EVALUACIN DEL PROCESO DE BIORREMEDIACIN IN SITU EN EL SUELO DE LA MACRO-FOSA CARACOL (MUNICIPIO ARAGUA, ESTADO ANZOTEGUI), IMPACTADO POR HIDROCARBUROS,

MEDIANTE BIOAUMENTACIN DE LA POBLACIN BACTERIANA AERBICA AUTCTONA Elynee Rojas

Resumen El progreso de la actividad petrolera en Venezuela y en la mayor parte del mundo constituye un elemento estratgico e indispensable del proceso de desarrollo nacional desde el punto de vista econmico y tecnolgico. A pesar de esto, las acciones que da a da se llevan a cabo en la industria, siempre generan riesgos de alteracin del medio ambiente, tales como derrames terrestres, martimos y lacustre, de petrleo y productos refinados, debido al manejo irregular de sistemas de bombeo, transporte en tuberas, almacenaje en tanques y disposicin inadecuada de desechos (fosas de lixiviados o perforacin). En el caso de ste ltimo, es de gran importancia su funcin, ya que permite facilitar la deposicin y acumulacin de los efluentes en un rea restringida y exclusiva. En contraste, exponer de forma prolongada al medio ambiente elevadas concentraciones de distintas clases de contaminantes (los hidrocarburos ms txicos y recalcitrantes son los aromticos policclicos), es considerado en el presente como emergencias ambientales debido al riesgo que representa a la salud humana y los recursos naturales. Actualmente, los procesos de remediacin ms utilizados consisten en la utilizacin de microorganismos; por esta razn se destina como finalidad principal de la investigacin la evaluacin de la tecnologa de Biorremediacin In Situ, la cual consiste en la digestin de sustancias orgnicas por microorganismos naturales presentes en el suelo a travs de la Bioaumentacin de la poblacin autctona. El diseo estadstico a utilizar, para comprobar la efectividad de la tcnica, es el de Bloques al azar en arreglo factorial con tres repeticiones. Con la aplicacin de esta metodologa se pretende acelerar la degradacin parcial de los desechos orgnicos presentes en el suelo. Introduccin Venezuela es un pas en donde se concentran grandes reservas de hidrocarburos y por ende se asocian procesos de extraccin, produccin, transporte, utilizacin y descomposicin de productos fsiles (petrleo). Estas actividades han generado derrames en espacios de suelos que alteran profundamente el medio ambiente. Por sta razn, el objetivo de la investigacin es ofrecer los resultados obtenidos en la evaluacin del proceso de Biorremediacin in situ a un rea del suelo afectado en la zona cercana a una fosa de perforacin ubicado en el sector Caico Seco en el estado Anzotegui, utilizando la tcnica de Bioaumentacin de la poblacin bacteriana autctona. Con la utilizacin de los medios de cultivos ricos y de baja concentracin de sales, como en el caso del Luria Broth (LB) y M9 respectivamente, se conseguira llevar a cabo los experimentos que implican el aislamiento de las bacterias autctonas. De esta misma forma, los resultados relacionados con la biorremediacin de hidrocarburos, sern calculados por medio del anlisis de Hidrocarburos Totales del Petrleo (TPH). En la figura 1 se ilustra la ubicacin geogrfica del sector Caico Seco.

Materiales y Mtodos 1. Estudio del Suelo . Muestras compuestas de suelo arenoso, planta, hidrocarburo y agua, fueron colectadas de la macro-fosa Caracol. Esta fosa fue escogida por representar un rea de exposicin histrica a hidrocarburos que oper durante muchos aos como una de las principales y ms grande recolectora de desechos petrolferos de la zona. Para la obtencin de las muestras, se tomaron aleatoriamente porciones de suelo de los primeros 10 cm de profundidad en cinco diferentes lugares de la fosa (a lo largo de la zona costera, en los linderos y en la parte central de la misma); la planta fue tomada en un rea cercana a la fosa y tanto el agua como el hidrocarburo, fueron extrados de la parte acuosa de la misma. En la figura N 2 se muestra el lugar en el cual fueron extradas las muestras de estudio. Posteriormente, se transportaron al laboratorio en donde se integraron las muestras para formar las siguientes composiciones: Nombre Componentes FC-01 Rizoesfera + Agua* FC-02 Hidrocarburo + Agua** FC-03 Slidos (Arena) Agua*: Agua procedente de la fosa Agua**: Agua atrapada por el hidrocarburo (emulsin inversa o Mouse) La nomenclatura FC, proviene de las iniciales del nombre del lugar de donde se extrajeron las muestras (Fosa Caracol). Cada una de las composiciones se proces de la siguiente forma: FC-01. Se eliminaron parcialmente de las races el exceso de tierra. Luego se tom por completo las races y se desech el resto (hojas) para posteriormente mezclarlas con agua*. Finalmente, se coloc en un fiola. FC-02. En una fiola se mezclaron el agua** e hidrocarburo. FC-03. Se seleccionaron y mezclaron los slidos con caractersticas especiales (aspecto hmedo o lodoso, restos de arena muy integrados al hidrocarburo). Todas las muestras constituidas (FC-01, FC-02 y FC-03), se colocaron en un agitador a 30 C y 150 rpm durante una semana. El pH se determin usando un pHmetro, mientras que los anlisis de humedad fueron realizados siguiendo la tcnica de secado y diferencia de pesada. Una muestra representativa fue enviada a los laboratorios de

Edafofinca (Cagua, estado Aragua), para el anlisis de nitrgeno y fsforo total. Fig. 1. Ubicacin Geogrfica del Sector Caico Seco. Anzotegui Dsff

Caico Seco

Fig. 2. Lugar de Obtencin de Muestras

2. Anlisis Microbiolgico 2.1. Medios de Enriquecimiento. Se realiz el enriquecimiento de las muestras FC-01, FC-02 y FC-03, en M9 (compuesto de Na2HPO4, KH2PO4, NaCl, NH4Cl) suplementado con los nutrientes elementales e hidrocarburo como fuente de carbono. Todo el proceso se realiz bajo un rgimen de esterilidad apropiado para evitar la contaminacin tanto de los cultivos como de los aditivos utilizados. En la figura N 3 se resea un ejemplo de la elaboracin del medio de enriquecimiento para el caso de la muestra de suelo. Luego de la primera semana de enriquecimiento se procedi a realizar el mismo procedimiento pero con un cambio en la conformacin de los nutrientes, para este caso se le comenz a aadir 40ml de M9, 40 _l de MgCl2 1M, 8 _l de CaCl2 0,5M, 80 _l de MgSO4 1M, 800 _l de FeCl3 5mM, se mantuvo la fuente de carbono y se verti 10 ml, finalmente se coloc 500 _l de inculo. Este ltimo provino de la muestra procesada con el medio inicial.

Semanalmente se realizaban pases de enriquecimiento y se tomaban las observaciones ms resaltantes que presentaban las muestras. Se realizaron 5 pases de las cuales el ltimo sirvi de inculo para los siguientes procesos que se llevaron a cabo durante la investigacin. Fig. 3. Pasos a Seguir para la Elaboracin del Medio de Enriquecimiento de la Muestra
M9 suplementado y Glicerol al 80% Hidrocarburo como Fuente de Carbono

Fiola Vac_ a

Muestra de Suelo
Muest ra de Suelo

El inculo provino de las muestras (FC-01, FC-02 y FC-03) originadas inicialmente, en donde el volumen de ste fue de 200ml el cual fue mezclado con 19 ml de M9, 460ml de suplementos, 100ml de microelementos y de carbono se verti para una concentracin al 0,1% la cantidad de 20ml, por otro lado, se colocaron 200ml para una solucin al 1%. La solucin formada fue introducida en una incubadora a una temperatura de 30C y 150 rpm durante 3 das. La manipulacin de hidrocarburos y de sustancias estriles fue realizada en la campana de flujo laminar. 3. Experimento de Biorremediacin. Para la elaboracin del experimento se tom como punto inicial la exploracin del terreno para ubicar el lugar que sera ms favorable para el desarrollo de la investigacin. Luego de haber realizado una inspeccin en la zona, se dispuso de un rea de poca pendiente y en donde las caractersticas del suelo mostraban cierta homogeneidad en cuanto a contaminacin se refiere. La biorremediacin de hidrocarburos se evalu en sistemas por duplicado utilizando parcelas que fueron limitados por piezas de madera en donde formaban un rea de 1m2 y con una profundidad de 15cm aproximadamente. Cada parcela contiene alrededor de 500Kg de suelo impactado de los cuales se le aplicaron los tratamientos mostrados en la tabla N1. En la figura N 4 se presenta el rea seleccionada para la implementacin de las parcelas de estudio. De igual forma, en la figura N 5, se puede apreciar cada uno de los casos de Biorremediacin que fueron aplicados. Posterior a la inoculacin inicial se obtuvieron muestras de 5kg tomadas en profundidad y de manera aleatoria por triplicado a travs de una tabla de nmeros aleatorios. Este proceso ocurri en la semana siguiente a la inicial, posteriormente en las semanas 4, 7 y 12. En general, la extraccin de hidrocarburos del suelo se realiz de una muestra de 7gr con Fig. 4. rea Seleccionada para Implementar la Biorremediacin

2. 2. Conteo de colonias en placas de LBagar. Se realizaron diluciones de 10-2 y 10-3. En placas de LB-agar fueron sembrados 5ml provenientes de cada dilucin la cual se llev a cabo rallando toda la placa uniformemente con un asa de platino. Este proceso se efectu en la campana de flujo laminar la cual es un equipo que proporciona esterilidad. El LB (Luria Broth), es un compuesto rico en nutrientes que se emplea para realizar aislamiento y cultivo de bacterias. Finalmente las placas inoculadas fueron guardadas en una estufa a 30C y 150 rpm por 24 horas. Pasadas las 24 horas, se observaron las diferentes morfologas y se llev a cabo el paso conteo. 2.3. Aislamiento de bacterias a partir de diferentes diluciones. Una vez culminado el paso 2, se procedi a visualizar los diferentes morfotipos obtenidos, para luego sembrarlos por duplicado en placas de LB-agar y as obtener una sola cepa en cada placa. La siembra se efectu por agotamiento con la ayuda de un asa de platino. Esta experiencia se realiz en la campana de flujo laminar y con la utilizacin de un mechero. Para culminar, se colocaron las placas en una estufa a 30C y 150rpm durante 24 horas. 2.4. Medios de cultivos lquidos selectivos. Se realizaron medios lquidos la cual contena M9 como solucin base, enriquecido con suplementos (MgCl2, CaCl2, FeCl3, MgSO4) y microelementos. La fuente de carbono aportado al mismo consisti de diferentes hidrocarburos (Ciclohexano, Naftaleno, DBT y ASF/AMN) a distintas concentraciones (0,1 y 1%).

50ml de cloroformo. La medicin de TPH se llev a cabo segn el mtodo 413.1 de la EPA (Agencia de Proteccin Ambiental de los Estados Unidos), el cual es un mtodo gravimtrico que consiste en la extraccin con solvente, evaporacin del solvente, y la determinacin del peso. Tabla N1. Tratamientos de Biorremediacin Aplicados en el Suelo Contaminado con Hidrocarburos Tratamientos Atenuacin Natural (Control) Bioestimulacin Descripcin del tratamiento Evaluacin de la degradacin por microorganismos autctonos del suelo. Evaluacin de la degradacin por microorganismos autctonos del suelo a travs de la adicin de 1,5L de nutrientes. Evaluacin de la degradacin por bacterias autctonas del suelo a travs de la adicin de 1,5L de nutrientes y 2,5L de bacterias autctonas en medio mnimo salino (M9).

1. Secar la Muestra

2. Tamizar la Muestra
3. Pesar la Muestra de Suelo, Perlas de Agitaci_n, Papel de Filtro, Fiola y Frasco de vidrio

(Suelo+ Crudo)

6. Se Obtienen 5. Filtrar la Muestra de Suelo 2 Derivados, el Solvente con Hidrocarburo y el Suelo Limpio

4. Mojar la Muestra de Suelo con Solvente

7. Secar el Suelo y Papel de Filtro

Bioaumentacin

Fig. 5. Representacin de Cada Uno de los Term_metro Casos de Biorremediacin Aplicada Control

8. Recuperar el Solvente a trav_s de una Celda de Destilaci_n

Condensador

Celda de Destilaci_n

Crudo +Solvente

Trampa. Lugar en donde es recolectado el solvente

Malla de Calentamiento

Regulador de Temperatura

Resultados y Discusiones Previo a la realizacin de las actividades microbiolgicas se determin el pH de las muestras FC-01, FC-02, FC-03, la cual indicaron que las muestras inicialmente procesadas mantienen un pH neutro, demostrando as que el ambiente en donde se extrajeron las bacterias mantiene un equilibrio en cuanto a acidez y basicidad muy favorable para su crecimiento. Por otro lado, los resultados obtenidos de nitrgeno y fsforo total a travs de los anlisis realizados en el laboratorio Edafofinca, ubicado en el estado Aragua, indicaron que el nitrgeno

Bioestimulacin

Bioaumentacin

En la figura N 6 se puede observar los pasos realizados para la ejecucin de la prueba de TPH.

est muy por debajo de los valores estndares, reflejando as un 15% de la carga total. En el caso del fsforo, ste conserva un estatus casi intermedio (45%). En esta ocasin los resultados son aceptables o simplemente se ajustan a las condiciones ambientales en la que se encuentra el rea, por tanto es obvio la carencia o escasez de muchos nutrientes. El suelo de estudio se caracteriza por ser arenoso y de grano intermedio desde la superficie hasta unos 15cm de profundidad, lo que es ventajoso para el tratamiento ya que permite un favorable esparcimiento de los nutrientes como tambin admite una efectiva aireacin. Cuando se alcanza una profundidad superior a la antes mencionada, el suelo se torna un poco ms fino y hmedo, ste ltimo pudiera estar asociado con el hecho de que en la zona existen riachuelos (ro Caracol y Garrapata) que abarcan gran extensin del rea de estudio y como tambin por estar fuera de contacto tanto con el aire como con la radiacin solar. Del mismo modo, el subsuelo se topa con pequeos trozos de arcilla que se hallan muy dispersas a lo largo de la estructura, caso que coloca en desventaja algunas partes del subsuelo debido a que las arcillas se caracterizan por ser porosas ms no permeables, es decir, que los poros no se encuentran interconectados entre s por lo cual retiene los fluidos sin permitir la circulacin del mismo. stas se observan muy escasamente. Conjuntamente con la arena se perciben cantidades considerables de hidrocarburos muy erosionados que forman parte de la fraccin que se desea degradar. En s, un suelo arenoso podra favorecer como tambin agravar el proceso de biorremediacin, en el caso de ste ltimo, es porque la presencia de granos muy gruesos conforman generalmente una estructura muy porosa la cual permite la percolacin ms rpida de los fluidos colocados (los nutrientes se vierten en el sistema de forma lquida). Estudios Microbiolgicos 1. Los medios de enriquecimientos se llevaron a cabo hasta el quinto pase, ya que para ese entonces, las muestras estudiadas (FC-01, FC02 y FC-03) presentaban una gran turbidez, coloraciones muy diversas y formacin de biocapa. La coloracin y la turbidez son respuestas que en muchas ocasiones los microorganismos y en este caso las bacterias tienden a presentar como consecuencia de la metabolizacin (respuesta a la coloracin), multiplicacin y crecimiento (respuesta a la turbidez). Por otro lado, la formacin de biocapa estuvo dispuesta a unos 4cm aproximadamente de la superficie del lquido para todas las muestras y se difundi de

igual forma a lo largo de la fiola. Las bacterias se asientan en estas superficies ya que sus reacciones ocurren a nivel de la interfase en donde las clulas logran producir un material polimrico extracelular. En si sta adherencia sta influenciada por la movilidad de las clulas y depende de las caractersticas del medio de cultivo, por lo cual este ltimo coincide con los medios formados (FC-01, FC-02 y FC-03) en donde la orimulsin contribuye a establecer un ambiente txico para las bacterias y esto a su vez implica una mayor produccin de sustancias polimricas que en medios no txicos. 2. A simple vista es imposible detectar la cantidad de bacterias que estn presentes en el medio ambiente, es por ello que en prcticas de laboratorio se implementan tcnicas que permiten contarlas. Esto se fundamenta en que cada bacteria se desarrolla y se reproduce hasta formar una masa visible, es decir, la formacin de una colonia partiendo de un organismo viable; por tanto el conteo en placa nos proporciona el nmero de bacterias presentes en la muestra de estudio. Por lo general la muestra original se diluye de manera que el nmero de colonias desarrolladas en la placa se encuentren entre 50 y 500 colonias con el fin de disminuir la posibilidad de interferencia en el desarrollo entre las distintas especies bacterianas. En la tabla N 2 se muestran los resultados luego de 24 horas de inoculacin de las diferentes diluciones (10-2 y 10-3). Tabla N 2. Resultados del Conteo de Colonias en Placas de LB-agar Experimento FC-01 10-21 FC-01 10-22 FC-01 10-31 FC-01 10-32 FC-02 10-21 FC-02 10-22 FC-02 10-31 FC-02 10-32 FC-03 10-21 FC-03 10-22 FC-03 10-31 FC-03 10-32 UFC @ t = 24 hr 233 214 42 17 192 211 14 23 410 427 83 69 Ttulo (UFC/ml) 4,6 105 4,28 105 8,4 104 3,4 104 3,84 105 4,22 105 2,8 104 4,6 104 8,2 105 8,54 105 1,66 105 1,38 105

En todos los casos el ttulo oscila entre 104 y 106 UFC/ml. Estos niveles son aceptables ya que se han reportado algunos resultados (como en el caso del proyecto realizado por la Universidad de Antioquia que consisti en el conteo de colonias bacterianas mediante visin computarizada, 2001) que indican que la

cantidad de colonias bacterianas presentes en zonas contaminadas con hidrocarburos estn bajo el mismo rango de los valores obtenidos. En la figura N 7 se puede observar la presencia de colonias perfectamente expuestas para el conteo. Figura N 7. Formacin de Variadas Colonias Bacterianas

Tabla N 3. Nmero de Morfotipos Aislados en Laboratorio Nmero de Morfotipos Aislados 7 5 16 28

Experimento FC-01 (10-2 y 10-3) y FC-01 FC-02 (10-2 y 10-3) y FC-02 FC-03 (10-2 y 10-3) y FC-03 Total

3. En la tabla N 3 se puede apreciar la cantidad de morfotipos que lograron aislarse en el laboratorio. Sumando todos los morfos aislados se obtienen 28 cepas, de las cuales representan parte de las bacterias ambientales que pueden ser cultivadas en el laboratorio, siendo esta quizs menos del 1%. Es importante tomar en cuenta que el 99% de las bacterias que no crecieron consiguen un ambiente equilibrado en su hbitat original, considerando que en ocasiones necesiten de la participacin de otros organismos y conjuntamente con las condiciones ambientales logren establecer una sinergia favorable. En contraste, en el laboratorio, resultan diferentes y limitadas las condiciones referentes a la conformacin de los medios de cultivos, ya que stos incluyen los nutrientes necesarios para su crecimiento pero se ve escaso ante la influencia de otras fuentes de nutricin como tambin el efecto del oxgeno, temperatura, agua, entre otros. Por otro lado, no todas las bacterias evolucionan de igual forma, es decir, algunas son aerbicas, anaerbicas, facultativas y otras; es por esta razn que no se puede obviar la procedencia de las muestras de estudio, esto indica que referirse a las bacterias que circundan los alrededores de la rizosfera de una planta no es igual a las que se encuentran en el agua o a las que se encuentran en contacto con un crudo y mucho menos aquellas bacterias que estn presentes en la superficie del suelo. Es por ello que la diversidad bacteriana es sumamente compleja y por ende es imposible de aislar completamente en laboratorio.

4. En la tabla N 4 se presentan los resultados obtenidos de la observacin realizada luego de haber transcurrido 22 das desde el inicio de esta actividad. Durante ste tiempo se efectuaron 2 pases de enriquecimiento en los medios donde el sustrato fue lquido (Ciclohexano y ASF/AMN) ya que su evolucin ocurri un poco lenta. Para el DBT y el Naftaleno en donde su presentacin en el sistema fue en forma cristalizada, su pronta metabolizacin condujo a la ejecucin de 3 pases. Como puede apreciarse, la mayora de las muestras estudiadas son capaces de degradar hidrocarburos lo cual es obvio, ya que las bacterias que lograron crecer eficientemente bajo estos ambientes de presin indican que su gentica no est restringida a procesar compuestos de alta toxicidad, esto pudiera deberse a que se encuentran adaptadas y por ende desarrollaron defensas para poder soportar stos sistemas lo que a su vez est relacionado con el tiempo de exposicin del contaminante en el ambiente. Esto quiere decir que una exhibicin prolongada est asociada con la inocuidad del contaminante en el ecosistema existente. Es preciso enfatizar que en los sistemas experimentales FC-01, FC-02 y FC-03, se produjeron poblaciones bacterianas con caractersticas particulares, y que en conjunto logran establecer un equilibrio favorable para su entorno. Esta idea conlleva a intuir que es probable que existan bacterias que cumplan con funciones definidas, es decir, que a diferencia de otras capten algn sustrato especfico, y el resultado de su metabolizacin sirva de complemento para otras. Si tomamos en cuenta la escala de degradacin de hidrocarburos se puede hacer notar que las bacterias en la mayora de las ocasiones consiguen captar con mayor facilidad los compuestos ms simples (como en el caso de los alcanos), es por esta razn que resulta

interesante las caractersticas observadas en los distintos experimentos realizados y en donde se aprecia a travs de la turbidez, cambio de coloracin y la formacin de biocapa, cmo la poblacin bacteriana autctona, an en las condiciones de laboratorio, pueden procesar estructuras muy estables o en sus efectos ramificados como lo son el ciclohexano, naftaleno, dibenzotiofeno (DBT) y la solucin asfaltenos con alfametilnaftaleno (ASF/AMN). Tabla N 4. Observaciones de los Distintos Medios de Cultivo Selectivos
Experimento Ciclohexano 1% FC-01, FC-02 y FC-03 Color amarillento. Traslucido. Biocapa color naranja muy delgada e inconstante a lo largo de la fiola. Turbidez media. Poca turbidez Color grisceo. Ruptura de emulsin lo cual implica la presencia de gotas de asfaltenos. Biocapa uniforme en la extensin de la fiola, color negro. Color gris claro. Alta turbidez. Ruptura de emulsin. Biocapa color negro. Color gris oscuro. Ruptura de emulsin. No presenta biocapa. Turbidez pronunciada. Color gris claro. Traslucido. Baja turbidez. Biocapa color anaranjado. Ruptura de emulsin. Caractersticas parecidas a las presentadas por FC-01 Se nota ms limpia o menos opaca en cuanto a turbidez se refiere. Color blanco mate. Alta turbidez. Material slido color amarillo muy claro disperso en el medio irregularmente. Biocapa blanca con tonos anaranjados. Color marrn claro mate. Alta turbidez. Biocapa blanca. Color blanco mate. Excesiva turbidez. Biocapa blanca. Coloracin blanca mate. Turbio. Biocapa gruesa y de color naranja. Presenta caractersticas similares a las de FC-01 pero con la diferencia de que la biocapa fue ms delgada Color naranja mate. Excesiva turbidez. Biocapa color naranja y delgada. Observacin del Medio de Cultivo (T= 22 das)

Ciclohexano 0,1% FC-01, FC-02 y FC-03 ASF/AMN 1%

colocacin de este hidrocarburo a menor concentracin se evapora, bien sea durante el proceso de vertido o en la etapa de preservacin en la estufa, esto a su vez ocasiona una carencia importante de la fuente de carbono la cual es esencial para el proceso evolutivo de las bacterias. En el caso del ASF/AMN ocurre un efecto muy similar al del ciclohexano, pero a este se le suma la idea de que por efecto de la ruptura de la emulsin entre el asfalteno y el alfametilnaftaleno, debido a un aumento de la concentracin de la fase continua (en la emulsin ASF/AMN, la fase continua es el AMN y por ende la dispersa el asfalteno) cuando se mezcla el ASF/AMN con el medio base (M9). Es probable que a las bacterias se le dificulte tomar el hidrocarburo por ser este hidrofbico (incompatibilidad al agua), es por ello que es necesario que ste se encuentre en solucin con el medio para as facilitar el transporte de nutrientes a travs de las clulas. En el caso del DBT, se observa una respuesta del medio que est asociada con la ruta de degradacin reportada por Kodama. Experimento de Biorremediacin En las parcelas de estudio (bioaumentacin, bioestimulacin) se observaron pocas variaciones fsicas durante el tiempo de tratamiento. En s los niveles de descontaminacin no fueron muy notorios ya que a pesar de que se realiz inicialmente una homogenizacin de cada sistema no fue posible cuantificar del todo la proporcin del contaminante en stas. En la figura N 8 se puede apreciar la evolucin de las distintas parcelas desde el inicio del procedimiento. Es importante mencionar que la influencia del medio ambiente fue punto predominante en la efectividad de los procesos, esto se refiere a la coincidencia del comienzo del trabajo experimental (inicio del mes de junio y finales del mes de julio) con la llegada de la temporada de invierno. Las lluvias por su parte afectan gravemente el desarrollo del estudio por diversas razones, en primer lugar pudiera producirse un lavado del suelo, esto se considera en desventaja ya que una vez colocados los nutrientes en el medio, es muy posible que se percolen gran parte de stos a profundidades que estn muy lejos de la superficie; por otro lado, en las parcelas 1 y 2, en donde se bioaument la poblacin bacteriana autctona que crece a temperaturas que sobrepasan los 30 C, por su parte se ve influenciada en esta ocasin por la temperatura

FC-01

FC-02

FC-03 ASF/AMN 0,1% FC-01

FC-02 FC-03 Naftaleno

FC-01

FC-02 FC-03 DBT FC-01

FC-02

FC-03

Los resultados observados en el caso del experimento del ciclohexano al 1% con respecto al de 0,1%, pudieran estar indicando que la

promedio en invierno, por lo cual provoca una tensin en el metabolismo de las bacterias. Los valores de pH para los tiempos que van desde T0 hasta T3, resultan favorables para el crecimiento bacteriano autctono la cual influye por ende en los procesos de remediacin. Por otro lado, para los dos ltimos tiempos (T4 y T5), ocurre un aumento que oscila entre 8,1 y 8,847, esto pudiera inhibir la actividad de las bacterias ya que muestran un comportamiento ptimo cuando el ambiente que los rodea est en un rango de pH entre 6 y 8. La humedad relativa est asociada con la cantidad de agua que contiene un cuerpo con respecto a la que pudiera contener si estuviera saturado a la misma temperatura. Con sta relacin hay que tener suma delicadeza a la hora de aplicarla, debido a que fsicamente medir la humedad relativa de un cuerpo a travs de diferencias de pesadas se tendra que tomar en cuenta las variaciones de temperaturas, porque sta es muy sensible y su cambio ocasionara valores errneos a la hora de tomar los resultados. Fif. N 8. Visualizacin del Desarrollo de las Diferentes Tcnicas de Biorremediacin con Respecto a los Tiempos Muestrales Bioaumentacin Parcela 1 T0 T1 T2

Bioestimulacin Parcela 3 T0 T1 T2

T3

T4

T5

Parcela 4 T0 T1 T2

T3

T4

T5

T3

T4

T5

Control Parcela 5 T0 T1 T2

Parcela 2 T0 T1 T2 T3 T4 T5

T3

T4

T5

Medicin de la Biodegradacin En la tabla N 5 se presentan los resultados obtenidos de TPH considerando el anlisis

para las parcelas 1 y 2 (bioaumentacin) como tambin 3 y 4 (bioestimulacin) un solo sistema. Este criterio se tom con la finalidad de optimizar los resultados arrojados por cada experimento. Tabla N 5. Resultados de TPH para Cada Uno de los Experimentos de Biorremediacin
Experimento TPH promedio T0 TPH promedio T5 TPH degradad o (%)

fueron suficientes en las proporciones aadidas y existentes respectivamente, ya que pudo haber influenciado las constantes lluvias que ocurran en ese tiempo y as provocar un excesivo lavado del suelo conllevando a la perdida de nutrientes y la disminucin de las bacterias. En el caso de la bioaumentacin no se puede obviar el efecto de las lluvias, pero es posible que la existencia de una mayor concentracin de bacterias hallan podido resistir ste fenmeno. Bioaumentacin

Prcela 1-2 Parcela 3-4

8,2 8,83

6,11 7,21

25,49 18,35
9 8 7

11,98

10,55

11,94

6 5 4 3 2 1 0 0 1 2 4 7 12

Parcela 5

Por otra parte, se aprecia que los porcentajes de degradacin en los tres casos resultaron ser aceptables para cada tipo de tratamiento, obtenindose valores entre 18 y 25%. Para algunos autores (Infante, 2001) (Ercoli, 2001), las consecuencias de una buena aplicacin de la biorremediacin consiste en alcanzar cifras por encima del 25% para un tiempo de aproximadamente de 150 das. Es entonces relevante destacar los 90 das de tratamiento que a su vez equivalen tres quintas partes de un periodo de150 das, por lo cual tericamente segn este ltimo criterio se tendra entonces que obtener el 15% de degradacin, valor que se encuentra 10 unidades por debajo de la cifra obtenida bajo la implementacin del proceso de biorremediacin in situ utilizando la tcnica de bioaumentacin. La figura N 9 muestra la variacin de los niveles de concentracin de hidrocarburos totales reportados. Las curvas muestran una disminucin de los hidrocarburos totales en el tiempo para las parcelas analizadas. El mejor comportamiento en cuanto a degradacin se refiere se encontr en las parcelas en donde se bioaument la poblacin bacteriana autctona, en donde el grado de concentracin de hidrocarburos totales con el tiempo resultaron inferiores con respecto al control, lo que indica que las condiciones aerbicas, el aumento de el nmero de bacterias, la adicin de nutrientes y el material contaminante ya presente pudieron influir en el proceso de degradacin. En el proceso de bioestimulacin todava se observa un mejor comportamiento con respecto a la parcela 5, pero sus valores de TPH estn muy cercanos. En s esta similitud evidencia que la adicin de nutrientes y el nmero de microbiota no

TIEMPO (SEMANAS)

Bioestimulacin
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 1 2 4 7 12

TIMEPO (SEMANAS)

Control
12 10 8 6 4 2 0 0 1 2 4 7 12

TIEMPO (SEMANAS)

Conclusiones 1. 2. Bajo condiciones de laboratorio lograron crecer 28 morfotipos. Se encontr que la poblacin bacteriana aerbica aislada de los alrededores de la macro-fosa Caracol, es capaz de degradar hidrocarburos como ciclohexano, alfametil/asfaltenos, dibenzotiofeno y naftaleno. Las bacterias autctonas frente al compuesto azufrado (DBT), mostr caractersticas propias de la biodegradacin

3.

de stos siguiendo la ruta metablica Kodama. 4. La Biorremediacin se ve influenciada por la por las variaciones en la humedad relativa que presentan las parcelas experimentales durante el tratamiento. La Bioaumentacin en un lapso de 90 das gener mayor porcentaje de degradacin (25,49%) con respecto a la Bioestimulacin (18,35%) y el Control (11,94%).

8.

9. 10.

5.

Recomendaciones 1. Realizar un estudio de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa para lograr identificar las bacterias autctonas capaces de metabolizar hidrocarburos. Caracterizar a travs de la tcnica SARA (Saturados, Aromticos, Resinas y Asfaltenos) el hidrocarburo extrado en la prctica de TPH, para as conocer las fracciones degradadas durante el tratamiento. 11. 12.

2.

13.

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