LA SEMILLA ARTIFICIAL Y SU TECNOLOGA

1. Introduccin 2. Embriognesis cigtica y somtica 3. Tecnologa de la semilla artificial 4. Aplicacin Prctica 5. Literatura Consultada

1. Introduccin La semilla es el vehculo que conecta una generacin con otra en gran parte del reino vegetal. Por medio de la semilla, las plantas son capaces de transmitir su constitucin gentica en forma generacional y por lo tanto las semillas son el medio de multiplicacin, almacenaje y dispersin ms adecuado (1). Son el sistema ideal de propagacin; ellas contienen cantidades importantes de sustancias de reservas que aseguran el crecimiento y establecimiento de las plntulas, son quiescentes para minimizar la respiracin y maximizar la longevidad y estn recubiertas por una testa que permite su manipulacin y reduce el ataque de patgenos (2). En los vegetales existen dos sistemas de propagacin: sexual y asexual. En el caso de la reproduccin sexual, se forman clulas reproductoras especializadas, llamadas gametos. La fusin de los gametos masculino y femenino lleva al desarrollo de un embrin y posteriormente a la formacin de la semilla ( 1 ). En la reproduccin asexual, las nuevas plantas se originan por medio de rganos vegetativos especializados, tales como tubrculos, rizomas, estolones, bulbos, etc.; pero adems, lo hacen por otros mtodos de propagacin como embriognesis somtica natural ( apomixis, embriognesis adventicia, etc. ), micropropagacin y embriognesis somtica in vitro ( 3 ). La embriognesis somtica in vitro es posible ya que virtualmente cualquier tejido somtico vegetal tiene la capacidad de desarrollarse en un embrin (totipotencia) a travs de la manipulacin de las condiciones de cultivo y la aplicacin de reguladores del crecimiento. La primera demostracin de que las plantas podan producir embriones somticos in vitro fue publicada en 1958 ( 4 ). En la actualidad, la embriognesis somtica in vitro es un hecho bien establecido en mas de 150 especies de importancia agronmica. Los embriones somticos se pueden obtener de clulas vegetativas, de tejidos reproductivos, de embriones cigticos o de callos producidos de cualquiera de los anteriores ( 5 ). En otras palabras, embriognesis somtica in vitro es el proceso por el cual se forman embriones a partir de clulas vegetativas. Por lo tanto, los embriones somticos se desarrollan sin la precedente fertilizacin, como ocurre en la formacin de los embriones cigticos ( 4 ). A los embriones somticos les falta la testa y el endospermo, los cuales proveen proteccin y nutricin al embrin cigtico en las semillas naturales ( 6 ). Entre las ventajas que ofrece la produccin de embriones somticos estn: la posibilidad de producir una gran cantidad de embriones ( alta eficiencia de produccin ); la caracterstica de bipolaridad que distingue a los embriones como plantas individuales; la similitud en diferentes niveles de organizacin ( morfolgico, fisiolgico y bioqumico ) con sus contrapartes sexuales y su capacidad para producir una planta nueva durante los procesos de germinacin y conversin ( 7 ).

Pero la caracterstica sobresaliente de los embriones somticos es que se desarrollan de clulas somticas y por lo tanto presentan la potencialidad de producir duplicados de un genotipo especifico. Esta caracterstica no solo permite la propagacin clonal, tanto en especies propagadas vegetativamente como por semillas; sino tambin la multiplicacin de clulas somticas a las cuales se les han introducido genes especficos por ingeniera gentica. Los individuos genticamente modificados pueden ser multiplicados en forma segura y eficiente, evitando los riesgos de la incorporacin de genes extraos meiticamente inestables en el resto del germoplasma ( 8 ). La propagacin de plantas, a travs de la embriognesis somtica, representa el mtodo ms eficiente de multiplicacin clonal de plantas que se ha desarrollado hasta la fecha ( 6 ). Se puede emplear tanto en especies que se reproducen por semillas como en aquellas de propagacin vegetativa ( 9 ). La semilla artificial se define como la ingeniera de los embriones somticos que permite su uso en la propagacin comercial de plantas ( 10 ). La tecnologa de las semillas artificiales implica el empleo de embriones somticos encapsulados en una testa sinttica protectora. Es un sistema de alta eficiencia de multiplicacin y por lo tanto al momento de dominar esta tecnologa los costos de produccin sern bajos. Las ventajas inherentes a la semilla artificial son la produccin de muchos embriones somticos y el empleo de tcnicas de manejo convencionales de las semillas naturales. Estas semillas artificiales son propgulos clonales de la fuente parental, que tienen la capacidad para ser sembradas directamente en el suelo o germinar in vitro y luego sus plntulas ser transplantadas. El objetivo de la tecnologa de la semilla artificial es desarrollar un sistema de propagacin clonal, capaz de almacenar por periodos largos de tiempo propgulos vegetativos y que stos se transformen en una planta nueva ( 11 ). Actualmente, la propagacin vegetativa es una practica limitada a cultivos de alto valor comercial. Esta practica se podra difundir ampliamente si se logran bajar significativamente los costos de produccin de la semilla artificial. Con el empleo de la semilla artificial se mejorara la produccin de especies propagadas vegetativamente como papa, rboles frutales, vid, etc. Tambin aumentara la eficiencia de produccin de rboles forestales, palma datilera, hortalizas, ornamentales y oleaginosas como el coco y la palma En leguminosas y gramneas forrajeras, como alfalfa y dactylis, donde los cultivares son poblaciones heterogneas y heterocigotas; la semilla artificial permitira la multiplicacin eficiente de plantas sobresalientes ( 5 ). Genotipos de especies de alto valor comercial podran ser propagados de esta manera, evitando el consumo de tiempo y dinero de los programas de mejoramiento gentico para desarrollar lneas parentales. Especies de conferas con ciclos reproductivos muy largos para producir semillas se podran beneficiar de esta tecnologa. Cultivos autgamos, como soya y algodn, donde la produccin de semilla hbrida solo es posible en forma manual; la semilla artificial seria la solucin. El empleo de la tecnologa de la semilla artificial para obtener semillas hbridas de tomate y sandia sin semilla, donde el costo de la semilla hbrida es muy alto ya que se debe producir manualmente, permitira el acceso de un gran numero de agricultores a dicha semilla ( 12 ). Finalmente, la semilla artificial puede cumplir funciones de almacenamiento de germoplasma. En especies de propagacin vegetativa, la conservacin del germoplasma de

hace muy difcil y riesgoso; el empleo de embriones somticos desecados parece el mtodo ideal para conserva este tipo de germoplasma ( 2 ). Dos tipos de semilla artificial han sido desarrollados en el transcurso de esta linea de investigacin. En una primera etapa se emplean embriones somticos hidratados sin proteccin en la propagacin de plantas de alto valor, como las ornamentales, donde la eficiencia de la embriognesis somtica reduce los costos en comparacin con la micropropagacin que requiere recursos humanos especializados e infraestructura adecuada. Sin embargo, los propgulos eran muy dbiles y delicados. Para evitar este problema, embriones somticos individuales fueron encapsulados en un hidrogel, tal como alginato de calcio. Los embriones son mezclados con alginato de sodio y luego sumergidos en una solucin con una sal de calcio para formar cpsulas de alginato de calcio ( 3 ). Estos embriones hidratados y encapsulados pueden ser almacenados usando temperaturas bajas por algunas semanas. La frecuencia de conversin ( porcentaje de embriones somticos que forman una planta completa ) en vitro para alfalfa fue de 60-90%, mientras que en siembras en invernculos fue de tan solo 2-10% ( 11 ). La etapa actual de desarrollo es la produccin de semilla artificial deshidratada. Este tipo de semilla permite prolongar el periodo de almacenaje por varios aos, para ello los embriones somticos deben ser inducidos a presentar tolerancia a la desecacin, para luego bajar el contenido de humedad de la semilla que permita su almacenaje seguro ( 13 ). La produccin de semilla artificial desecada se aproxima al ideal, que es la semilla natural ortodoxa. A la fecha, ninguno de los mtodos de encapsulacion es completamente satisfactorio. Las cpsulas hidratadas son ms difciles de almacenar, debido a los requerimientos de respiracin de los embriones. Un segundo problema de estas cpsulas es que se secan rpidamente, por lo que deben ser almacenadas en un ambiente hmedo o emplear una membrana hidrofbica. Para ambos mtodos de encapsulacin, todava no se ha podido desarrollar un endospermo artificial apropiado. S esta estudiando el suministro de carbohidratos y otros nutrientes necesarios en el crecimiento del embrin. Sin embargo, el aspecto ms limitante de esta tecnologa es la produccin de embriones somticos vigorosos de alta calidad fisiolgica. Para que la semilla artificial sea competitiva en el mbito comercial, sus embriones somticos deben germinar rpidamente y desarrollar plntulas en frecuencias similares a la semilla natural ( 15 ). De lo anterior se desprende que la produccin a gran escala de la semilla artificial debe superar algunos retos. Primero se debe contar con un sistema de embriognesis somtica modelo, el cual sea reproducible en condiciones controladas y que al mismo tiempo se tengan altos niveles de produccin de embriones de alta calidad fisiolgica ( 16). En segundo lugar se debe caracterizar el germoplasma, ya que la embriognesis somtica es controlada genticamente. Por ultimo, se requiere del diseo de bioreactores especficos para la produccin de embriones somticos a gran escala y de este modo lograr bajar los costos para que dicha tecnologa sea competitiva ( 17 ). 2. Embriognesis cigtica y somtica Una primera diferencia entre embriones cigticos y somticos son sus sistemas de iniciacin. Los embriones cigticos se forman a partir de la unin de los gametos, la doble fecundacin y las plantas que se originan son hbridas por la recombinacin meitica de sus genes. Por el contrario, los embriones somticos se originan de clulas vegetativas de un nico

individuo y las plantas resultantes son duplicados genticos o clones de la planta madre. Sin embargo, tanto los embriones cigticos como somticos comparten similar ontogenia. Ambos embriones pasan por los estados globular, torpedo y cotiledonal en especies dicotiledneas y conferas ( 18 ) o por los estados globular, escutelar y coleoptilar en monocotiledneas ( 9 ). No obstante, existen diferencias significativas que limitan su uso como mtodo de propagacin. Por ejemplo, especies que son monoembrinicas y producen embriones cigticos va un suspensor, generalmente dan origen a embriones somticos por un sistema evolutivo poco desarrollado donde se forma una masa de tejido embrional ( denominado complejo proembrional ) con mltiples embriones somticos. Las razones para este retroceso hacia un tipo de desarrollo primitivo son desconocidas ( 8 ). Dicha masa de embriones somticos se desarrolla en forma asincrnica, de tal forma que mltiples estados de desarrollo embrional estn presenten en el cultivo en cualquier momento. Al desarrollarse en diferentes momentos estn sujetos a cambios en el rgimen nutricional del medio de cultivo. En este ambiente fluctuante desde el punto de vista nutricional, los embriones se vuelven desorganizados, forman nuevas clulas embriognicas y de esta manera contribuyen a la asincrona Tambin ocurre una germinacin precoz, donde dichos embriones forman solo races o tallos; no es una germinacin que de origen a una plntula normal. Otro problema es que los embriones somticos generalmente muestran anormalidades estructurales como cotiledones extras y meristemas apicales pobremente desarrollados ( 18 ). Todos estos problemas se deben a las condiciones de cultivo y no a factores intrnsecos de los embriones somticos, ya que embriones cigticos inmaduros al ser removidos de las semillas y cultivados in Vitro presentan similares irregularidades ( 20 ). Otra diferencia significativa entre embriones cigticos y somticos, es que a los embriones somticos les falta la fase de quiescencia ( 21 ). Los embriones cigticos maduros de las semillas ortodoxas, al llegar a la madurez se deshidratan y entran en un periodo de reposo o quiescencia, que es el principal factor para que las semillas puedan ser almacenadas. Por el contrario, los embriones somticos continan creciendo, algunos germinan, otros se vuelven desorganizados y se transforman en tejido proembrional y otros mueren. La falta de una fase de reposo en los embriones somticos es el mayor obstculo de su utilizacin como semilla artificial ( 9 ). 3. Tecnologa de la semilla artificial En esta seccin se describir la tecnologa de la semilla artificial de alfalfa ( Medicago sativa L.), ya que es la especie donde se han logrados los mayores avances y por tal motivo ha sido usada como sistema modelo para desarrollar los conceptos y principios de esta tecnologa. En consecuencia, se considera pertinente resumir la informacin generada hasta la fecha ( 2 ). A.- Produccin de embriones somticos Para inducir la embriognesis somtica se requiere un cambio en el destino de la clula vegetativa (somtica). Generalmente, se requiere de un tratamiento inductivo que inicie la divisin celular y establezca una nueva polaridad en la clula somtica ( 6 ). Las auxinas cumplen esta funcin y en alfalfa se emplea comnmente el 2,4-D, pero otras auxinas como 2,4,5-T son efectivas ( 6 ). La respuesta de las auxinas es muy compleja; algunas auxinas como cido indolactico son inefectivos y otros estimulan la formacin de callos pero no de embriones somticos ( cido clorofenoxiactico ). Compuestos inorgnicos como potasio y compuestos orgnicos como prolina en el medio de

cultivo se han empleado para regular la embriognesis o formacin de callos, pero ellos no reemplazan a las auxinas ( 22 ). Un aspecto muy importante de la embriognesis somtica es su control gentico ( 23 ). Como en la mayora de las especies, muy pocas plantas de una poblacin de alfalfa responden al 2,4-D en un medio de cultivo y producen embriones somticos. La embriognesis somtica es una caracterstica controlada genticamente y que se hereda sexualmente ( 24 ). Est controlada por dos genes dominantes independientes ( 25 ). En la variedad Rangerlander se identific un genotipo, denominada RL 34, que es altamente embriognico y genticamente estable en cultivos in Vitro ( 6 ). Sin embargo, tienen una serie de caractersticas agronmicas indeseables ( susceptible a enfermedades, bajo vigor y rendimiento de semilla ). Por tal motivo, se estableci un programa de seleccin recurrente con el fin de transferir estos dos genes que controlan la embriognesis somtica en RL 34 a variedades de alfalfa adaptadas de Canad y USA. Luego de 4 retrocruzamientos en 7 variedades, se encontr una alta frecuencia de estos genes en dichas variedades. La evaluacin a campo de este germoplasma mostr individuos con alto potencial de rendimiento de forraje, buena produccin de semilla y capacidad combinatoria elevada con otros genotipos ( 26 ). B.- desarrollo de embriones somticos Para permitir el desarrollo de embriones somticos en un medio de cultivo, la suspensin se filtra y la fraccin colectada se esparce en un medio de cultivo que le falta reguladores de crecimiento. El filtrado permite la homogenizacin en tamao y estado de desarrollo de los embriones somticos. Aproximadamente a los 4 das posteriores al filtrado, comienzan a aparecer embriones en el estado globular, luego pasan por el estado de corazn y a los 7-10 das se encuentran en el estado de torpedo ( 6 ). Una vez que estn en el estado de torpedo, los embriones somticos comienzan a presentar germinacin precoz . Al germinar en este momento, no han tenido suficiente tiempo para almacenar sustancias de reservas o adquirir la tolerancia a la desecacin, por lo que estos embriones no entran en el estado de quiescencia. Para evitar estos inconvenientes, los embriones se colocan en un medio con tensin osmtica al incluir 5-6% de sucrosa en lugar del 3% normal; de esta forma se previene la germinacin precoz y los embriones siguen su desarrollo. Por lo tanto, los embriones siguen acumulando protenas y carbohidratos ( 27 ). La acumulacin de protenas de almacenaje se favorece por la inclusin de una fuente de nitrgeno orgnico ( glutamina ) y una fuente de sulfuro inorgnico (sulfato de potasio ) ( 28 ). El estado de maduracin final se logra al transferir los embriones a un medio conteniendo cido abscisico. Este regulador del crecimiento aparentemente inicia un proceso que lleva a la adquisicin de la tolerancia a la desecacin. Otros tratamientos fsicos como fro, calor, tensin osmtica, etc. pueden lograr similar respuesta, presumiblemente debido a que estimulan la sntesis endgena de cido abscsico Los embriones somticos, al desarrollarse en un medio de cultivo normal, no pueden acumular las protenas de reserva 2S y 11S que se encuentran en los embriones cigoticos. La causa de esto es la insuficiencia de nutrientes ( 28 ). Para entender este fenmeno, se debe reconocer que el potencial embriognico del sistema de medio de cultivo es espectacularmente alto. Por ejemplo, en una caja de Petri se pueden desarrollar al mismo tiempo 900 embriones somticos en un medio de 25-30 ml. Aqu no hay suficiente N y S para el crecimiento de 900 embriones. Por lo que los medios de cultivos para la fase de maduracin deben contener grandes cantidades de glutamina y sulfato . Si los requerimientos de los embriones son satisfechos, tanto por el agregado de estos nutrientes como por la transferencia a un medio nuevo, los embriones somticos acumulan protenas de reserva que se aproxima el 50% de la cantidad encontrada en los embriones

cigoticos ( 27 ). La proporcin de sustancias de reservas que se acumulan en los embriones somticos es regulada por la relacin C:N en el medio de cultivo ( 27 ). Una alta relacin C:N incrementa la acumulacin relativa de carbohidratos con respecto a las protenas. Considerando que la nutricin juega un rol crtico en la maduracin de los embriones, se debe controlar aquellos factores fsicos que tienen influencia en la nutricin, como la densidad de siembra ( nmero de embriones somticos por caja de Petri ). En forma similar la intensidad de luz debe ser considerada durante el proceso de desarrollo del cultivo ( 29 ). C.- Tolerancia a la desecacin La tolerancia a la desecacin es una caracterstica de los embriones somticos que debe ser inducida y por lo tanto requiere de un pretratamiento con cido abscsico u otro factor para lograr la respuesta deseada. El tipo de pretratamiento, la duracin de su aplicacin y el estado de desarrollo del embrin son factores crticos ( 30 ). El sistema de secado de los embriones tiene una importancia secundaria. Si los embriones son inmaduros, un secado lento durante una semana es lo ideal, pero si predominan los embriones maduros un secado rpido es preferible ( 31 ). Tolerancia a la desecacin es una caracterstica cuantitativa y no cualitativa, por lo que los embriones varan en el grado de tolerancia. Esto es particularmente cierto entre diferentes especies, pero tambin se pone en evidencia con diferentes tratamientos inductivos ( 2 ). Durante el secado los embriones experimentan cambios metablicos, en particular con el tipo y cantidad de carbohidratos. Antes del secado, los embriones somticos de alfalfa contienen cantidades importantes de sucrosa, glucosa y fructosa; mientras que luego del secado, las cantidades de glucosa y fructosa disminuyen significativamente ( 32 ). Dada la importancia de estos azucares en el proceso de tolerancia a la desecacin en las semillas, estos cambios podran ser muy significativos ( 33 ). El mtodo de secado en alfalfa consiste en colocar los embriones somticos en una cmara sellada conteniendo una solucin salina saturada que controla la humedad relativa interior ( 31 ). Diariamente, durante una semana, los embriones son transferidos a cmaras con humedades relativas progresivamente mas bajas y finalmente se secan en condiciones de laboratorio. En este momento los embriones somticos han alcanzado un contenido de humedad de 1015 % y de este modo pueden ser almacenados por un periodo de tiempo superior al ao, sin que se afecte significativamente su viabilidad ( 32 ). D. - Encapsulado Los materiales usados para encapsular los embriones somticos son anlogos a la testa de las semillas naturales ( 9 ). Las testas sintticas no solo deben cumplir la funcin de proteccin fsica de los embriones somticos, sino que adems deben permitir que dichas cpsulas contengan nutrientes, antibiticos, funguicidas, microorganismos, etc. como elementos que favorecen la germinacin y posterior sobrevivencia de la plntula( 5 ). El encapsulado de los embriones somticos permite adems el manipuleo y empleo de equipos convencionales de siembra ( 10 ). Dos tipos de encapsulacin han sido desarrollados: hidratado y seco. Para ciertas especies hortcolas, que deben ser sembradas en el invernadero previo a ser transplantadas, embriones somticos no quiescentes colocados en una cpsula hidratada puede ser la solucin. Tal encapsulacin suministra proteccin a los embriones somticos y permiten un conveniente manejo similar a las semillas naturales. Para este tipo de encapsulacin se emplea alginato de calcio y ha tenido xito en varias especies; sin

embargo, el establecimiento permanece bajo todava ( 14 Los estudios de encapsulacin con hidrogeles como el alginato han sido pioneros en el desarrollo de la tecnologa de semillas artificiales, la informacin que se ha generado sientan las bases para buscar nuevas alternativas que hagan ms cercano el concepto de " semilla somtica " ( 34 ). Este mtodo tiene el inconveniente de la capacidad de almacenaje, no se han podido lograr periodos de almacenaje superiores a los 30 das. La forma de semilla artificial que ms se asemeja a la semilla natural en sus cualidades de almacenaje y manejo es la utilizacin de embriones somticos quiescentes y desecados en cpsulas simulando una testa. En este sistema se trata de hacer todava ms semejante la fisiologa y bioqumica de los embriones somticos con los sexuales. En zanahoria se ha desarrollado dicho mtodo, donde se emplea una resina plstica soluble llamado Polyox ( 35 ). Un medio de cultivo rico en embriones somticos se mezcla con Polyox y se secan con aire estril en condiciones ambientales de temperatura y humedad relativa. El secado es rpido, se alcanza el equilibrio en aproximadamente 4 horas. Solo los embriones encapsulados en Polyox sobreviven al secado; embriones somticos sin encapsular no sobrevivieron al secado. E.- germinacin, conversin y vigor Si bien los embriones somticos pueden ser secados y alcanzar contenidos de humedad del 10-15%, ser almacenados por varios meses; cuando se ponen a imbibir y germinar, el vigor de las plntulas de estos embriones somticos es muy inferior al vigor de las plntulas de semillas naturales ( 6 ). La razn de este bajo vigor no esta claro, pero existen varias explicaciones posibles. A los embriones somticos secos les puede faltar protenas de reserva o algn otro requerimiento esencial para el desarrollo de las plntulas. Incrementos en el nivel de protenas de reserva han mejorado el vigor ( 36 ). Los embriones somticos almacenan almidn y sucrosa, mientras que las semillas naturales almacenan una hemicelulosa en las paredes celulares llamada galactomanana. En un principio se pens que los carbohidratos no estaban disponibles para la germinacin de los embriones somticos, sin embargo, se observ que las reservas de almidn y sucrosa en los embriones somticos eran rpidamente consumidas luego de la germinacin ( 37 ). El consumo de agua de los embriones somticos secos es muy rpido en comparacin a las semillas naturales. Debido a que los embriones somticos les faltan una testa, no hay una barrera que controle el consumo de agua. Por lo que otra posible causa del vigor bajo de las semillas artificiales son los daos ocurridos durante el proceso de imbibicin. Otra causa que influye significativamente en el pobre vigor de las plntulas es el desarrollo anormal de la plmula. En el proceso de germinacin de embriones somticos se deben diferenciar dos trminos: " germinacin " que es definida como el proceso que culmina con la potrusin de la radcula y " conversin " que es la emergencia de la radcula y el tallo. Raramente un embrin somtico da origen a una plntula con parte area sin races; pero la emergencia de la radcula sin la plmula es muy comn. Esto nos estara indicando que los meristemas radiculares son ms resistentes al proceso de desecacin que los meristemas apicales. Por lo que si bien los porcentajes de germinacin entre semillas naturales y embriones somticos secos son muy similares; los porcentajes de conversin son mucho ms bajos en embriones somticos ( 37 ). Aunque las protenas y carbohidratos de reservas son hidrolizados rpidamente en el proceso de imbibicin, la germinacin de embriones somticos en un medio con nutrientes, origina plntulas sustancialmente ms vigorosas ( 38 ). Se piensa que uno de los principales factores que limita el desarrollo de las semillas artificiales es probablemente la disponibilidad de nutrientes. Para superar este problema,

los embriones somticos deben poseer su propia fuente de nutrientes ( alto contenido de protenas y carbohidratos de reserva) o proporcinaselos en forma endgena a travs de un endospermo artificial ( 6 ). F.- produccin comercial La automatizacin de la produccin de semilla artificial permitira reducir los costos de produccin y por lo tanto ser competitiva con la semilla natural ( 8 ). La produccin de semilla artificial puede ser dividida en etapas, cada una de las cuales son factibles de automatizacin. Etapas : 1.- Crecimiento de clulas embriognicas en un medio de cultivo. 2.- Seleccin de embriones somticos 3.- Encapsulado y deshidratacin Para la primer etapa se debe contar con sistemas de embriognesis somtica bien desarrollados y reproducibles cien por cien, que incluyan la produccin de embriones somticos de alta calidad a gran escala por medio de bioreactores El empleo de bioreactores para la produccin a gran escala de embriones somticos permite el control simultaneo del pH, la concentracin de oxigeno, de otros gases, el potencial de oxido-reduccin del medio, la temperatura y el mezclado. Los bioreactores adems permiten la cosecha continua de embriones somticos del medio de cultivo. Minimizan la contaminacin y maximizan la homogeneidad del cultivo ( 10 ). Un gran numero de embriones somticos pueden ser multiplicados en la masa de cultivo ( un gramo de inoculo origina 2300 embriones somticos en Dactylis glomerata) de un bioreactor. Para la segunda etapa es posible desarrollar equipos de clasificacin basados en la tecnologa de la mquina de visin, ya que los embriones somticos se ajustan dentro de un rango discreto por su tamao y forma ( 8 ). Tales mquinas debern permitir la eleccin de embriones somticos de alta calidad. Finalmente, la automatizacin del encapsulado y deshidratacin es factible de lograr en forma simultnea con el empleo de una testa sinttica osmticamente activa. Los embriones hidratados se colocaran en dicho material y comenzaran a perder agua durante el proceso de endurecimiento de la cpsula. El contenido de humedad final de las semillas artificiales se controlara por medio de la composicin de la mencionada testa sinttica ( 9 ).4. Aplicacin Prctica La semilla artificial al combinar el sistema de propagacin vegetativa ( multiplicacin clonal ) con la capacidad de almacenaje a largo tiempo tiene diversas aplicaciones en la agricultura ( 3, 8 ). La aplicacin de este sistema en la produccin de semilla hbrida de alfalfa ha sido discutida en detalles ( 4, 6 ). La semilla artificial ofrece la oportunidad de almacenar plantas genticamente heterocigotas o plantas sobresalientes con una nica combinacin de genes que no podran ser mantenidas por mtodos convencionales de produccin de semillas debido a la recombinacin gentica que existe en cada generacin de multiplicacin de semillas ( 9 ). Muchas especies son estriles y no producen semillas. La embriognesis somtica puede ser una alternativa con relacin a los esquejes para propagar este tipo de plantas. Otras especies, en particular algunas tropicales, producen semillas recalcitrantes que no pueden ser secadas. En consecuencia, el almacenaje de larga duracin en bancos de germoplasma en estas especies no es posible. La semilla artificial puede ser una alternativa en la medida que se conozca ms el mecanismo por el cual este tipo de semillas no presenta tolerancia a la desecacin ( 33 ).

En especies autgamas, donde la produccin de semilla hbrida es difcil y muy cara, la tecnologa de la semilla artificial ofrece muchas ventajas y oportunidades ( 12 ). Una de las limitantes del mtodo de micro propagacin es que deben estar en un mismo sitio fsico los laboratorios de cultivo de tejidos y los invernaderos, ya que la produccin de propgulos debe ser sincronizada en aquellos periodos de mxima demanda del mercado. La produccin de semilla artificial en estas especies no implicara ligar las instalaciones del laboratorio con los invernculos ( 8 ). Especies ornamentales El mercado de las especies ornamentales implica un movimiento anual de dinero muy importante. El alto costo de produccin de estas especies esta dado por la laboriosidad de la micro propagacin y la mano de obra necesaria en las etapas posteriores de multiplicacin y produccin. El empleo del sistema de embriognesis somtica en estas especies reducira significativamente los costos de mano de obra. Especies hortcolas En ciertas especies hortcolas se emplea semillas hbridas de alto costo y por lo tanto el valor por planta es muy alto. Por ejemplo, en tomate y sandia sin semillas se emplean semillas hbridas de muy alto costo. El motivo de este alto costo es que las polinizaciones se realizan en forma manual, requirindose un alto consumo de mano de obra. En otras especies se emplea la reproduccin vegetativa que tambin consume mucho tiempo, espacio y mano de obra. El empleo de la tecnologa de la semilla artificial reducira considerablemente los costos, al reducir la mano de obra necesaria, el tiempo y el espacio ( 41 ). Conferas Las especies forestales conferas pueden ser propagadas en forma econmica a travs de semillas. Los programas de mejoramiento gentico convencionales en estas especies consumen mucho tiempo ya que el ciclo de vida de las conferas es muy largo. Los montes de conferas son muy heterogneos ya que la semilla de individuos sobresalientes no necesariamente da origen a una progenie mejorada. La semilla artificial ofrece la posibilidad de clonar aquellos rboles sobresalientes a costos razonables y en un tiempo mnimo ( 9 ). Cultivos industriales En el mbito comercial es muy difcil producir semilla hbrida a bajos costos en especies como algodn ( Gossypium hirsitum L.) y soya ( Glicine max Merril .) debido a que presentan flores cleistgamas y con problemas de abscisin. Por lo que la semilla que se emplea actualmente en estas especies proviene de autopolinizaciones. Sin embargo, semilla hbrida en pequeas cantidades se produce en forma muy laboriosa por medio de la polinizacin manual. Este pequeo volumen de semilla hbrida podra ser multiplicado en forma masiva a travs de la tecnologa de la semilla artificial. De esta forma, el vigor hbrido podra ser utilizado a nivel comercial al originarse una reduccin importante de costos ( 42 ). Especies forrajeras La siembra de semilla de variedades sintticas es una prctica comn en especies forrajeras como alfalfa ( Medicago sativa L. ) y orchargrass ( Dactylis glomerata L.). Tales variedades provienen de la seleccin y entrecruzamiento de lneas fenotpicamente uniformes, pero distintas genotpicamente. Estas lneas al cruzarse libremente ao tras ao para producir semillas, originan poblaciones heterocigotas y heterogneas. El empleo de la semilla artificial permite la multiplicacin de genotipos sobresalientes y

genticamente uniformes, ya que por este mtodo no es necesario que anualmente se efectu la polinizacin cruzada ( 6 ). Frutales La gran mayora de las especies frutales se propagan vegetativamente debido a la presencia de autoincompatibilidad y a los ciclos de mejoramiento gentico muy largos. El empleo de la semilla sinttica facilitara su propagacin. Sin embargo, la mayor utilidad de la semilla artificial estara en la conservacin del germoplasma de estas especies ( 43 ). Actualmente se mantienen bancos de germoplasma como plantas vivas en el campo. Este mtodo de conservacin es muy caro y peligroso, ya que esta expuesto a los desastres naturales. El uso de semilla artificial permitira conservar estos clones en un pequeo espacio, en condiciones controladas ( cryopreservacin) y sin el peligro de los desastres naturales. Adems, este sistema de conservacin de germoplasma seria particularmente til en especies tropicales donde las medios de conservacin son inadecuados o inexistentes. La vid ( Vitis spp.) es un ejemplo prctico de este sistema de conservacin. Cereales En especies algamas como el maz donde la produccin de semilla hbrida es una prctica muy difundida. La creacin de hbridos a travs de un programa convencional de mejoramiento gentico consume mucho tiempo y recursos en la obtencin y mantenimiento de las lneas parentales adecuadas. Una posibilidad es el empleo de la semilla artificial para propagar aquellos genotipos sobresalientes sin la necesidad de generar lneas parentales costosas en tiempo y dinero. Esto podra facilitar la comercializacin de nuevos hbridos y estimular el surgimiento de nuevas empresas semilleras, ya que seria posible producir nuevos hbridos sin la necesidad de tener un gran volumen de lneas parentales ( 9 ). En especies autgamas como trigo, cebada y avena donde la produccin de semilla hbrida a nivel comercial no es posible por los altos costos de produccin, la semilla artificial permitira difundir la semilla hbrida. En este caso, se produciran pequeas cantidades de semilla hbrida en forma manual y luego, con la tecnologa de la semilla artificial se realizara la multiplicacin masal ( 44 ). Recuperacin de la flora autctona En nuestro planeta cada vez son mas las especies que estn en proceso de desaparicin por el manejo inconsciente del ser humano. Aumenta la tala indiscriminada de las selvas, aumenta la desertificacin, desaparecen bosques, etc. Muchas de estas especies nativas no se pueden propagar vegetativamente o producen muy bajas cantidades de semillas. Por tal motivo la semilla artificial es una alternativa para estas especies ( 45 ). Por ejemplo, en Australia ( 46 ) se ha logrado obtener eucaliptos tolerantes a los suelos salinos. Estos eucaliptos no pueden multiplicarse por estacas ni por semillas verdaderas. Una opcin es la tecnologa de la semilla artificial.Transgnicos Los cultivos provenientes de plantas genticamente modificadas han experimentado un gran auge en los ultimos aos. Existe poca informacin de lo que ocurre con estos organismos genticamente modificados en su proceso de reproduccin sexual. Cabe la posibilidad que durante su multiplicacin sexual, los genes introducidos de otras especies, sea inestables meiticamente y se pierdan. Con el empleo de la tecnologa de la semilla artificial se evitaran tales riesgos. En forma similar, esta tecnologa se podra emplear en la propagacin de hbridos somticos y citoplsmicos ( obtenidos a travs de la fusin protoplsmica ) y en genotipos estriles e inestables ( 44 ).

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