DiagnsticoVirolgico

DIAGNSTICOVIRAL
El diagnstico virolgico comprende la deteccin e identificacin del agente etiolgico de una infeccin viral, clnica o inaparente, y /o de la respuesta inmune especfica del husped. La primera etapa la constituye el diagnstico viral clnico, que generalmente tiene un carcter de orientacin. Se basa principalmente en el cuadro clnico y considera los antecedentes personales y familiares, adems de la situacin epidemiolgica; a menudo se recurre adems al laboratorio clnico general. En muchas circunstancias este diagnstico clnico puede ser suficiente, como en sarampin, hepatitis, varicela, etc. Sin embargo, cada da se observa con mayor frecuencia la asociacin de virus con diversos cuadros clnicos, incluso muy severos, en los que el estudio especfico de laboratorio virolgico se hace indispensable como medio diagnstico, de control evolutivo, con fines epidemiolgicos, etc. Hoy da, el avance de las tcnicas diagnsticas ha demostrado que hasta los cuadros ms tpicamente asignados a una etiologa pueden ser causados por otros agentes: las enfermedades son realmente sndromes. Las aplicaciones del diagnstico virolgico son variadas y dependen de los medios disponibles y de las circunstancias que ameriten un diagnstico etiolgico especfico. En salud pblica se utiliza habitualmente en programas de vigilancia epidemiolgica (ej: poliomielitis, influenza, hantavirus, VIH, etc.) y en el control de vacunas mediante censos serolgicos, como polio, parotiditis y sarampin. En medicina curativa la necesidad del diagnstico virolgico alcanza a todas las disciplinas: pediatra, obstetricia, medicina, ciruga, dermatologa, etc. El aumento de la poblacin de inmunocomprometidos ha creado nuevos problemas por la aparicin de cuadros clnicos atpicos y la emergencia de nuevas cepas microbianas. El gran desarrollo de las tcnicas de diagnstico virolgico ha permitido ofrecer actualmente una ayuda directa al mdico clnico y ha facilitado la investigacin en salud, posibilitado su aplicacin en muchos campos. Actualmente el mdico clnico puede tratar con nuevos antivirales y controlar el curso de muchas infecciones virales, como SIDA, hepatitis B o C, etc. En el presente existe comercialmente una gran variedad de tcnicas que pueden implementarse en laboratorios clnicos, por lo que se requiere conocer sus caractersticas para seleccionar las de mayor aplicabilidad. El diagnstico definitivo requiere un anlisis de correlacin entre los antecedentes clnicos personales, familiares, epidemiolgicos y los resultados del laboratorio virolgico, considerando la oportunidad y calidad de la muestra, las propiedades de las tcnicas utilizadas y la experiencia acumulada al respecto. La conclusin final depende entonces de un trabajo profesional multidisciplinario, ms que de una cifra aportada por una moderna mquina automatizada. CtedradeMicrobiologa,ParasitologaeInmunologaFacultaddeMedicinaUNNE

DiagnsticoVirolgico

TOMADEMUESTRA El buen diagnstico empieza con una buenamuestra. La definicin del momento y forma de recoleccin, transporte y conservacin de la muestra son esenciales para el resultado del estudio. La recoleccin de la muestra debe considerar inicialmente dos factores: el sitio u rgano lesionado y el virus presuntamente responsable.Lasmuestrasmscomnmente usadas son las secreciones respiratorias, deposiciones, sangre y lquido cfaloraqudeo. Para aislamiento viral se precisa mantener la partcula viral viva, por lo que la forma de obtencin y manejo de la muestra es fundamental; frecuentemente se utilizan medios de transporte especiales y su traslado al laboratorio debe hacerse en fro (en hielo). Otras tcnicas de diagnstico viral no necesitan el virus vivo, pues se basan en la deteccin del virin o de sus componentes estructurales, cuya mayor estabilidad facilita la realizacin del estudio. La forma de conservacin de la muestra depende adems de la estructura del virus y del uso posterior de la misma. En general, los virus deben mantenerse en fro, a temperaturas entre +4 y 180 C; los virus con envoltura son ms lbiles (VRS, influenza, CMV, hepatitis B y C, etc.) y los procesos de congelacin y descongelacin disminuyen su viabilidad. Por esta razn, en general dependiendo del virus a estudiar, las muestras se pueden mantener unos pocos

DETECCINDELAGENTE. Sepuederealizardedistintasmaneras: Aislamiento viral. Los primeros huspedes biolgicosempleadosfueronlosanimalesde experimentacin. Actualmente su uso se ha limitado notablemente debido a las dificultades inherentes al trabajo con animalesyaldesarrollodecultivoscelulares. En ciertos laboratorios de diagnstico virolgico y de produccin de productos biolgicos, se utilizan lauchas en la propagacin del virus rbico para la produccin de la vacuna, en el diagnstico de arbovirus y en estudios epidemiolgicos de enterovirus; se pueden emplear una variedad de animales para la preparacin especfica de anticuerpos antivirus (policlonales o monoclonales) con distintos objetivos. Todava se propaga virus influenza en huevo embrionado, ms para obtencin del antgeno viral utilizado en la produccin devacunaqueparadiagnstico. Los cultivos celulares constituyen, desde 1950, el sistema ms empleado para el aislamiento y propagacin de la mayora de los virus. Los cultivos de clulas in vitro consisten en un sistema formado por clulas provenientes de un rgano o un tejido, normal o tumoral, mantenidas en medios de cultivodecomposicinqumicadefinidayen condiciones de temperatura, pH, atmsfera yhumedadcontroladas. Loscultivospuedenclasificarseentrestipos: 1. cultivoprimario

CtedradeMicrobiologa,ParasitologaeInmunologaFacultaddeMedicinaUNNE

MTODOSDEDIAGNSTICO Los mtodos de diagnstico viral se basan fundamentalmenteen: a) Deteccin del agente viral completo o de sus componentes: por aislamiento viral con observacin del efecto inducido por el virus vivopropagadoenunhuspedbiolgico;por visualizacin de la partcula viral total o parcial; por deteccin de sus componentes macromoleculares (antgenos virales o cido nucleicoviral). b) Deteccin de la respuesta inmune del husped mediante el estudio de anticuerpos antivirales(serologa).

das a 4 C y luego, si no se procesan, deben congelarse temperaturas entre 20 y 180 C. Los virus desnudos, como enterovirus, rotavirus, adenovirus, etc. se mantienen viablesporvariosaoscongeladosa20C. El estudio srico clsico requiere de dos muestras de sangre, una en la etapa aguda de la infeccin y otra en la convalecencia, generalmente con 2 a 4 semanas de intervalo entre ellas, para demostrar una seroconversin. Si se desea diagnosticar infeccin reciente (IgM) o antigua (IgG) se puede determinar el nivel del tipo de anticuerpos correspondiente en slo una muestradesangre.

DiagnsticoVirolgico

2. cepacelular 3. lneacelular dependiendo del origen y tiempo de sobrevidadelasclulasinvitro. Loscultivosprimariossepreparanapartirde tejidos normales, jvenes, que tienen un cariotipo normal y una capacidad de crecimiento in vitro limitada a 2 3 subcultivos (Ej: pulmn fetal humano, prepucio de recin nacido, amnios humano, etc.) y son ms difciles de obtener. En el otro extremo, las lneas celulares provenientes de tejidos tumorales, con cariotipos heteroploides, pueden subcultivarseenformacontnuaysonfciles de mantener in vitro (Ej: HEp2, Hela, Vero, RK, etc.). Las cepas celulares tienen una constitucin cromosmica normal y permiten20a50subcultivos(MCR5). No existe un cultivo celular susceptible a todos los virus, de modo que un laboratorio de diagnstico viral debe disponer de distintos cultivos celulares. Por ejemplo, el virus herpes simplex crece bien in vitro en cultivos primarios, cepas y lneas celulares (MRC5, RK, HEp2, HeLa, Vero u otras); en cambio, otro virus de la misma familia, el citomegalovirus (CMV) slo crece en cultivos primariosde pulmnfetal humanoo bienen algunas cepas celulares derivadas del mismo rganoyespecie(MRC5).Porotrolado,una lnea celular como HEp2 puede ser bastante sensible a adenovirus, VRS, parainfluenza, herpes simples, poliovirus y otros, pero no permitir el crecimiento de CMV, rotavirus, influenza, etc; adems, es posible que los pasajes sucesivos de una lnea la hagan disminuir su sensibilidad a algunos virus, comosucedeconHep2enrelacinaVRS. Algunos virus inducen un efecto citoptico viral (ECP) muy caracterstico en ciertos cultivos celulares, facilitando su diagnstico, comoHSV,VRS,adenovirus.Considerandoel cuadro clnico del paciente y el tipo de muestra y de cultivo celular usado, con las caractersticas y tiempo de aparicin del ECP se puede presumir una etiologa viral con ciertaseguridad.Sinembargo,sedebenusar tcnicas diagnsticas complementarias para identificar o precisar el agente viral. Por otra parte, hay virus que requieren cultivos celulares muy especiales (HIV, EBV, calicivirus, rotavirus, etc.) y otros para los cuales an no se dispone de un cultivo celular que permita su propagacin (papilomavirus, hepatitis B y C, etc), para los que se debe recurrir a otro tipo de tcnica diagnstica. Deteccindelapartculaviralcompleta La aplicacin de tcnicas de microscopia electrnica ha permitido observar la morfologa de la mayora de los virus que se conocen. En ciertos casos dicha morfologa es caracterstica (adenovirus, rotavirus, coronavirus) y permite la identificacin de la partcula viral, aunque habitualmente la observacin de su morfologa slo sugiere una familia o grupo viral. El uso de microscopa con tincin negativa mejora la visualizacin de las partculas virales presentes en una muestra. El empleo de la microscopa electrnica tiene algunas limitaciones, como la necesidad de una alta concentracin de partculas virales en la muestra, la disponibilidad de un microscopio electrnico y de un operador experimentado. Se puede mejorar este mtodo realizando inmunomicroscopa electrnica, en la cual se agregan anticuerpos especficos a la muestra que aglutinan y concentran los virus, haciendo ms fcil de visualizar y permitiendo identificar la partcula viral, pues la reaccin antgenoanticuerpoesespecfica. Deteccindecomponentes macromoleculares. 1. Deteccin de antgenos o protenas virales (inmunoanlisis). La metodologa se basa en la especificidad de la reaccin antgenoanticuerpo, que se evidencia de diferentes formas. Se requiere de una clara definicin del componente antignico del virus a investigar (interno o externo, estructural o temporal, completo o parcial, etc.), as como del tipo de anticuerpo a usar (monoclonal, policlonal, biosinttico, etc.).

CtedradeMicrobiologa,ParasitologaeInmunologaFacultaddeMedicinaUNNE

DiagnsticoVirolgico

CtedradeMicrobiologa,ParasitologaeInmunologaFacultaddeMedicinaUNNE

Las tcnicas de inmunodiagnstico permiten detectar la presencia de antgenos y/o de anticuerpos y pueden desarrollarse como mtodos directos o indirectos. En el mtodo directo el anticuerpo especfico tiene acoplado un marcador y slo se puede usar para detectar antgeno. En el mtodo el anticuerpo especfico indirecto (anticuerpo primario) no est marcado y la formacin del complejo antgenoanticuerpo se evidencia mediante un anticuerpo marcado anti anticuerpo primario (anticuerpo secundario conjugado); este mtodo puede emplearse para detectar tanto antgeno como anticuerpo. Se han desarrollado mltiples sistemas para optimizar el diagnstico basado en la reaccin antgeno anticuerpo, que implican la formacin de sandwiches con los diferentes reactantes. Unos mtodos, denominados de competencia, miden la variacin del resultado haciendo competir el anticuerpo en estudio con un anticuerpo conocido. Con frecuencia se adsorbe un anticuerpo especfico a una fase slida inerte, para capturar el virus o antgeno presente en la muestra y mejorar la sensibilidad o especificidad de la tcnica: mtodos de captura. Una forma simple de inmunodiagnstico la constituye la aglutinacin, fenmeno visible a simple vista similar a lo observado al determinar grupos sanguneos; esta reaccin se ha perfeccionado con la adsorcin de antgenos o anticuerpos a fases slidas (esferas de ltex, placas, hemates pretratados, etc.). Ej. rotavirus,rubeola. Elsistemausadoparamarcarlosanticuerpos define la denominacin de diferentes tcnicas. En el caso de la inmunofluorescencia (IF), el anticuerpo est conjugado con una molcula que emite fluorescencia bajo la estimulacin con luz de una longitud de onda determinada (ej.: isotiocianato de fluorescena, rodamina, ficoeritrina y otros). Tanto en la tcnica de ensayo inmunoenzimtico (ELISA) como en las inmunocitoqumicas, el anticuerpo va acoplado a una enzima (fosfatasa alcalina o peroxidasa) que reacciona con un sustrato

cromgeno, dando origen a un producto coloreado, que se detecta a simple vista o bien al microscopio ptico. El cambio de color se puede cuantificar midiendo la absorbancia en un espectrofotmetro. En la tcnica de radioinmunoanlisis (RIA) el anticuerpo est marcado con un elemento radioactivo y el complejo antgeno anticuerposedetectaenuncontadorgama. Estas tcnicas han tenido habitualmente el carcter de cualitativas, pues determinan la presencia de una reaccin especfica. Sin embargo se ha avanzado con el desarrollado de sistemas para cuantificar la cantidad de antgeno o anticuerpo, mediante uso de diluciones sucesivas de la muestra (HAI para influenza o rubeola), medicin de la intensidad de la reaccin (ej: ELISA cuantitativo) o el recuento de clulas infectadas positivas (ej: antigenemia para CMV). Actualmente se han desarrollado cientfica y comercialmente muchas tcnicas con variados sistemas de deteccin y de marcacin, para diagnosticar o tipificar muchos agentes; debe analizarse cuidadosamente la sensibilidad, especificidad, rapidez, costo, aplicabilidad, etc.deellasantesdedecidirsuuso. 2.Deteccindecidonucleicoviral. Hibridacin de cidos nucleicos. Esta tcnica se basa en la capacidad de las molculasdecidonucleicodeunahebrade reconocer, por apareamiento de bases, a hebras de cido nucleico que poseen secuencias nucleotdicas complementarias. La deteccin del hbrido puede realizarse usando sondas de cidos nucleicos marcadas.Haysondasradioactivasenquese visualiza la formacin del hbrido mediante una autorradiografa; otras sondas son biotiniladas, detectndose la formacin del hbrido mediante una reaccin inmunoqumica. Otras veces se detectan los hbridos por la diferente velocidad de migracin en geles de electroforesis (heteroduplex). Algunos ensayos se pueden realizar por la tcnica de hibridacin en

DiagnsticoVirolgico

Esta tcnica, diseada para hebras de DNA, puede aplicarse a virus RNA (RTPCR). Primero se hace una transcripcin del RNA viral extrado de la muestra a DNA mediante una transcriptasa reversa y luego se usa esta hebra resultante (cDNA: DNA copia) como molde para la reaccin de PCR. Por otro lado, se han desarrollados sistemas de PCR

Deteccindeanticuerposantivirales. Las infecciones virales recientes o pasadas delindividuosepuedenestudiarmediantela determinacin de anticuerpos de tipo IgM o IgG respectivamente. La susceptibilidad frente a determinadas infecciones tambin puede medirse determinando niveles de anticuerpos sricos. Para documentar una seroconversin se requiere tomar dos muestras de sangre: la primera en la etapa aguda de la enfermedad y la segunda, por lo menos 15 das despus. Un alza de 4 o ms veces del ttulo inicial de anticuerpos o una variacin de negativo a positivo sealan infeccin reciente por el agente en estudio. Semejante criterio de significancia puede usarse tambin para comparar los niveles de IgG de la madre en relacin al recin nacido. La clara seleccin del antgeno contra el cual se dirigen los anticuerpos superficiales, profundos, estructurales, temporales, enzimas, epitopes especficos o comunes de grupos, etc. permitir avanzar en el diagnstico y control evolutivo de algunas virosis, como SIDA, hepatitis, mononucleosis infecciosa,etc. Las tcnicas serolgicas han experimentado ungranavanceenlosltimosaos,yparasu mejor comprensin se har una descripcin

CtedradeMicrobiologa,ParasitologaeInmunologaFacultaddeMedicinaUNNE

filtro, que emplea como soporte un filtro de nitrocelulosa sobre el cual se realiza la reaccin. La hibridacin in situ se realiza en un corte de tejido o sobre una monocapa de cultivocelular. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Esta tcnica permite la amplificacin in vitro de secuencias especficas de DNA existentes en una muestra en nmero de decenas a niveles de millones de copias en pocas horas, permitiendo posteriormente de detectar dichas secuencias mediante hibridacin de cidos nucleicos o electroforesis. La primera fase de la reaccin consiste en extraer y purificar el cido nucleico de la muestra; luego se agregan partidores o secuencias de oligonucletidos que hibridan especficamente con regiones homlogas del DNA viral, los nucletidos y otros reactivos; al final se pone una DNA polimerasa, llamada Taq polimerasa, aislada desdelabacteriaThermophilusaquaticus.La reaccin se realiza en ciclos de tres diferentes temperaturas que permiten sucesivamente la separacin de las hebras de DNA, el apareamiento de los cebadores o primersylasntesisdelasnuevashebraspor accin de la polimerasa. Se genera as un nmero creciente de copias que entran al ciclo siguiente, de modo que al cabo de 30 ciclos se generan millones de copias de la secuencia de nucletidos virales original. De estamanera,unaregindelDNAviralpuede ser amplificada cientos o miles de veces, dependiendo del nmero de ciclos utilizado. En una tercera etapa, el fragmento amplificado se visualiza mediante electroforesis y tincin con bromuro de etidio o nitrato de plata, o bien mediante hibridacin con una sonda especfica para el productoamplificado.

cuantitativo que permiten medir la carga viral, de gran utilidad en el seguimiento de afecciones como SIDA, CMV, hepatitis C, etc. En los nuevos sistemas de PCR en tiempo real el DNA producto de la PCR se puede ir midiendo a medida que se acumula, acortndose el tiempo de reaccin y hacindose al sistema ms finamente cuantitativo. La tcnica de PCR ha experimentado un desarrollo y aplicabilidad muyacelerados,graciasasualtasensibilidad y a la condicin de no requerir agente infeccioso vivo. Sin embargo, su implementacin requiere de infraestructura fsica y personal muy especializados. Actualmente se han desarrollado PCR para diagnosticar y caracterizar la mayor parte de los virus conocidos y se considera una gran herramienta para estudio molecular de agentesvivos.

DiagnsticoVirolgico

CtedradeMicrobiologa,ParasitologaeInmunologaFacultaddeMedicinaUNNE

considerando primero las clsicas y luego las ms recientes. El uso y la vigencia de las mismas depende de los objetivos del estudio, de los modelos virales involucrados y de las disponibilidades tcnicas y comercialesdeellas. Tcnicasserolgicasclsicas. El objetivo de estas tcnicas es detectar la respuesta inmune humoral del husped (anticuerpos). Su fundamento es la formacin de un complejo antgeno anticuerpo virus y suero del paciente que puede demostrarse por diversos procedimientos. 1. Reaccin de neutralizacin. Se basa en la prdida de la capacidad infectiva de un virus al unirse al anticuerpo especfico, formando un complejo antgenoanticuerpo. Estos complejos no infectivos se pueden detectar inoculando la mezcla en un husped vivo, animales de experimentacin o en cultivos celulares, donde no produce efecto pues la capacidad infectiva del virus ha sido neutralizada por los anticuerpos del paciente. Por el contrario, en ausencia de anticuerpos especficos no se forma el complejo, el virus mantiene su capacidad infectiva y es capaz de producir un efecto biolgico caracterstico en el husped. Esta tcnica tambin permite definir los serotipos virales, pues la reaccin de neutralizacin refleja el grado de inmunidad del husped frente al agente especfico ( Ej. 3 serotipos de virus polio, 51 serotipos de adenovirus, 1 serotipo de rubola, etc). Por esto, generalmente se considera como tcnica de referencia para metdicas que miden anticuerpos. Sin embargo, es una tcnica sofisticada, pues requiere de un laboratorio con capacidad de mantener huspedes vivos y la reaccin demora varios das,eltiempoquetardaelvirusenproducir unefectodemostrable. 2. Reaccin de inhibicin de la hemaglutinacin.Sebasaenlaprdidadela capacidad hemaglutinante de un virus al formarse el complejo antgenoanticuerpo. Se utiliza en el diagnstico de virus con capacidad de aglutinar glbulos rojos

(influenza, rubola, sarampin, etc.), que al unirse a los anticuerpos especficos pierden esta propiedad. Esto se demuestra haciendo reaccionar la mezcla de antgeno con anticuerpos (suero del paciente) con glbulos rojos, los que no se unen y sedimentan formando un botn o punto; en ausencia de anticuerpos especficos se expresa la propiedad hemaglutinante del virus, que se visualiza por la formacin de una malla de aglutinacin en el tubo o pocillo en que se realiza la reaccin. Esta tcnica se hace en microplacas de plstico en forma manual y demora 3 a 5 horas en dar resultados. Actualmente se usa principalmente en diagnstico y caracterizacin de virus influenza. Los anticuerpos inhibidores de la hemaglutinacin tienen buena correlacin con los neutralizantes en reflejar nivel de inmunidad, y su medicin es ms sencilla ( ej.sarampin,rubola) 3.Reaccindefijacindelcomplemento.En esta tcnica el complejo virusanticuerpo especfico debe competir por captar complementoconotrosistema,formadopor glbulos rojos de cordero sensibilizados con hemolisina (anticuerpo antiglbulos rojos de cordero). Si en la primera reaccin se forma el complejo antgenoanticuerpo, se consume o fijael complemento que hay en el medio y al agregar los glbulos rojos sensibilizados no se produce la hemlisis porque no hay complemento libre y los eritrocitos sedimentan al fondo del tubo o pocillo formando un botn. En cambio, si no se forma el primer complejo, el complemento queda libre, se une a los glbulos rojos sensibilizados y los lisa. Esta tcnica es relativamente compleja, pues usa muchos reactivos, los que deben estar debidamente estandarizados. Su sensibilidad y especificidad no son muy altas y han sido superadas por otras tcnicas. Los anticuerpos fijadores del complemento duran slo algunos aos despus de la infeccin, de modo que son indicadores de unprocesoreciente.

DiagnsticoVirolgico

CtedradeMicrobiologa,ParasitologaeInmunologaFacultaddeMedicinaUNNE

Otrastcnicasserolgicas Muchas de las mismas tcnicas descritas para deteccin de antgenos se pueden usar para determinar anticuerpos: aglutinacin, inmunodifusin radial, ELISA, IF, RIA, etc. Debe destacarse que algunas pueden medir IgG o IgM en forma diferencial y es una de lasformasdehacerundiagnsticorpidode una infeccin reciente. En efecto, la respuesta inmune primaria se caracteriza por un alza de IgM, seguida de un aumento de IgG, a diferencia de la secundaria que es casi exclusivamente por IgG. Luego, la demostracin de IgM especfica contra un virus sugiere una infeccin reciente, hecho que debe valorarse cuidadosamente por la existenciafrecuentedefalsospositivos. 1. Western blot. Este mtodo permite evidenciar la reactividad de un suero frente a antgenos virales que han sido inmovilizadasenunamatrizdenitrocelulosa. Para ello una vez purificadas las partculas virales, se separan las protenas de acuerdo a su peso molecular mediante electroforesis en un gel de acrilamida y las bandas se transfieren a un papel de nitrocelulosa que sirve como soporte de la reaccin. Las muestras de sueros a ensayar se incuban sobre el papel y los anticuerpos especficos se unirn a las protenas virales ancladas.

Como en otros tipos de tcnicas serolgicas indirectas, se agrega posteriormente un anticuerpo antianticuerpo humano conjugado con una enzima y luego un sustrato cromgeno que reacciona con la enzima. La aparicin de bandas coloreadas en el papel indica la presencia de complejos de anticuerpos unidos a protenas virales especficas. Esta tcnica se usa , por ejemplo, para la deteccin de anticuerpos antiHIV y anti HTLVI; actualmente se dispone comercialmente de kit diagnsticos que se emplean para la confirmacin de resultados positivosobtenidosporELISA. 2. Radioinmunoprecipitacin (RIPA). Esta tcnica permite detectar la unin de anticuerpos especficos presentes en el suero del paciente dirigidos contra protenas virales que contienen un aminocido marcado radioactivamente (35Scistena o 35Smetionina). El complejo antgeno anticuerpo formado precipita por la adicin de protena A sefarosa que se une a la fraccin constante de las inmunoglobulinas. Mediante el uso de calor y agentes denaturantes se rompe el complejo, se separan los componentes en una electroforesis y las bandas de los antgenos, precipitados por los anticuerpos especficos, serevelanenunaplacaradiogrfica.

DiagnsticoVirolgico

MTODOSDIAGNSTICOSCOMNMENTE UTILIZADOSPARADISTINTOSVIRUS A. VirusDNA 1. HSV Aislamiento viral (cultivo viral). El herpesvirussimpleesunodelosmssensillo de cultivar y usualmente toma 2 o 3 das en aparecer el caracterstico efecto citoptico viral(ECV). Inmunofluorescencia directa (ID)* de las clulas recogidas por hisopado o raspado de laslesionesvesiculares. Serologa: La infeccin primaria puede ser diagnosticada por una elevacin de ttulos de anticuerpos IgG o la deteccin de anticuerpos IgM. La recurrencia puede no estar asociada con elevacin del ttulo de anticuerpos totales o una respuesta de IgM. Los mtodos disponibles incluyen: reaccin de fijacin del complemento (FC) prcticamenteendesusoreaccionesde neutralizacin (RN)*, ELISA* e Inmunofluorescenciaindirecta(IFI)*. Biologa Molecular: en caso de infecciones en el sistema nervioso central puede utilizarse la Reaccin en cadena de la Polimerasa (PCR) como diagnstico de certeza. 2. VZV Aislamientoviral.Esunvirusdifcil de aislar por su labilidad. El fluido tomado de las vesculas debe ser inoculado lo ms rapidamenteposible. ID* de las clulas recogidas por hisopado o raspadodelaslesionesvesiculares. Serologa:IFI*yELISA*. 3. CMV Aislamiento viral. El cultivo convencional demora 2 a 4 semanas en mostrar el ECV. El cultivo rpido (Shell vial) puede arrojar resultadospositivosalas48hs. Test de antigenemia: se basa en la deteccin de protenas de expresin temprana del virus en los neutrfilos. Es una metodologa semicuantitativa, predictiva de laseveridaddelainfeccin. PCR para DNA viral: es ms utilizada en el diagnstico de infecciones congnitas y en afeccionesdelSNC. Serologa: FC (muy poco utilizada), ELISA*, aglutinacinenlatex(AL)*eIFI*. 4. EBV Aislamientoviral. PCR e hibridacin Molecular : pueden ser utilizadas para demostrar la presencia de DNAviralenbiopsias. Serologa: pueden detectarse anticuerpos antiVCA (antgenos de la cpside viral), anti EA (antgenos tempranos) y antiEBNA (antgenos nucleares) mediante IFI* y ELISA*. 5. Adenovirus Aislamiento viral. Demora entre 2 a 7 das. La identificacin en el cultivo se realiza con ID y la tipificacin con ensayos de neutralizacin. ID*deaspiradosnasofarngeos. Serologa: test de inhibicin de la hemoaglutinacin (HAI), test de microneutralizacin.tipoespecficos. 6. Papilomavirus PCR de hisopados o cepillados exo endocervicalesparadeteccndelADNviral. TcnicasdehibridacinMolecular. 7. HBV Serologa: ELISA*, aglutinacin con ltex*, RIA, Inmunoblot*. Se determinan anticuerposyantgenosviralesquepermiten identificar la fase de la enfermedad y pronosticarlaevolucin (Anticuerpo y antgeno de superficie, antgenoe,anticuerposparacoreviral) PCR: para determinar presencia de DNAviral.

CtedradeMicrobiologa,ParasitologaeInmunologaFacultaddeMedicinaUNNE

DiagnsticoVirolgico

B. VirusRNA 1. Enterovirus Aislamiento viral: se utilizan distintas lneas celulares segn sea un Poliovirus, Coxsakie A,CoxsakieBounEchovirus. Serologa:RN*,HAI,ELISA*. PCR: se est difundiendo su utilizacin para loscasosdemeningitisporenterovirus. 2. VirusInfluenza Aislamientoviral. ID* Serologa:HAI,ELISA*. 3. VirusParainfluenza Aislamientoviral. ID*. ELISA*. 4. Virusdelaparotiditis Aislamiento viral. Se caracteriza por la formacin de sincicios. La identificacin en cultivo se realiza por ID y/o inhibicin de la hemadsocin. Serologa:HAI,IFI*yELISA*. PCRencasodeencefalitis. 5. Virusdelsarampin Aislamientoviral. Deteccin directa: las tpicas clulas multinucleadas gigantes pueden observarse en forma directa por microscopa de secreciones nasofarngeas o hisopados conjuntivales. Serologa:HAI,IFI*,ELISA*. 6. VSR Aislamientoviral. ID*deaspiradonasofarngeo. Serologa:ELISA*. 7. Arbovirus Aislamientoviral ID para detectar antgenos virales en los tejidos. Serologa:IFI,ELISAyRN. 8. HIV Serologa:ELISA*,alutinacinenltex*, inmunoblot*,RIA*,westernblot*(ensayo confirmatorio) PCR*:paradiagnsticoyconfirmacin. 9. HAV Serologa:ELISA*,inmunoblot*. 10. HCV Serologa: ELISA*, inmunoblot*, westernblot*(confirmatorio). PCR*:paraconfirmacinygenotipificacin. Nota:*Mtodosmsutilizados

CtedradeMicrobiologa,ParasitologaeInmunologaFacultaddeMedicinaUNNE

DiagnsticoVirolgico

10

CUESTIONARIOORIENTADOR

CtedradeMicrobiologa,ParasitologaeInmunologaFacultaddeMedicinaUNNE

1. Describadossituacionesenqueeldiagnsticoclnicoseasuficienteycuatroenquese requieradiagnsticodelaboratorioparaconfirmarunaetiologaviral. 2. Sealetresfactoresimportantesdeconsiderarenlatomadelamuestraparaun aislamientoviralyparaunadeterminacindeanticuerpossricos. 3. Mencionealgunosusosactualesdeanimalesdeexperimentacinenvirologa. 4. Crecentodoslosvirusenlosmismoscultivoscelulares? 5. Cmosepuededeterminarlapresenciadeunvirusenuncultivocelular?Essiempre necesarioconfirmarelagentesospechadoconotraprueba? 6. Quesmsimportante:detectarvirusvivosocomponentesvirales? 7. Mencioneventajasydesventajasdeldiagnsticopormicroscopaelectrnica 8. Hagaunesquemasimpledeunatcnicadeinmunodiagnsticodirecta. 9. Hagaunesquemasimpledeunatcnicadeinmunodiagnsticoindirecta. 10. Expliquelosfundamentosdelatcnicadehibridacindecidosnucleicos. 11. SealelascaractersticasdelatcnicadePCRquelahanhechorecomendablepara deteccindemuchosvirus. 12. Quotrastcnicaspuedenutilizarseeneldiagnsticoserolgico?Mencioneejemplosde usofrecuente. 13. CmodemuestraUd.unainfeccinviralreciente?