La cromatografia y sus aplicaciones

Bibliografa de consulta: Cromatografia sobre papel y capa fina. Electrofresis. (I. Smith y . !einberg" #uimica $naltica Cualitati%a. (Burriel" &nculos 'eb en Internet Qu es la cromatografia? Es la tcnica m(s desarrollada en los )ltimos a*os+ empleada en la ,umica analtica. Su empleo presenta notables %enta-as: .. Es sencilla+ r(pida y no re,uiere aparatos complicados. /. $barca escalas microanalticas hasta escalas industriales. 0. Es una tcnica poco o nada destructi%a ,ue puede aplicarse a sustancias l(biles. Constituye una metodologa imprescindible en estudios bio,umicos+ to1icol2gicos+ estructurales+ etc. 3o solo utili4ando como tcnica de separaci2n e identificaci2n+ sino como mtodo preparatorio+ incluso a escalas industriales. La palabra cromatografia pro%iene de 5romatos+ color y graphos+ escrito. 6na de las definiciones de la tcnica m(s correcta seria+ la dada por 7eulemans : "Mtodo fsico de separacin en el que los componentes a separar se distribuyen en dos fases, una de las cuales constituye un hecho estacionario de gran desarrollo superficial y la otra un fluido que pasa a traves o a lo largo del lecho estacionario (fase mvil) " En todo proceso cromatografico la fase m2%il es la ,ue pro%oca un mo%imiento de las distintas especias para ,ue abandonen el medio soporte+ y la fase estacionaria la ,ue suministra el efecto retardador+ selecti%o para cada componente+ ,ue condiciona ,ue cada uno de ellos se desplace con distinta %elocidad. CLASIFICACION DE LOS METODOS CROMATO RAFICOS! Son clasificados seg)n el estado fsico de la fase+ el mecanismo de separaci2n y el tipo de soporte. La fase m2%il puede ser un gas o un l,uido+ y la estacionaria u l,uido o un s2lido. Se pueden establecer cuatro tipos de cromatografia: gas8l,uido+ l,uido8l,uido+ gas8s2lido+ l,uido8s2lido. Los mecanismos por los ,ue los diferentes componentes son separados en los procesos cromatograficos son %ariados. En algunos casos participan m(s de un mecanismo en un mismo proceso de separaci2n por lo ,ue dificulta la

clasificaci2n. Los principales mecanismos ,ue inter%ienen en la separaci2n cromatografica son: !dsorcin: 9ases o l,uidos contenidos en la fase m2%il son retenidos por una adsorci2n selecti%a en la superficie del s2lido ,ue constituye la fase estacionaria. En la interfase s2lido8fase m2%il hay un aumento de concentraci2n respecto a la inicial. Este mecanismo controla la cromatografia gas8s2lido y l,uido8s2lido. "eparto: Los componentes de la fase m2%il son retenidos por la fase estacionaria li,uida en funci2n de su solubilidad en ella. Si las dos son li,uidas se tiene un proceso de e1tracci2n en continuo. #ntercambio #onico: La fase estacionaria constituida por un s2lido intercambiando iones con iones contenidos en la fase m2%il+ li,uida. El intercambio de iones s2lido8soluci2n esta regulado por la afinidad ,uimica de los iones con ambas fases y por sus respecti%as concentraciones. $ama%o Molecular: Especies neutras de alto peso molecular pueden ser separadas en %irtud de su tama*o donde la fase estacionaria es un gel hidrofilico altamente poroso ,ue retiene las molculas de menor tama*o al de los poros. Las molculas de mayor tama*o son retardadas en su paso por pe,ue*as fuer4as de adsorci2n de la superfie e1terna del gel ,ue luego son e1cluidas de la fase estacionaria. Migracin &lctrica: Los componentes i2nicos de una muestra son separados por su diferente %elocidad y sentido con ,ue se despla4an en un campo elctrico. La fase estacionaria puede ser un papel saturado por un electrolito. La aplicaci2n de un campo pro%oca un mo%imiento diferencial de los iones dependiendo de su carga y de su mo%ilidad ionica. CROMATOGRAFIA EN PAPEL Qu es la cromatografia e" #a#el? La cromatografia en papel es la tcnica de separaci2n e identificaci2n de sustancias ,umicas mediante un disol%ente ,ue se mue%e sobre ho-as o tiras de papel de filtro. Se toma una pie4a de papel de filtro y cerca de uno de sus e1tremos se deposita una gota de la soluci2n ,ue contiene la me4cla de las sustancias ,ue se ,uieren separas. Se de-a secar la gota y ,uedara la mancha de las sustancias me4cladas. El e1tremo del papel mas pro1imo a la mancha se introduce en un disol%ente apropiado+ pero sin ,ue la mancha llegue a introducirse en l. E1isten muchos tipos de cromatografia sobre papel+ una primera di%isi2n de las %ariadas clases podra ser: .8 'romatografia ascendente: el disol%ente se encuentra en el fondo del recipiente ,ue sostiene al papel y %a subiendo a tra%es de el por capilaridad /8 'romatografia descendente: el disol%ente esta en un recipiente esta en un recipiente del ,ue cuelga el papel+ fluye por l hacia aba-o por una combinacion de capilaridad y gra%edad.

En ambos casos el disol%ente a%an4a a lo largo del papel pasando por encima de la mancha+ al a%an4ar disuel%e y arrastra las sustancias de la mancha+ cada una de ellas se mue%e+ por lo general a distinta %elocidad ,ue las otras. Se de-a actuar el disol%ente un tiempo determinado+ se seca el papel y se obser%an las sustancias separadas si tienen color+ o en caso de no tener color se procede al re%elado por una reacci2n ,uimica apropiada. Esta tcnica se conoce como cromatograf:a monodimencional y el papel resultante recibe el nombre de cromatograma monodimencional.

La resulta"te $e las fuer%as! Cuando el disol%ente a%an4a sobre las manchas de las sustancias+ comien4an a actuar dos tipos de fuer4as opuestas: unas ,ue arrastran y otras ,ue retardan. Las fuer4as propulsoras act)an apartando las sustancias de su punto de origen y desplasandolas en direcci2n del flu-o de origen. Las fuer4as retardantes tratan de impedir el mo%imiento de las sustancias+ lle%(ndolas fuera del disol%ente ,ue fluye y hacia atr(s en el papel. La distancia recorrida por cada sustancia a partir del origen+ en un tiempo dado+ es la resultante de estas dos clases de fuer4as. Fuer%as #ro#ulsoras! Cuando se reali4a un cromatograma en papel+ las fuer4as propulsoras m(s importantes son: el flu(o de disolvente y la solubilidad de cada sustancia en le disol%ente. )lu(o del disolvente:

Si la sustancia cromatografiada fuera completa e instant(neamente soluble en el disol%ente ,ue a%an4a+ por e-emplo agua y a4)car+ y no actuaran fuer4as de retardo la sustancia ascender( desde el origen hasta donde llega el diluyente. En cambio si la sustancia fuera completamente insoluble en el disol%ente en mo%imiento no se mo%era del origen. La corriente del disol%ente es la misma para todas las sustancias de la mancha+ as pues+ si el disol%ente fuese capa4 de disol%er instant(nea y completamente todas las sustancias+ estas a%an4aran -untas hasta el final de la trayectoria del disol%ente y terminaramos donde empe4amos con todas las sustancias -untas. *olubilidad: 6na fuer4a diferencial es+ en efecto+ la solubilidad. ;ocas son las sustancias ,ue ofrecen la misma solubilidad en cual,uier disol%ente. La particular solubilidad de una sustancia en la corriente del disol%ente es una fuer4a propulsora ,ue tiende a despla4arla+ manteniendola en mo%imiento a lo largo del papel. Fuer%as retar$a"tes! <ay tambin dos fuer4as retardantes principales: la adsorci2n y el reparto. !dsorcin: La celulosa de la ,ue esta hecho el papel de filtro+ posee propiedades adsorbentes. Las sustancias depositadas en el papel+ en cromatografa+ pueden ser m(s o menos adsorbidas en el papel. La adsorci2n es otra de las fuer4as diferenciales+ esto significa ,ue unas sustancias son adsorbidas m(s ,ue otras y+ por consiguiente+ la liberaci2n de las sustancias de las manchas %ariar( de una sustancia a otra. Esto contribuye de nue%o a la separaci2n. =ientras ,ue se %a reali4ando el cromatograma+ las sustancias mas fuertemente adsor%idas se %an ,uedando atr(s+ mientras ,ue las adsor%idas con menos fuer4a a%an4an hacia el frente. "eparto: La cormatografia se basa+ en una medida considerable+ en la presencia de dos fases li,uidas indi%iduali4adas. 6na de ellas es la corriente del disol%ente circulando por el papel de filtro. La otra es la fase acuosa contenida en el mismo papel de filtro. 6na ho-a de papel de filtro aparentemente seca contiene entre un > y ./? de agua firmemente adherida a la celulosa. $,u es donde entra en funci2n el reparto. Cuando una sustancia ,ue es soluble en dos disol%entes no me4clados es e1puesta al mismo tiempo a ambos+ se repartir( entre ellos. La cantidad ,ue se encuentre en cada disol%ente depender( de la relati%a solubilidad del soluto en cada uno. El grado de reparto+ una %e4 conseguido el e,uilibrio+ se llama coeficiente de reparto o ra+on de distribucin Co"sta"te Rf! El )ltimo punto alcan4ado por el disol%ente en su a%ance se denomina frente del disol%ente. ;uede usarse como punto de referencia para e1presar las distancias relati%as recorridas por las diferentes sustancias en un cromatograma. El smbolo utili4ado para designar esta distancia relati%a es @f y se define mediante:

distancia recorrida por el compuesto desde el origen @f A Bistancia del origen al frente del disol%ente Como el denominador es siempre mayor ,ue el numerador en @f debera ser un decimal. ;or ra4ones de con%eniencia se suele e1presar como un porcenta-e. $si un @f de CD indicara ,ue el compuesto a%an4o la mitad de la distancia del frente del disol%ente. Cromatograf&a $e a$sorci'" e" colum"a La fase estacionaria est( constituida por un s2lido ,ue se empa,ueta en una columna+ normalmente de %idrio. Los componentes a separar se a*aden en forma soluble por la parte superior de la columna+ ,uedando retenidos en la misma. ;osteriormente los componentes se despla4an arrastrados por una fase m2%il l,uida. Bependiendo de la absorci2n selecti%a de cada uno de ellos por la fase estacionaria se despla4an a distinta %elocidad+ efectu(ndose la separaci2n. ;ara ,ue haya una separaci2n efecti%a de los componentes+ su %elocidad a tra%s de la columna debe ser suficientemente diferente y la longitud de la columna+ adecuada. ;or e-emplo+ si por una columna con al)mina como absorbente se introduce una disoluci2n conteniendo nitratos de !e (III"+ Cu (II" y Co (II" y posteriormente se pasa agua ligeramente acidulada con (cido ntrico se obser%a la separaci2n de tres 4onas diferenciadas (de arriba aba-o" pardo8 ro-i4a de !e (III"+ a4ul de Cu (II" y rosa de Co (II". Si se desean apreciar me-or las distintas bandas se puede introducir una soluci2n de ferrocianuro pot(sico como re%elador. Se obser%an entonces coloraciones m(s intensasE a4ul oscuro de !eF G!e (C3">H0+ pardo8 ro-i4a de Cu/ G!e (C3" >H y %erdosa de Co/ G!e (C3" >H. a) !n,lisis frontal.8 Supongamos una disoluci2n conteniendo tres componentes $+ B y C+ ,ue se introduce continuamente en una columna en la ,ue la adsorci2n sigue el orden C+ B+ $. La especie menos adsorbida+ $+ emerge la primera por la parte inferior de la columna+ y sigue saliendo indefinidamente. Bespus de un perodo en ,ue s2lo sale $+ comien4a a salir tambin B+ obteniendo una me4cla $ I B. !inalmente sale el componente m(s retenido C+ -unto con $ y B. b) !n,lisis por despla+amiento .8 La me4cla a ser separada se absorbe en una pe,ue*a 4ona en la parte superior de la columna. ;osteriormente se introduce un disol%ente (o una disoluci2n" ,ue sea m(s fuertemente absorbido ,ue cual,uiera de los componentes. El efecto resultante es ,ue los componentes son despla4ados de la columna por el disol%ente8 despla4ante y+ adem(s+ cada uno de ellos despla4a al inmediatamente menos absorbido. $ la salida de la columna %an saliendo consecuti%amente todos los componentes y el despla4ador+ separados pero uno -unto al siguiente.

c) !n,lisis por elucin.8 Bespus de fi-ar los componentes en la parte superior se pasa un disol%ente puro ,ue no se adsorbe. Los componentes %an a%an4ando por la columna dependiendo de la fuer4a con ,ue son adsorbidosE cada uno de los cuales es distribuido en una pe,ue*a 4ona. Si la columna es suficientemente larga y los %alores de @f difieren bastante+ se puede lograr la separaci2n de me4clas bastante comple-as. En la !ig. &III8./ se muestra un cromatograma desarrollado por este mtodo. Cada componente puede ser recogido y anali4ado a la salida de la columna. A$sor(e"te ) elu)e"tes Son muchos los s2lidos ,ue se han utili4ado como fase estacionaria en cromatografa de adsorci2n. Los m(s importantes son al)mina+ silicato de aluminio+ silicagel+ 21ido+ silicato y carbonato de magnesio+ 21ido+ carbonato y fosfato de calcio+ como inorg(nicosE y carb2n+ almid2n y a4)cares como org(nicos. 3ormalmente deben ser sometidos a un proceso trmico de acti%aci2n superficial antes de su utili4aci2n. Como eluyentes se utili4an agua+ alcoholes+ cetonas+ steres+ cloroformo+ tetracloruro de carbono+ etc. Su capacidad de eluci2n depende de su polaridad+ del absorbente y de las especies a eluir. Cromatograf&a $e re#arto e" colum"a Esta tcnica es seme-ante a la mencionada anteriormente en cuanto a materiales utili4ados+ mtodos operati%os+ etc. La diferencia reside en la fase estacionaria utili4ada y+ en consecuencia+ en el mecanismo de separaci2n. En cromatografa de reparto la fase estacionaria es un l,uido+ poco miscible con la fase m2%il. Los solutos se distribuyen entre las dos fases dependiendo de su solubilidad en cada una de ellas+ es decir+ seg)n su coeficiente de reparto. $un,ue el mecanismo fundamental de la separaci2n es la e1tracci2n o reparto+ es pr(cticamente imposible e%itar adsorciones por parte del s2lido soporte+ por lo ,ue muchas de las separaciones son empricas+ no pudiendo reali4arse un e1acto tratamiento te2rico. Los s2lidos soportes m(s utili4ados son el silicagel+ el pol%o de celulosa y la tierra de diatomeasE menos aplicaci2n tienen el almid2n y el relleno de bolas de %idrio. Cromatograf&a so(re geles #orosos Es un tipo de cromatografa ,ue se aplica+ fundamentalmente+ a la separaci2n de productos macromoleculares sobre geles hinchables por agua o por cual,uier otro l,uido pre%iamente escogido. El fundamento de este tipo de cromatografa consiste en ,ue al hincharse el gel ,ueda una cadena muy abierta con grupos terminales generalmente polares ,ue son capaces de adsorber agua u otros disol%entes polares. Seg)n el n)mero de ligaduras entre las grandes cadenas e1iste un tama*o crtico (lmite de e1clusi2n" de molcula ,ue puede entrar en el interior del gel+ mientras ,ue las
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molculas de mayor tama*o pasar(n a tra%s del mismo+ con lo ,ue+ en principio+ se origina una separaci2n de molculas de acuerdo con su diferente tama*o. El fen2meno puede considerarse como una filtraci2n a tra%s de un tami4 molecular y por eso a esta tcnica se la llama tambin -cromatografa con tami+ molecular. (ctm"E as mismo se la ha denominado+ /enetracin sobre gel, e0clusin molecular y tami+ado molecular. Cromatograf&a $e ca#a fi"a La llamada Jcapa finaK consiste en una placa de %idrio+ rectangular o cuadrada+ denominadas cromatoplacas+ o simplemente placas sobre cuya superficie se deposita una capa uniforme muy delgada (en ocasiones de algunas micras de espesor" de una substancia absor%ente+ casi siempre silicagel o al)mina+ en condiciones tales ,ue resulte uniformemente e1tendida y suficientemente adherida. En general+ de hace una papilla acuosa con el adsorbente+ ,ue se deposita sobre la placa mediante un aplicador adecuado. Las placas se secan en estufa para acti%ar la superficie del adsorbente y se encuentran aptas para efectuar la cromatografa. $ las %enta-as de resistencia a la temperatura y a los reacti%os agresi%os de la cromatografa en capa fina+ hay ,ue a*adir una mayor nitide4 y sensibilidad de los cromatogramas+ as como una mayor rapide4 en su desarrollo. $dem(s+ los cromatogramas obtenidos pueden conser%arse indefinidamente y archi%arse si se pul%eri4a la placa re%elada con una dispersi2n de un pl(stico transparente y especial donde ,uede grabado el cromatograma sobre la pelcula endurecida del pl(stico+ ,ue se separa f(cilmente del soporte. Las aplicaciones son seme-antes a las de la cromatografa de papel. Electroforesis El fundamento de la tcnica consiste en depositar sobre un medio poroso una me4cla de especies cargadas (algunas pueden ser neutras". ;or aplicaci2n de un campo elctrico entre los e1tremos del soporte poroso las especies se separan en funci2n de su carga y su mo%ilidad i2nica en ese medio. ;ara fa%orecer el paso de la corriente se utili4an disoluciones fondo conductoras (electrolitos"+ ,ue son generalmente disoluciones reguladoras en las ,ue se empapa pre%iamente el soporte poroso+ debidamente escogidas para ,ue no formen precipitados con las especies del problema. Como soportes se han utili4ado al)mina+ lana de %idrio+ almid2n+ agar8 agar+ gel de silice+ etc. tanto en columna como en capa fina+ pero ,ui4(s el mtodo m(s utili4ado es el ,ue emplea como soporte papel. Se suelen utili4ar tiras de acetato de celulosa+ casi transparentes+ ,ue por poseer una estructura m(s uniforme y un poro menor ,ue el del papel filtro+ tienen un mayor poder de resoluci2n. $ estas %enta-as del acetato de celulosa se a*ade su f(cil solubilidad en (cidos+ lo ,ue facilita la posterior determinaci2n de las especies separadas. La emigraci2n de las distintas especies en el papel depende de la magnitud y signo de su carga+ del tama*o de la partcula+ de las propiedades adsorbentes del

soporte (,ue deben atenuarse en lo posible"+ del %olta-e aplicado y de la intensidad de corriente. CROMATO RAFIA DE ASES

Esta tcnica es similar a la cromatografia de columna+ con la diferencia de ,ue el sistema es cerrado y la fase m2%il es un gas. La separaci2n de los componentes gaseosos se produce por adsorci2n selecti%a sobre un s2lido (C.9.S." o por reparto entre un gas inerte y un l,uido no %ol(til ,ue constituye la fase estacionaria (C.9.L.". En la actualidad esta tecnica (C.9.L." es la m(s empleada+ aplicandose el analisis de gases o de l,uidos y s2lidos ,ue puedan %olatili4arse a temperatura no superior a FDDLC. L C.9.S. es an(loga a la C.L.S. Los componentes del gas problema son sostenidos selecti%amente por un s2lido absorbente dispuestos en columna met(lica+ recta o en espiral. El gas problema es inyectado en la corriente de un gas inerte ,ue le conduce hasta la columna y ,ue hace la fase m2%il. En la distribuci2n de los componentes del problema entre el gas portador y el s2lido absor%er%ente se %erifica una separaci2n por lo ,ue emergen de la columna a distintos tiempos pasando finalmente por un detector ,ue los identifica y cuantifica. En la C.9.L. la fase estacionaria es un l,uido no %ol(til absorbido en un soporte s2lido ,ue rellena la columna. Los componentes del gas problema son despla4ados selecti%amente+ como en la cromatografia de reparto+ por el gas portador ,ue fluye de manera continua. Los componentes de la muestra se separan de acuerdo con sus coeficientes de reparto entre las dos fases. DETECTORES! son muchos tipos de detectores+ estos act)an siempre por comparaci2n de alguna propiedad fsica o ,uimica (densidad+ calor de combusti2n+ etc." del gas portador solo (antes de la introducci2n de la muestra" y de la me4cla de gas portados y componentes de problemas. Los detectores se diferencian principalmente por su selecti%idad y sensibilidad+ por destruir o no la muestra y por ser integrales o diferenciales+ los primeros miden continuamente la muestra acumulada desde el principio del analisis y los segundos miden concentraciones instant(neas. Se utili4an m(s los detectores diferenciales. E*AL+ACION DE LOS CROMATO RAMAS Los distintos componentes de la muestra emergen de la columna a tiempos diferentes dependiendo de su retenci2n en la misma+ definido como volumen de retencin el %olumen de me4cla gaseosa ,ue emerge de la columna entre la introducci2n de la muestra y la aparici2n de un componente. Se calcula a partir del tiempo transcurrido y de flu-o gaseoso.

& r A tr ! El %olumen de retenci2n+ asi como el tiempo de retenci2n (para un flu-o constante" son %ariables cualitati%as ,ue permiten la identificaci2n de especies. 3ormalmente se utili4an los %alores respecto al m(1imo del aire (&Mr" o %alores relati%os frente a una especie patron. Estas %ariables cualitati%as solo son constantes cuando se producen e1actamente las condiciones+ por lo ,ue no son muy utili4adas para identificaciones directas. 6tili4ando muestra patrones+ la cromatografia de gases constituye el mtodo r(pido y e1celente para confirmar la presencia concreta en una muestra. $dicionando un patr2n al problema+ no deben aparecer nue%os picos en el cromatograma y deber( obser%ar el (rea ,ue constituye la muestra patr2n. La e%aluaci2n cuantitati%a se basa en ,ue+ en determinadas condiciones+ el (rea del pico (detector diferencial" y la altura del escal2n (detector integral" son proporciones a la concentraciones de especies.

CROMATO RAFIA LIQ+IDA DE ALTA RESOL+CI,N En las cromatografas cl(sicas+ en las ,ue la fase m2%il es un l,uido ,ue fluye a tra%es de un s2lido por el efecto de la gra%edad para alcan4ar alta resoluci2n seria necesario emplear columnas e1cesi%amente largas+ lo ,ue se traducira en un desarrollo muy lento de los cromatogramas. Estos incon%enientes se han resuelto con la cromatografia de alta resoluci2n+ en la ,ue se traba-a con pe,ue*as columnas+ muy empa,uetadas y for4ando el paso de la fase m2%il mediante ele%adas presiones+ con lo ,ue se consiguen separaciones muy efecti%as en un pla4o muy corto de tiempo. Bependiendo de la fase estacionaria+ el mecanismo de separaci2n puede ser reparto+ adsorci2n+ tama*o molecular (geles" e incluso cambio ionico+ aun,ue los mtodos mas utili4ados est(n basados en reparto y adsorci2n. El es,uema fundamental de un cromatografo de alta resoluci2n esta constituido por un deposito y un dispositi%o de bombeo de la fase m2%il ,ue opera a ele%ada presi2n (hasta CDD atm."+ un sistema de inyecci2n de la muestra+ columnas resistentes+ generalmente e acero ino1idable+ rellenas de fase estacionaria+ un detector y un sistema de registro gr(fico. La columna y los detectores %an introducidos en termostatos. Los detectores m(s utili4ados en esta tcnica est(n basados en absorciometria 6& y en medida de ndices de refracci2n+ siendo los cromatogramas obtenidos seme-antes a los de cromatografia gaseosa con detector diferencial. A-LICACIONES .. /. 0. F. Concentraci2n de tra4as Separaci2n de iones interferentes en analisis cl(sico Separaciones de iones de caractersticas similares Besminerali4aci2n del agua
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C. ;reparaci2n de disoluciones patr2n >. Bisoluci2n de sustancias insolubles.

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