas rojas. CAROTENOIDES Pueden obtenerse una variedad de colores del amarillo al rojo, pasando por el naranja. En esta clasificacin, se encuentra el rojo del tomate y el betacaroteno. Desde el punto de vista qumico, pertenecen a la familia de los terpenos, es decir estn formados por unidades de isopreno (ocho unidades, es decir, cuarenta tomos de carbono), y su biosntesis se produce a partir de isopentenil pirofosfato. Esto produce sus rasgos estructurales ms evidentes, la presencia de un muchos dobles enlaces conjugados y de un buen nmero de ramificaciones de grupos metilo, situados en posiciones constantes. Se conocen alrededor de 600 compuestos de esta familia, que se dividen en dos tipos bsicos: los carotenos, que son hidrocarburos, y las xantofilas, sus derivados oxigenados. A estos tipos hay que unir los apocarotenoides, de tamao menor, formados por ruptura de los carotenoides tpicos.

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CARACTERSTICAS DE EXTRACCIN DE LOS PIGMENTOS: Los pigmentos cloroflicos son insolubles en el solvente universal llamado agua. Pero s son solubles en solventes orgnicos como por ejemplo alcohol etlico y acetona. A los solventes que extraen simultneamente todos los pigmentos de la hoja se los suele llamar extractantes. Existen otros solventes que presentan afinidad por algunos pigmentos y se los llama separadores, como por ejemplo el tetracloruro de carbono y el ter de petrleo. En el mtodo de extraccin simple, como se desarrolla ms adelante se utilizar como extractante el alcohol etlico y como separador el tetracloruro de carbono. Estos dos solventes orgnicos responden en forma diferente a los pigmentos cloroflicos, como as tambin a sus diferencias fsicas que hacen que sean dos lquidos no misibles y con diferente peso especfico. En el segundo mtodo por cromatografa se utilizar como extractante la acetona y como separador el ter de petrleo. Este mtodo se trata de una separacin ms fina de los pigmentos, y se basa en la absorcin y solubilidad diferenciales de varias sustancias entre las que se incluyen los pigmentos. Un soporte inerte como papel de filtro para la corrida y unos granos de carbonato de calcio para deshidratar la muestra, son los componentes necesarios para desarrollar la tcnica. 4. FUNDAMENTO DE LA PRCTICA: EXTRACCIN DE PIGMENTOS Entre los distintos mtodos que existen para separar y obtener esos pigmentos se encuentra el de la cromatografa en papel, que es una tcnica que permite la separacin de las sustancias de una mezcla y que tienen una afinidad diferente por el disolvente en que se encuentran. De tal manera que al introducir una tira de papel en esa mezcla el disolvente arrastra con distinta velocidad a los pigmentos segn la solubilidad que tengan y los separa, permitiendo identificarlos

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perfectamente segn su color. CLOROFILAS Existen en cuatro formas diferentes, , , y , siendo las dos primeras las presentes en las plantas. Las clorofilas tienen tpicamente dos picos de absorcin en el espectro visible, uno en el entorno de la luz azul (400-500 nm de longitud de onda), y otro en la zona roja del espectro (600-700 nm); sin embargo reflejan la parte media del espectro, la ms nutrida y correspondiente al color verde (500-600 nm). Esta es la razn por la que las clorofilas tienen color verde y se lo confieren a los organismos, o a aquellos tejidos, que tienen cloroplastos activos en sus clulas, as como a los paisajes que forman. Las plantas superiores tienen dos tipos de clorofila muy semejantes entre s, denominadas a y b, siendo la primera la mayoritaria y la que se degrada ms fcilmente.(6)

ANTOCIANINAS Y BETALANAS En antocianinas el color a un PH determinado es funcin de los sustituyentes. Al aumentar el nmero de hidrxidos en el anillo B se intensifica el color azul mientras que la presencia de grupos metoxilo genera el color rojo. Son muy reactivas, el ion flavilio es deficiente en electrones y reacciona rpidamente. Generalmente son reacciones de decoloracin no deseadas. El color de las antocianinas es funcin del PH adems de su estructura. Algunas de ellas a PH cido son de color rojo, a PH bsico de color azul y a PH neutro son incoloras. Al contrario de lo que sucede en el caso de las antocianinas, el color de las betalanas no depende del pH. Las betacianinas mantienen su color prpura sin ningn cambio entre pH 4 y 7, y los cambios que se producen a pH tan extremos como 2 9 son pequeos. La betanina, una betalana, es el componente principal del colorante de la remolacha roja. CAROTENOIDES A los carotenoides que contienen tomos de oxgeno se les conoce ms especficamente como xantofilas. Los restantes constituyen el grupo de los llamados carotenos. Su color, que vara desde amarillo plido, pasando por anaranjado, hasta rojo oscuro, se encuentra directamente relacionado con su estructura: los enlaces dobles carbono-carbono interactan entre s en un proceso llamado conjugacin. Mientras el nmero de enlaces dobles conjugados aumenta, la longitud de onda de la luz absorbida tambin lo hace, dando al compuesto una apariencia ms rojiza. Por ejemplo, el fitoeno que posee nicamente tres

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enlaces dobles conjugados absorbe luz en el rango ultravioleta y apareciendo por tanto incoloro a la vista, el licopeno, compuesto que confiere su color rojo al tomate contiene 11 enlaces dobles conjugados. Existen tambin carotenoides de color verde (-Caroteno), amarillo (-caroteno), y anaranjado. Como ejemplo de estos compuestos en la naturaleza, podemos citar al carotenoide mejor conocido, el que da al grupo su nombre, el caroteno, encontrado en zanahorias y responsable de su color anaranjado brillante. 5.- REACCIONES: a. ANTOCIANINAS Medio Acido, Bsico

Con glucosa

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Con agua

Al calor Cuando se somete a altas temperaturas, en presencia de azucares no hay cambios.

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6.- MATERIALES Y MTODOS 7.-RESULTADOS: EXTRACCION Y ANALISIS DE CLOROFILA Cromatografa circular: Clorofila b color amarillo verdoso MATERIALES: Vasos de precipitacin Tubos de ensayo Gradilla Baln de aforo de 100 mL Papel filtro Capilares Varilla de agitacin Pipetas de 10 y 5 mL Mortero y pistilo Reverbero Vasos de 250 ml Vidrio reloj Embudo Trpode Esptula Remolacha Acelga Frutillas Achiote Zanahoria

Cromatografa ascendente en papel: Clorofila b color amarillo verdoso RECORRIDO MUESTRA (cm) CLOROFILA A 5,6 Recorrido del solvente 9,0cm TABLA BIBLIOGRFICA ABSORBANCIA 549 nm CON BARRIDO INTELIGENTE 0,016

Rf

0,62 0,65

Rf = Rf = =0, 62

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Propiedades de la clorofila MUESTRA Muestra Original Muestra + c. Oxlico 5% Muestra + NaOH 0,1 N ANTOCIANINAS Esta determinacin se realiz con fresas, se hizo una solucin y se coloc en 9 tubos para realizar diferentes pruebas obteniendo los siguientes resultados: RESULTADO 3,43 COLORACIN Verde Oscuro Verde plido Amarillo verdoso

Tubo 1 medir pH

MUESTRAS Muestra original Tubo 1 +HCl Tubo 2 + cido actico Tubo 2 + agua Tubo 3 + NaHCO3 Tubo 4 + NaOH 10%

Tubo 2 + HCl diluido +NaOH 10% Tubo 5 + 10 a 20 mg de c. Ascrbico

Tubo 6 + bisulfito de K Tubo 7 + FeCl3 Tubo 8 + sln. De gelatina Tubo 9 + glucosa Alcuota en el vidrio reloj

COLORACIN Rosado claro Rojo naranja Naranja intenso Tomate Forma espuma toma un color rojo Al aadir el reactivo se forma dos fases la superior transparente y la inferior amarrilla Al agitar toma un color pardo y luego de un tiempo se hace amarrillo Toma un color tomate claro Primero no cambia de color Al calentar se observa un color carne forma una emulsin. Tomate intenso Tomate claro Color carne tipo emulsin Rosado plido se diluye la muestra No sufre ningn cambio de color

ANTOCIANINAS CAROTENOS CLOROFILA: EFECTOS DE LA COCCIN SOBRE LOS PIGMENTOS Esta determinacin se realiz con zanahoria y acelga COLORACIN Vaso 1: agua + zanahoria Color del agua es sin descortezar ligeramente amarillo Vaso 2: agua + zanahoria Agua casi cristalina sin descortezar + cido Actico Vaso 3: agua + zanahoria Agua toma un color amarillo sin descortezar + NaHCO3 intenso TEXTURA Blanda Semi blando

Muy blando

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COLORACIN Agua toma color verde claro Agua toma un colore verde oliva Agua toma un color verde amarrilento TEXTURA Blanda Semi blando Muy blando

Vaso 1: agua + acelga Vaso 2: agua + acelga + cido Actico Vaso 3: agua + acelga + NaHCO3

EXTRACCIN Y ANLISIS DE BETANINAS Se realiz con la remolacha se hizo una solucin RESULTADOS 6,92 1,657

Tubo 1 medir pH Absorbancia = 400 a 540 nm

MUESTRA Muestra original Tubo 1 + HCl Tubo 2 + NaOH 10% Tubo 3 + cido ctrico Tubo 4 + NaHCO3 Muestra en cpsula al ambiente

Muestra en cpsula a la luz solar

COLORACION Vino No cambia Vino pardo Rojo Vino oscuro Se observ que el pigmento de la remolacha se oscureci. Sin presentar ningn otro cambio Se observ una separacin de fases en el pigmento. Una ms densa y otra ms leve que quedaba como sobrenadante. Adems se observ cierta decoloracin. No se degrado en su color si, se concentr pues el calor evaporo el agua y adems hubo la presencia de un precipitado fucsia Cambia el color a los 90 C

Muestra en cpsula a la luz artificial

Tubo 5 calentar

COMPORTAMIENTO DURANTE LA COCCIN OBSERVACIONES Vaso 1 agua + remolacha entera Agua toma un color rojo claro Vaso 2 agua+ remolacha descortezada Agua toma un color morado Vaso 3 agua + remolacha descortezada y Agua toma un color vino intenso troceada EXTRACCIN Y ANLISIS DE CAROTENOIDES A PARTIR DE ACHIOTE Absorbancia=471 482 nm Contenido de bixina RESULTADOS 1. 344 0,2 %

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8.- ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS: EXTRACCION Y ANLISIS DE CLOROFILA Se obtuvo un extracto cetnico de acelga de color verde obscuro. Cromatografa circular Por falta de reactivos se aplic como solvente la misma acetona, y luego se utiliz ter etlico, este solvente arrastr las marcas del extracto de los puntos de aplicacin a una gran velocidad y se observ con claridad una mancha verde amarillenta lo que nos indica que podra tratarse de la clorofila b. Aunque segn datos bibliogrficos la acelga por ser una planta superior contiene los dos tipos de clorofila y en mayor cantidad la clorofila pero tal vez en la cromatografa no se identifica debido a que esta se degrada ms fcilmente por lo que se observa la clorofila b Cromatografa ascendente en tira de papel El extracto de acelga mediante la Cromatografa ascendente en tira de papel no present diferencia con la cromatografa circular ya que de igual manera se observ una manchita verde amarilla y al comparar los Rf con los de la tabla de bibliografa nos dio como resultados la existencia de clorofila b. Segn estos resultados podemos decir que para la extraccin de clorofila tanto la cromatografa ascendente en tiras de papel como la circular son eficientes y eficaces ya que se separ claramente y de forma definida la mancha correspondiente a clorofila. Se midi la absorbancia a 549 nm con un barrido inteligente ya que 640-667 nm como indica en la prctica no se observ ningn resultado. Propiedades de la clorofila El extracto ms cido oxlico al 5% cambio de color verde obscuro a color verde plido esto se debe a que en medio cido y con calor, la clorofilas pueden pasar a feofitinas que sera la misma estructura pero se sustituye el tomo de magnesio presente en el centro de anillo tetrapirrlico por un tomo de hidrgeno lo cual explica el cambio de color. El extracto acetnico ms NaOH 0.1 N cambio de color verde intenso a color amarillo verdoso estos cambios notorios se debe a que la estructura qumica compleja de la clorofila es fcilmente alterable por pH. No se pudo diferenciar mediante reaccin la clorofila a y b ya que el reactivo utilizado (KOH 2% en metanol) no se encontr en la concentracin requerida (KOH 30% en metanol). ANTOCIANINAS Esta determinacin se realiz con fresas, se hizo una solucin y se coloc en 9 tubos para realizar diferentes pruebas obteniendo los siguientes resultados:

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Se pudo observar que los cambios de pH son factores muy importantes en determinacin de antocianinas ya que stas son ms estables en un medio cido que en un medio neutro o alcalino. Al aadirle cidos como lo hicimos en la prctica la forma predominante es la del in flavin, el cual explica el color rojo anaranjado, cuando se somete a ph bsicos como NaHCO3 o NaOH el in flavilio es susceptible al ataque nucleoflico por parte del agua dando carbinol a pH 4,5 y seguido de la forma chalcona lo cual explica el color que obtuvimos como resultado. Adems obtuvimos el pH de la solucin de fresas el cual es cido lo cual concuerda con lo estudiado ya que es ms estable a pH cido que bsico o neutro. ANTOCIANINAS CAROTENOS CLOROFILA: EFECTOS DE LA COCCIN SOBRE LOS PIGMENTOS Esta determinacin se realiz con zanahoria y acelga Despus de haber sometido la muestra de zanahoria y acelga en agua con c. Actico o con bicarbonato de sodio se observa que existen cambios de color en las muestras debido a la susceptibilidad de las mismas a la temperatura de coccin y al pH que se los ha expuesto, ya que las antocianinas son sensibles al calor y pH por lo que se degradan, los carotenoides son relativamente resistentes al calor y pH pero pueden sufrir transformaciones parciales en su isomera geomtrica lo cual provoca cambios y de igual manera los la clorofila se degrada cuando existe altas temperaturas como es la que se utiliza para la coccin de un alimento. EXTRACCIN Y ANLISIS DE BETANINAS Pudimos observar que existen cambios de coloracin en los tubos debido a los diferentes reactivos utilizados ya que alteran la estabilidad de las betaninas, los colores cambian cuando existe un pH muy acido bajo de 3 aqu la intensidad de la coloracin decrece, cuando existe un pH bsico es color es mas intenso debido un efecto betacrmico, por lo que la remolacha se encuentra entre un pH de 3 a 7 en donde esta es inalterable. De igual forma son inestables a altas temperaturas en donde las betaninas producen isobetatinas o betaninas descarboxiladas. En los vasos que contenan el alimento nicamente con agua se demor su coccin y la carne mantuvo su forma en cambio en los vasos con cido actico vari ligeramente su forma. Al comparar el efecto de la coccin entre los tres vasos se pudo notar que el vaso con bicarbonato de sodio sale en el menor tiempo y un exceso de ste hace que tanto la carne como la acelga se desmenuce y la textura sea muy blanda.

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10.- CONCLUSIONES: Logramos realizar la extraccin y anlisis de pigmentos alimentarios vegetales. En la prctica se pudo extraer y analizar la clorofila de la acelga (Beta vulgaris var. Cicla) mediante cromatografa circular y cromatografa ascendente en tira de papel, no con los reactivos adecuados pero pudimos realizar la extraccin y anlisis por cromatografa en papel filtro, reemplazando al papel Cromatogrficos, obteniendo buenos resultados y pudiendo distinguir el tipo de clorofila que existe en la acelga, logrando distinguir clorofila b en el extracto de acelga tanto en cromatografa circular como en la ascendente por papel sin embargo por no falta de metanol para la preparacin del reactivo no se pudo identificar mediante pruebas de coloracin. Determinamos las antocianinas en la frutilla (Fragaria vesca). Pudiendo obtener resultados que se los pueden observar a la vista, y se pudo comprobar la sensibilidad que estos compuestos presentan, siendo altamente sensibles al a luz, a medios cidos y alcalinos sean estos fuertes o dbiles, en general en medio cido son de color rojizo y en el alcalino son verde oliva y el color natural que es rojo. Conocimos el efecto de la coccin sobre los pigmentos vegetales de la zanahoria (Daucus carota), donde conocimos el comportamiento de esta en los diferentes reactivos en que realizamos las diferentes pruebas, conocer el efecto de la coccin sobre los pigmentos vegetales de la zanahoria y de la acelga donde al ser cocidas en agua liberan sus pigmentos cambiando el color del agua en tanto que le dan textura suave al alimento pues debe desnaturalizarse los componentes a la accin del calor, al igual que sucede con el cido actico al 10% y el NaHCO3 al 10%, con excepcin en la zanahoria no se liberan los pigmentos con cido actico al 10%. Obtuvimos las betaninas presentes en la remolacha (Beta vulgaris) mediante la extraccin y anlisis en la prctica. Determinamos y analizamos los carotenoides presentes en el achiote (Bixa orellana). 11.- BIBLIOGRAFA: Pigmentos vegetales, clasificacin, consultado el 2012-11-12, http://blafar.blogia.com/2007/040901-los-pigmentos-vegetales.php Clorofila, betalinas, carotenos, consultado el 2012-11-12, http://www.botanica.cnba.uba.ar/Trabprac/Tp6/Pigmentos.htm disponible en:

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Pigmentos alimentarios vegetales, extraccin, consultado el 2012-11-12, disponible en: http://innovaindustria.blogspot.com/2009/10/pigmentos-naturales-en-alimentacion.html Clorofila, tipos de clorofila, cromatografa circular, papel ascendente, consultado el 2012-1112, disponible en: http://botikanaturista.blogspot.com/2007/01/la-clorofila.html Fundamento de las clorofilas, carotenoides, pigmentos vegetales, consultado el 2012-11-12, disponible en: Pigmentos alimentarios: http://bvs.sld.cu/revistas/ali/vol14_2_00/ali07200.htm

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Los alimentos vegetales y sus pigmentos, consultado el 2012-11-12, disponible en: http://www.ikerlarre.e.telefonica.net/paginas/pigmentos.htm Alimentos, consultado el 2012-11-12, www.kalsec.com/es/products/annatto_pg_norbixin.cfm Alimentos naturales, consultado el http://bus.sld.cu/revistas/bi/vol22-1-03/ibio07103.pdf 12. ANEXOS 2012-11-12, disponible en:

disponible

en:

Pruebas con la zanahoria

Pruebas con la zanahoria

Pruebas con la remolacha

Pruebas con la remolacha

Determinacion de antocianinas

Prueba con la remolacha

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