Faculdade de Cincias da Universidade de Lisboa

Caracterizao de protenas por tcnicas electroforticas (SDS-PAGE e focagem isoelectrnica)

Bioqumica Experimental I
Docente: Carlos Farinha
Discentes: Andr Nascimento, n. 41842 Andreia Carvalho, n. 41873 Joo Carru, n. 41843 Patrcia Patro, n. 41864

13 de Novembro de 2012

ndice
Resumo.......................................................................................................................................... 3 Fluxograma do gel ......................................................................................................................... 4 Fluxograma da sandwich ............................................................................................................... 5 Materiais, reagentes e procedimento........................................................................................... 6 Tratamento de dados .................................................................................................................... 7 SDS-PAGE................................................................................................................................... 7 a) Apresente um esquema da separao obtida na eletroforese SDS-PAGE. Represente a curva de calibrao do gel preparado e determine a massa molecular relativa das subunidades da -globulina................................................................................................... 7 b) Discuta globalmente os resultados obtidos na tcnica de SDS-PAGE em termos da estrutura da -globulina. ..................................................................................................... 11 Focagem isoelctrica ............................................................................................................... 13 a) Explique o nmero de bandas de protena padro que encontrou. ........................... 13

b) De acordo com os dados obtidos para os padres, construa uma curva de calibrao do gel: pI da banda versus distncia migrada em relao ao ctodo. ................................ 14 c) Determine o valor de pI das protenas estudadas a partir da curva de calibrao anterior................................................................................................................................ 15 d) Discuta os resultados e compare os valores obtidos com os pI calculados para as protenas estudadas a partir da sua sequncia de resduos de aminocidos (consulte uma base de dados de protenas (http://www.expasy.org/ )). Comente os possveis desvios observados. ......................................................................................................................... 16 Concluso: ................................................................................................................................... 17 Bibliografia .................................................................................................................................. 19

Resumo
Este trabalho experimental teve como objectivo a realizao de duas tcnicas eletroforticas SDS-PAGE e focagem isoeltrica para caracterizao de protenas. A primeira tcnica foi usada para obter informao sobre a estrutura da -globulinas, no qual, utlizou se dois tampes: Tampo de aplicao da amostra preparado sem -mercaptoetanol; Tampo de aplicao da amostra preparado com -mercaptoetanol.

Aps a realizao da electroforese determinamos a massa molecular relativas das subunidades da - globulina e para a determinao destas traou-se uma recta de calibrao baseada nos valores de Rf das protenas padro e nos seus valores de log10(Mr). Obteve-se experimentalmente uma massa relativa de 66489,1 Da para a Albumina; 92879,1 Da para a Xilanase U4; 51745,8 Da para a Fosfamanose isomerase e 26518 Da para a Esterase Fam 4 de glcidos. A segunda tcnica foi usada para determinao do ponto isoelctrico de vrias protenas. Determinamos estes valores por comparao da curva de caliberao e os pontos isoeltricos conhecidos de vrios marcadores e concluimos que os resultados esto praticamente todos de acordo com o esperado.

Fluxograma do gel
Preparar as solues do gel resolvente e do gel de concentrao em erlenmeyers, sem adicionar os do gel Fluxograma agentes polimerizantes TEMED e PSA, de acordo com as quantidades indicadas nos Quadros I e II. A soluo de PSA deve ser preparada no prprio dia. Adicionar os agentes polimerizantes, TEMED e PSA, soluo do gel resolvente e agitar (ter preparada uma seringa com agulha contendo gua destilada). Adicionar a soluo do gel resolvente sandwich com o auxlio de uma pipeta de Pasteur, deitando-a por um dos cantos e inclinando ligeiramente a base de polimerizao, at um pouco acima da altura do trao que foi marcado.

Deixar a caixa de polimerizao em repouso at que o gel polimerize (45 min a 1 h) - nessa altura notar-se- mais distintamente a linha de interface gel-gua. A soluo no usada tambm pode servir de auxiliar para seguir a polimerizao do gel.

Muito devagar, com o auxlio da seringa preparada anteriormente, introduzir um pouco de gua destilada sobre a superfcie da soluo de gel resolvente. aconselhvel introduzir a gua pelos dois cantos superiores da "sandwich" (para evitar a formao de uma superfcie de polimerizao irregular, o que ocorreria caso a soluo polimerizasse directamente exposta ao ar).

Guardar o monmero no usado ao p da sandwich.

Quando a soluo tiver polimerizado no erlenmeyer, deit-la fora. Nessa altura, tambm o gel na sandwich dever ter polimerizado.

Aps certificao de que o gel polimerizou, inverter a caixa de polimerizao de modo a escorrer totalmente toda a gua da superfcie do gel (no apenas a que foi adicionada com a seringa, mas tambm a que resultou da reaco de polimerizao da acrilamida - gua de excluso do gel).

Secar com cuidado a superfcie do gel com um pouco de papel de filtro.

Adicionar a soluo do gel de concentrao do lado do espaador em que o pente est inclinado at cobrir os seus dentes.

Adicionar os agentes polimerizantes ao gel de concentrao num erlenmeyer e agitar.

Introduzir o pente na sandwich e inclin-lo de modo a que os dentes faam um ngulo de cerca de 10. Este cuidado visa impedir que fiquem retidas bolhas de ar nos dentes do pente quando se introduz a soluo de monmeros.

Introduzir cuidadosamente o pente, evitando a reteno de bolhas de ar nos seus dentes.

Alinhar o pente na sandwich e adicionar mais soluo de modo a que a sandwich fique completamente cheia.

Deixar em repouso at polimerizar (30 - 45 min) (Notar que, neste caso, no necessrio adicionar gua para se obter uma superfcie de polimerizao lisa, uma vez que os dentes do pente desempenham essa funo).

Lavar os poos do gel com gua destilada ou com tampo de electroforese j diludo.

Quando se tiver certificado de que o gel de concentrao j polimerizou, tirar o pente com cuidado, puxando-o para cima lentamente, para no estragar os poos do gel.

Marcar a posio dos poos do pente no gel com uma caneta. Aguardar que o monmero polimerize no erlenmeyer antes de o deitar fora.

Fluxograma da sandwich
Lavar muito bem as placas de vidro, os espaadores de 0,75 mm e os pentes com mistura etanol-ter etlico (2:1, v/v) e deixar secar ao ar. Colocar os dois espaadores sobre a placa de vidro rectangular maior, ao longo das arestas laterais, e por cima, em "sandwich", colocar a placa de vidro de menores dimenses, de modo a ficar rigorosamente sobre a primeira, com as extremidades inferiores dos espaadores e das placas bem alinhadas. Nesta altura, os espaadores devem ficar cerca de 5 mm sados na outra extremidade em relao placa de vidro maior. Desapertar os quatro parafusos das molas da pea suporte da sandwich (clamp assembly) e mont-la na bancada de modo a que os parafusos no fiquem virados para a pessoa que manuseia o material.

Introduzir a montagem anterior na caixa de polimerizao de modo a que os parafusos fiquem afastados em relao a si.

No final, a placa de vidro maior deve ficar encostada placa de acrlico da pea suporte da sandwich. Apertar os dois parafusos superiores da montagem.

De um modo firme, pegar na sandwich preparada anteriormente com a placa de vidro maior afastada em relao a si e introduzi-la na pea suporte da sandwich.

Despertar novamente os dois parafusos superiores de modo a que as placas de vidro e os espaadores assentem na base da caixa de polimerizao.

Insirir o carto de alinhamento entre as duas placas de vidro de modo a posicionar correctamente os espaadores e, com cuidado, apertar ambos os pares de parafusos.

Retirar o carto de alinhamento e a pea suporte da sandwich da caixa de polimerizao, confirmando que as placas e os espaadores esto perfeitamente alinhados na sua base inferior. Se tal no acontecer, repetir os passos anteriores pois, pode ocorrer um fuga do gel durante a sua introduo entre as placas de vidro.

Colocar as borrachas de silicone na parte superior da caixa de polimerizao.

Confirmar que as borrachas de silicone cinzentas removveis esto limpas e completamente livres de restos de acrilamida de modo a assegurar uma boa selagem do sistema.

Usando o nvel da bolha de ar, nivelar a caixa de polimerizao.

Transferir novamente a pea suporte da sandwich para a caixa de polimerizao mas agora para a sua posio central. Para isso, pressionar a placa de acrlico de encontro base da caixa de polimerizao, de modo a que as placas de vidro assentem nas borrachas cinzentas.

Encaixar a placa de acrlico debaixo da salincia da caixa de polimerizao empurrando as molas brancas da montagem. No exercer presso contra as placas de vidro ou espaadores pois poderiam partir-se.

Introduza um pente na "sandwich" at que os seus dentes fiquem totalmente inseridos entre as duas placas de vidro.

Marcar com uma caneta um trao 1,0 cm abaixo do nvel inferior dos dentes do pente. Este ser o nvel at ao qual se introduzir a soluo de gel resolvente ou de separao.

Materiais, reagentes e procedimento

Tantos os materiais como os reagentes utilizados nesta experincia esto de acordo com o protocolo experimental. O procedimento da electroforese sofreu as seguintes modificaes: 1. amostra P foi adicionado apenas 10L de protena padro em vez de 5 L e 95 L de gua destilada 2. As outras amostras continham 20L de -globulina 3. Adicionou-se a cada amostra e protena padro 20L de tampo Tris-HCl (pH 6,8) 0,0625 M em vez dos 100L

Tratamento de dados
SDS-PAGE
a) Apresente um esquema da separao obtida na eletroforese SDS-PAGE. Represente a curva de calibrao do gel preparado e determine a massa molecular relativa das subunidades da -globulina.

No gel realizado foi aplicada protena padro nos poos 2 e 7, os poos 1 e 10 foram deixados livres e sendo que nos outros foram colocadas globulina. Esquema do gel:

Gel de concentrao. Altura do gel: 4 cm

Gel de resoluo. Distncia migrada do azul de bromofenol: 3,6cm

Ilustrao 1 gel de concentrao de SDS-PAGE

A electroforese decorreu durante 1.30 a uma voltagem de 100 V, aps esse tempo, cuidadosamente, retirou-se o gel das placas de vidro para electroforese e mediu-se a altura do gel de concentrao (4cm), assim como a distancia percorrida pelo azul de bromofenol (3,6cm). A ilustrao 1 demonstra este esquema, antes da revelao do gel. A distncia percorrida pelo azul de bromofenol (3,6cm) utilizada para determinar os Rf de cada risca adquirida no gel de concentrao aps a sua revelao (demonstrado em anexo) na seguinte frmula:

Para se obter a distncia percorrida de cada risca da protena padro mede-se com uma rgua a distncia de migrao da banda desde o poo do gel at ao centro da mesma. Demonstramos o clculo utilizado para o primeiro exemplo (P3, primeira risca), pois so realizados clculos anlogos para a determinao dos outros Rfs:

Para traar a recta de calibrao, ainda necessrio realizar o logaritmo de cada uma das massas moleculares relativas apresentadas na Tabela 1 que foram identificadas na amostra padro.

Protena

Massa Molecular relativa (MMr) (Da)

Log10 (MMr)
(Da)

Xilanase U4 Albumina Fosfamanose isomerase Celulase 5 A Celulase M9 Esterase Fam 4 de glucidos Dominio M6 de ligao a xiloglucanos

96 000 66 000 48 000 40 000 32 000 26 100 18 500

4,98 4,82 4,68 4,60 4,51 4,41 4,27

Tabela 1 Massa relativa dos vrios componentes da protena padro

Assim, traamos a curva de calibrao que nos permitiu determinar, aproximadamente, as massas moleculares relativas das bandas adquiridas nos outros poos.

0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 4,2 4,3 4,4

Rf vs log(MMr)
y = -0,795x + 4,0188 R = 0,9545

4,5

4,6

4,7

4,8

4,9

5,1

Grfico 1 Recta de distribuio do Rf em funo do log(MMr) em SDS-PAGE

Exemplificao da determinao de uma das massas moleculares relativas (exemplo anterior): Sendo: Ento, para O verdadeiro valor de MMr para esta banda Realizando, clculos anlogos para todos os outros dados, construmos a Tabela 2

Log(MMr) (Da) P3 4,915332 4,845451 4,740629 4,461104 P4 4,740629 4,461104 P5 4,740629 4,461104 P6 4,740629 4,461104 P8 4,985213 P9 4,915332 P3 82287,13 70056,87 55033,73 28913,73 P4 55033,73 28913,73 -

MMr (Da) P5 55033,73 28913,73 P6 55033,73 28913,73 P8 96652,51 P9 82287,13 -

Tabela 2 Tabela alusiva ao Grfico 1, clculo das massas moleculares relativas nos diferentes poos da SDSPAGE

Infelizmente muitos destes resultados no estam de acordo com o esperado, como o caso evidente da quarta risca do poo trs (P3), tendo migrado exactamente o mesmo que a Esterase Fam.4 de glcidos, obviamente que tem de ter massa molecular relativa idntica, ou seja, em vez de 28913,73 deveria ser perto de 26100. Isto pode ser explicado a partir de uma observao mais cuidada do Grfico 1: apesar de o valor de R2 (0,9545) ser, relativamente, prximo de 1, consiguimos inferir que a recta de distribuio escolhida no a melhor, uma vez que no possui nenhum dos pontos obtidos da amostra padro, R2 possui um valor to elevado pois os desvios so compensados. Ento, o grupo decidiu realizar um novo grfico rejeitando

quer o primeiro, quer o ltimo pontos, visto que esto completamente desnivelados da recta. Assim, construmos o Grfico 2.

Rf vs log(MMr) melhorado
0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 4,3 4,4 4,5 4,6 4,7 4,8 4,9 y = -0,7654x + 3,858 R = 0,9983

Grfico 2 Recta de distribuio do Rf em funo do log(MMr) melhorado em SDS-PAGE

Os clculos so anlogos aos realizados anteriormente, excepo que a recta utilizada para determinar as massas relativas foi:

Ento, construmos a Tabela 3, como novas e melhoradas massas moleculares relativas.

Log(MMr) (Da) P3 4,895334 4,822751 4,713875 4,42354 P4 4,713875 4,42354 P5 4,713875 4,42354 P6 4,713875 4,42354 P8 4,967918 P9 4,895334 P3 78584,03 66489,13 51745,8 26517,97 P4 51745,8 26517,97 MMr (Da) P5 51745,8 26517,97 P6 51745,8 26517,97 P8 92879,1 P9 78584,03 -

Tabela 3 Tabela alusiva ao Grfico 2, clculo das massas moleculares relativas nos diferentes poos da SDSPAGE

Atravs dos dados da Tabela 3 realizou-se a recta de calibrao representada no Grfico 2. Esta utilizada para calcular a massa molecular relativa das subunidades da globulina. A partir desta recta o resultado comentado anteriormente, aproxima-se muito mais do verdadeiro (26000), 26517,97 apenas um pouco superior, isto deve-se ao facto de, a partir da recta de calibrao, apenas obtemos resultados aproximados. Podemos, assim, assumir esta recta, uma vez que a maioria dos resultados assemelha-se mais realidade esperada. No entanto a primeira risca do terceiro poo (78584,03) possui um valor para a massa relativa mais aproximado ao real (9600) no Grfico 1 (82287,13) do que no Grfico 2. Uma vez rejeitado o primeiro, resta-nos a hiptese de considerar o dado em questo um erro, devido anulao da risca da amostra padro correspondente.

Novamente, outro exemplo que levou a preferncia deste grfico : a segunda risca que tem massa relativa aproximadamente semelhante a 66000, sendo muito superior a este valor (70056,87) no Grfico 1; porm, comparando com o Grfico 2 esse valor decresce para 66489,13 podendo ser assumido como verdadeiro, repetidamente este no corresponde ao valor exacto devido recta de calibrao, que representa uma aproximao da relao entre Rf e log(MMr) dos nossos dados. Assim conclumos que o Grfico 2 apresenta uma recta de calibrao mais relacionada com os nossos resultados do que a do Grfico 1 pelo que assumimos o primeiro. De seguida isolamos os valores de Rf e MMr retirados da Tabela 3 Rf 0,11 0,17 0,25 0,47 MMr (Da) 78 584 66 489,1 51 745,8 26 518

Tabela 4 Dados dos Rf e MMr das bandas dos poos 3 a 6

b) Discuta globalmente os resultados obtidos na tcnica de SDS-PAGE em termos da estrutura da -globulina.

Analisando a Tabela 4 e o gel de concentrao aps a resoluo (em anexo) chegamos concluso que a globulina possui duas cadeias, uma leve com, aproximadamente, 26518 Da de massa relativa e outra pesada 66489,1 Da. Tal como esperado a cadeia pesada da protena migrou menos que a leve, uma vez que apresentarem maior dificuldade em passar pelos crivos do gel por possurem maiores dimenses. Observando, com mais cuidado, notamos que os diversos poos que contm globulina apresentam diferentes nmeros de bandas, bem como nitidez de cada. Iniciando com os poos 3 a 6 todos a eles foi adicionado 100 mL de -mercaptoetanol, agente que reduz as ligaes persulforeto dos polipeptdos, destruindo as suas estruturas tridimensionais. S com a sua adio, garantimos que todas elas tm forma linear e igual massa. Dos poos, anteriormente considerados o P3 foi o nico que no foi aquecido (100C), pelo que podemos verificar que a desnaturao da globulina no foi total e, possivelmente, ainda continha algumas pontes dissulfito apresentando bandas com massas moleculares relativas superiores cadeia pesada. Os restantes (P4 a P6) foram sujeitos a aquecimento, mas com tempos diferentes (1, 2 e 5 minutos, respectivamente). Obviamente que o P6 possui o melhor resultado com as cadeias leve e pesada bem definidas e sem mais bandas. Este acontecimento

esperado, deve-se ao facto de a globulina estar definitivamente desnaturada pelo que no gel apenas observamos duas bandas bem ntidas representativas das suas cadeias. Assim, deduzimos que quanto maior o tempo de aquecimento maior a destruio dos nveis de estrutura da protena. J para os poos 8 e 9 no foi utilizado -mercaptoetanol pelo que no foram destrudas as ligaes persulforeto. Assim verificamos uma migrao das amostras mnima uma vez que as cadeias leve e pesada permaneceram juntas, tendo um elevadssimo peso molecular no atravessam os crivos do gel de concentrao e, portanto, permanecem, praticamente, no poo. O P9, apesar de ter sido aquecido (100 C, 5 minutos), evidenciou o mesmo resultado que o P8, o que nos permite inferir que o aquecimento no suficiente para quebrar as ligaes em questo, no se dando a separao das cadeias.

Focagem isoelctrica

Ilustrao 2 gel de resoluo da Focagem isoelctrica

a) Explique o nmero de bandas de protena padro que encontrou. Neste gel foram colocadas amostras padro nos poos 3 e 8 e nos poos 5 (mioglobina) e 7 (BSA) soluo proteica desconhecida, tal como possvel presenciar no gel de resoluo apresentado em anexo. Aps uma observao muito cuidada do mesmo, apenas conseguimos detectar onze bandas. De inicio este resultado poderia gerar alguma confuso, uma vez que a protena padro possui doze componentes diferentes, porm o dado esperado uma vez que a Amiloglucosidase ( pH = 3,5) possui um pH inferior ao do corante, o vermelho de metilo (pH = 3,75). Isto significa que a suposta banda correspondente ao enzima referido no ficou retida no gel. No reservatrio superior encontrava-se uma soluo alcalina (NaOH 25mM) no ctodo (plo negativo) e no reservatrio inferior colocou-se uma soluo mais cida ( cido actico 20mM) o nodo (plo positivo). Ento os componentes da protena padro mais cidos migraram mais que os alcalinos. A partir desta anlise podemos induzir que a Amiloglucosidase (pH = 3,5) percorreu todo o gel, no ficando retida nele.

b) De acordo com os dados obtidos para os padres, construa uma curva de calibrao do gel: pI da banda versus distncia migrada em relao ao ctodo.
Componentes Amiloglucosidase Vermelho de metilo (corante) Inibidor da tripsina de soja lactoglobulina Anidrase carbnica bovina B Anidrase carbnica humana B Banda acdica da mioglobina do cavalo Banda bsica da mioglobina do cavalo Banda acdica da lectina da lentilha Banda central da lectina da lentilha Banda bsica da lectina da lentilha Tripsinognio pI 3,50 3,75 4,55 5,20 5,85 6,55 6,85 7,35 8,15 8,45 8,65 9,3

Tabela 5 pontos isoelctricos dos componentes do Broad p/ Calibration Kit da Amersaham BioSciences

pI da banda vs Distncia migrada em relao ao ctodo

6 5 4 3 2 1 0 0 2 4 6 8 10 y = -0,9124x + 9,0422 R = 0,9805

Grfico 3 Relao entre a distncia migrada das diferentes protenas em funo dos seus pontos isoelctricos

Uma anlise delicada do Grfico 3 e da Tabela 5 leva-nos a deduzir que apesar do elevado R2 conseguido a recta de calibrao no retrata a realidade mas uma aproximao mesma. Isto porque segundo a recta os componentes da amostra padro, cujos pontos isoelctricos so conhecidos, teriam valores ligeiramente diferentes dos tabelados. Contudo esta aproximao razovel pelo que considermos ao longo do relatrio como verdadeira.

c) Determine o valor de pI das protenas estudadas a partir da curva de calibrao anterior. Aps a obteno da recta de distribuio, calculmos os pI das diferentes bandas utilizando a equao reduzida da recta: Demonstrao de um clculo efectuado para o poo dois (P5) primeira banda (0,5cm):

Realizando esta equao para todas as outras bandas construmos a seguinte tabela:
Distncias migradas pI pI da protena em relao ao ctodo 9,36 0,5 6,84 2,8 6,51 3,2 3 BSA 3,2 6,40 5,86 3,5 6,07 3,7 5,86 4,2 5,31 4 -Globulina 2,7 6,95 6,95 5 Lisozima 0,3 Fora da gama* 9,58 6 Tripsina 3,0 6,62 6,62 8,38 1,4 7,94 1,8 7,61 2,1 7 Mioglobina 2,3 7,39 7,17 2,5 7,17 2,8 6,84 3,1 6,51 8 Citocromo c 0 Fora da gama* 9,90 2,5 7,17 2,8 6,84 3,0 6,62 3,3 6,29 9 Fosfatase cida 6,29 3,5 6,07 3,7 5,86 4 5,53 5,6 3,77 Tabela 6 - Tabela alusiva ao Grfico 3, clculo dos pontos isoelctricos dos dois poos na Focagem isoelctrica Poo Amostra

*NOTA: o citocromo c e o lisozima no apresentam pontos isoelctricos dentro da gama de pH do gel pelo que praticamente no migram nos mesmo mantendo-se nos poos, onde foram colocados. Os valores escolhidos para o pI de cada protena teve em considerao a banda de maiores dimenses, isto a que estava mais conecentrada poir esse valor de pH dever aproximar-se mais do verdadeiro ponto isoelctrico da protena.

d) Discuta os resultados e compare os valores obtidos com os pI calculados para as protenas estudadas a partir da sua sequncia de resduos de aminocidos (consulte uma base de dados de protenas (http://www.expasy.org/ )). Comente os possveis desvios observados.

Protena
BSA - globulina Lisozima Tripsina Mioglobina Citocromo c Fosfatase cido

Valores tabelados
5,82 6,85 9,36 6,08 7,2 9,59 6,29

Valores experimentais
5,86 6,95 9,58 6,62 7,17 9,90 6,29

Tabela 7 valores tabelados dos pontos isoelctricos das protenas utilizadas no gel de resoluo

Tal como podemos verificar pela Tabela 7 a grande maioria dos nossos resultados no s se assemelham aos verdadeiros como tomam exactamente o mesmo valor, pelo que consideramos que esta experiencia foi realizada com enorme rigor e preciso levando-nos a pouqussimos erros. No entanto estes no podem ser desvalorizados e, portanto, tomamo-los em considerao: principalmente os de paralaxe em medies de volumes e tambm no manuseamento do material. Quanto qualidade das amostras resta-nos apenas assumir que se encontram puras, todavia podem ter sido responsveis pelos pequenos desvios obtidos. apenas de salientar as amostras de Tripsina e Citocromo c. Estes desnveis podero estar associados recta de calibrao e no necessariamente a pureza das amostras. Os elementos do grupo tiveram alguma dificuldade em observar as bandas dos poos 4 ( - globulina) e 6 (Tripsina) e, em vez de reparar nas supostas riscas, ainda dentro dos poos 5 (Lisozima) e 8 (citocromo c) no avistamos nenhuma deduzindo que a se encontravam, visto que o nosso gel de resoluo se encontrava ligeiramente danificado.

Concluso:
Electroforese em gel uma tecnica que tem em considerao a migrao de espcies carregadas eletricamente, quando dissolvidas ou suspensas num eletrlito, cujo aplicado uma corrente elctrica. As molculas so separadas consoante a sua relao carga/massa, quanto menor esta for menor ser a distncia percorrida pela devida molcula no gel. Esta tecnica , geralmente, utilizada na separao de protenas ou molculas de DNA e RNA. Para este tabalho laboratorial foi utilizada a eletroforese em gel de poliacrilamida na presena de dodecilssulfato de sdio (SDS). Este mtodo muito utilizado para a anlise de massas moleculares de protenas oligomricas. A poliacrilamida uma mistura de dois polimeros: acrilamida (molcula linear) e bisacrilamida (molcula em forma de T); onde a sua mistura d origem a uma rede, o gel. Este uma matriz constituda por um polmero de acrilamida com ligaes cruzadas de N, N-metil-bis-acrilamida, cuja porosidade da malha pode ser escolhida. Quanto maior a concentrao de acrilamida, menores sero os poros da malha formada, podendo-se, ento, criar diferentes gradientes de separao alterando as concentraes usadas de cada uma das molculas referidas. Antes de iniciar a SDS-PAGE, as diferentes cargas, nativas de cada protena, devem ser eliminadas para que esta separao dependa apenas da sua massa molecular. Ento, as protenas so misturadas com SDS. Este detergente desnaturante confere s protenas umas estrutura linear (a forma nativa geralmente globular) e densidade de carga uniforme. Isto acontece devido a duas caractersticas muito importantes desta substncia qumica: ser aliftico, possui uma regio hidrlilica, que forma interaces fracas com a gua, e outra hidrofbica, que interage com as cadeias polipeptdicas tornando todas as protenas negativamente carregadas anulando, deste modo, a razo carga/massa referida precedentemente; e ser aninico, possui elevada carga negativa, podendo transferi-las para as devidas cadeias. Na preparao das amostras colocmos, em 6 (inclundo as duas amostras padro), com -mercaptoetanol, agente que reduz as ligaes persulfureto da globulina, destruindo a sua estrutura quaternria. S com a sua adio, garantimos que todas elas tm forma linear e igual massa, uma vez que para as outras duas amostras este agente no foi colocado no se verificou separao entre cadeias leve e pesada. Aps esse tratamento, as protenas so aplicadas no topo de um gel de poliacrilamida e submetidas a uma corrente eltrica (100V), fazendo com que elas migrem atravs da malha em direo ao polo positivo, o ando. Dependendo do seu tamanho, cada protena se mover

diferentemente: as protenas menores migraro mais rapidamente, enquanto que as maiores tero mais dificuldade em atravessar a malha do gel e, assim, se ficaro presas no mesmo. Na Focagem isoelctrica a diferena entre as protenas a separar numa amostra foca-se nos, respectivos pontos isoelctricos. Todas as protenas possuem uma carga nativa que pode ser positiva, negativa ou nula dependendo do pH do meio, quando no possuem carga o respectivo pH denomina-se ponto isoelctrico (pI). Quando uma protena colocada num tubo estreito de gel de poliacrilamida no qual o gradiente de pH estabelecido pela mistura de solues tampo especiais (NaOH 25mM e CH3COOH 20mM) e sujeita a um campo elctrico (200V) ir inicialmente mover-se em direco ao elctrodo com carga oposta da protena, nesta experincia encaminharam-se para o ctodo. Durante a migrao atravs do gradiente de pH, a protena ir captar ou perder protes. Enquanto a protena migra a sua velocidade vai diminuindo at chegar ao ponto em que o valor de pH ser igual ao seu pI. Neste ponto a protena ter carga total neutra e como consequncia deixa de migrar, ficando retida no gel. Se a protena se difundir para uma regio fora do seu pI, ir adquirir carga e consequentemente move-se novamente para a posio onde globalmente neutra, devido a este fenmeno que se encontram diversas bandas em cada zona do gel. Esta pode ter grupos ionizados, mas globalmente neutra. Concluindo ambas as tcnicas utilizadas so bastante eficazes para a determinao das protenas utilizadas, apesar de serem mtodos de comparao.

Bibliografia
http://www.ufrgs.br/leo/eletroforese/policrilamida.htm http://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforese http://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforese_em_gel http://www.expasy.org http://kdbio.inescid.pt/~atf/bioinformatics.ath.cx/bioinformatics.ath.cx/index09c3.html?id=11 6