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Hemoglobinuria paroxstica nocturna: nuevos tratamientos y recomendaciones generales para su diagnstico

Paroxismal nocturnal hemoglobinuria: New treatments and general guidelines for diagnosis Marta Morado a,
a

, Dolores Subir b , Montserrat Lpez Rubio c,

Servicio de Hematologa, Hospital La Paz, Madrid, Espaa Servicio de Hematologa, Fundacin Jimnez Daz, Madrid, Espaa c Servicio de Hematologa, Hospital Universitario Prncipe de Asturias, Madrid, Espaa
b

Artculo
Introduccin La hemoglobinuria paroxstica nocturna (HPN) es un trastorno clonal, no maligno y adquirido de la clula madre hematopoytica pluripotente. Las clulas adquieren una mutacin somtica del gen PIG-A que condiciona la carencia total o parcial de la expresin de protenas de la membrana ancladas a travs del glucosil-fosfatidilinositol (GPI). Es una enfermedad rara y grave, con una incidencia de 0,050,13 casos por cada 100.000 habitantes por ao y una prevalencia de 0,7 casos por cada 100.000 habitantes. La mortalidad es del 50%, con una mediana de supervivencia de 22 aos1,2,3. La evolucin es heterognea, con remisiones espontneas en un 15% de los casos. El 25% de los pacientes vive ms de 25 aos. La trombosis o la hemorragia causan el 60% de las muertes, y un 15% desarrolla aplasia medular (AM), causa de muerte en un 10% de los pacientes. Aspectos clnicos Clnicamente se clasifica en 3 grupos1,4: HPN clsica: evidencia clnica de hemlisis intravascular con un clon de granulocitos de HPN cercano al 50% y sin enfermedad medular asociada. HPN asociada a otro trastorno medular: hemlisis asociada a otra enfermedad medular, generalmente AM o sndrome mielodisplsico (SMD). El tamao del clon de granulocitos de HPN es inferior al 30%. HPN subclnica: asocia fracaso medular con clones de HPN menores del 1%. Los pilares bsicos que caracterizan la clnica de la HPN clsica son los siguientes: 1) Anemia hemoltica intravascular no inmunitaria: los hemates son ms susceptibles a la accin del complemento debido a la carencia o a la disminucin de la expresin de las molculas ancladas a la membrana mediante GPI: CD55 (decay accelerating factor) y CD59 (membrane inhibitor of reactive lysis). Se produce un sndrome hemoltico crnico con crisis de agudizacin durante la noche o tras
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ingesta alcohlica o de frmacos, esfuerzos fsicos, infecciones, intervenciones quirrgicas, vacunaciones o menstruacin. Las crisis empeoran la anemia habitual con mal estado general, fiebre, dolor abdominal o lumbar y hemoglobinuria con hemosiderinuria que produce ferropenia. La intensidad de la hemlisis depende del clon de hemates de HPN: ms de un 20% de hemates de HPN tipo iii asocia hemlisis de forma invariable1,5,6,7. 2) Trombosis: ocurre hasta en el 50% de los pacientes y es la principal causa de mortalidad (el 30% de los casos). Parece estar mediada por la deplecin del xido ntrico (ON), la activacin plaquetaria con externalizacin de fosfatidil serina, la presencia de micropartculas celulares y la disfuncin del tissue factor pathway inhibitor y otras molculas fibrinolticas7. Tpicamente son trombosis en territorios venosos poco habituales, como los grandes vasos intraabdominales (sndrome de Budd-Chiari, la ms frecuente) y las venas cerebrales. Es ms infrecuente la afectacin arterial, las trombosis venosas drmicas o de pequeas venas abdominales, con crisis episdicas de dolor seudobstructivo. El riesgo de trombosis depende del clon de granulocitos de HPN: ms de un 50% de granulocitos de HPN (tipo ii y iii ) asocia mayor riesgo. 3) Distona del msculo liso: la deplecin del ON debida a su unin con la hemoglobina libre y al dficit de sntesis por carencia de arginina produce dolor abdominal, astenia, espasmos esofgicos, disfuncin erctil o disnea por hipertensin pulmonar8. 4) Insuficiencia medular: un 80% de los pacientes presenta citopenias y hasta un 15% desarrolla AM. Adems, un 30% de las AM tratadas con inmunosupresores desarrolla HPN, y se detectan pequeos clones hasta en el 68% de los casos9. Existe una correlacin fisiopatognica antes de AM y HPN: el ataque inmunolgico a las clulas progenitoras que ocurre en la AM podra venir mediado por protenas ancladas con GPI, y las clulas de HPN seran inmunitarias. La expansin de los clones de HPN se producira como un mecanismo de escape frente al fracaso de la hematopoyesis normal (teora del escape). Otras hiptesis apuntan a la posible resistencia a la apoptosis del clon de HPN10,11,12. Nuevos aspectos teraputicos El tratamiento de la HPN depende de la clnica principal de los pacientes. La transfusin de concentrados de hemates (no lavados) es el tratamiento para los casos con escasa hemlisis. Algunos pacientes responden a andrgenos o a glucocorticoides (1mg/kg/da). El tratamiento de la ferropenia debe hacerse con precaucin porque puede incrementar la hemlisis. La eritropoyetina es raramente beneficiosa, pero se recomienda el tratamiento con cido flico. Es importante evitar situaciones favorecedoras del riesgo trombtico. En el caso de trombosis venosa ya instaurada, hay que administrar anticoagulantes a largo plazo. Actualmente, el nico tratamiento curativo es el trasplante alognico de progenitores hematopoyticos, pero su alta mortalidad hace que se considere slo en pacientes jvenes con donante HLA (human leukocyte antigen) compatible y fallo medular. El gran avance producido en el tratamiento de esta enfermedad se debe al eculizumab. Es un anticuerpo IgG humanizado dirigido contra la fraccin C5 del complemento que bloquea la cascada del complemento a la altura de C5 e impide la formacin del complejo de ataque de la membrana y evita su accin ltica. Es el tratamiento de eleccin de pacientes con HPN clsica porque consigue disminuir la hemlisis, mejorar la astenia, la anemia, reducir los requerimientos transfusionales y mejorar la calidad de vida de los pacientes13,14,15,16,17. Se ha demostrado su eficacia en la disminucin del riesgo trombtico al reducir la hemlisis y el consumo de
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ON17,18,19, aunque slo se ha demostrado su beneficio antitrombtico en pacientes con necesidades transfusionales. Estudios recientes demuestran, adems, su efecto en la reduccin del deterioro de la funcin renal y el desarrollo de hipertensin pulmonar19. El eculizumab se tolera bien y tiene escasos efectos secundarios. La inhibicin de la fase terminal del sistema del complemento aumenta el riesgo de infecciones por bacterias encapsuladas, especialmente del gnero Neisseria, por lo que debe realizarse la vacunacin frente al meningococo 2 semanas antes de iniciar el tratamiento. La interrupcin implica hemlisis, as que la administracin es de por vida (900mg i.v. cada 2 semanas). En algunos pacientes hay que disminuir el intervalo entre las dosis (cada 12 das) para evitar hemlisis en los das previos a la administracin del frmaco. La hemlisis extravascular puede persistir por la presencia sobre la membrana eritrocitaria de C3b, no eliminado por el decay accelerating factor (CD55), que puede responder a eritropoyetina o a glucocorticoides en casos clnicamente relevantes19. El uso de CD59 recombinante humano20 est en fase experimental. Registro de Hemoglobinuria Paroxstica Nocturna El Registro Internacional de HPN (disponible en: www.phnregistry.org ) es parte del plan de gestin de riesgos exigido por la Food and Drug Administration y la Agencia Europea del Medicamento tras la aprobacin del eculizumab (Soliris, Alexion). Su objetivo es evaluar la eficacia y la seguridad a largo plazo de este frmaco con especial atencin en la incidencia de infecciones graves, hemlisis tras la interrupcin del tratamiento, reacciones infusionales, aparicin de neoplasias secundarias y complicaciones durante la gestacin y en neonatos. Sus datos ayudarn a definir la progresin de la enfermedad, la respuesta clnica y la morbimortalidad en pacientes tratados y no tratados con eculizumab. El Registro recoge datos analticos y el tamao del clon de HPN en hemates y granulocitos medidos por citometra de flujo. El Comit Coordinador del Registro Espaol de HPN apoya la creacin de guas de consenso para homogeneizar los datos de los pacientes incluidos. Diagnstico de hemoglobinuria paroxstica nocturna por citometra de flujo Las tcnicas clsicas para el diagnstico de HPN (test de Ham o Sucrosa) requieren un 5% de clulas tipo iii (ausencia total de protenas asociadas a GPI) o un 20% de clulas tipo ii (ausencia parcial). Los test basados en tarjetas de gel tienen una sensibilidad similar. Por su mayor sensibilidad, la citometra de flujo multiparamtrica (CFM) es la tcnica de eleccin para el actual diagnstico de HPN1,5,6. Sin embargo, cada laboratorio adopta una tcnica distinta al no existir recomendaciones nacionales o internacionales, lo que dificulta la estandarizacin2,6,21. Un comit de expertos nacionales en CFM se reuni en Madrid (enero, 2009) con el objetivo de llegar a un consenso en los puntos esenciales del diagnstico de HPN por CFM. Las conclusiones se resumen en la tabla 1. Indicaciones del estudio de HPN Hay que realizar el estudio de HPN en casos de anemia hemoltica no inmunitaria y hemoglobinuria y en pacientes con trombosis en sitios infrecuentes, como sndrome de Budd-Chiari o trombosis de las venas abdominales, cerebrales o drmicas1. Se ha descrito la deteccin de pequeos clones de HPN en pacientes con AM o SMD (incluso en ausencia de hemlisis) y, con tcnicas de alta resolucin, en casos de anemia refractaria con exceso de blastos, sndrome 5q y mielofibrosis1,22,23. Dado que el mayor nmero de casos se centra en AM y SMD tipo anemia refractaria simple, el grupo recomienda realizar la bsqueda de pequeos clones celulares de HPN (<1%) en estas 2 entidades por el posible beneficio del tratamiento inmunosupresor. Podra indicarse el estudio en SMD hipoplsicos y en citopenias mantenidas
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no explicadas. Consideraciones generales El estudio de la expresin de molculas asociadas a GPI debe realizarse en al menos 2 lneas celulares y al menos 2 antgenos5,6, con lo que se evitan confusiones debidas a polimorfismos proteicos (CD16), ausencia congnita de expresin de algn antgeno, influencia de la hemlisis o el efecto de la transfusin. Lo habitual es realizar el estudio en neutrfilos (o monocitos) y hemates, en una muestra de sangre anticoagulada con cido etilendiaminotetractico (no con heparina). El estudio en la mdula sea debe evitarse por la presencia de formas mieloides en diferentes estadios madurativos, ya que la expresin de las molculas asociadas a GPI vara durante la maduracin5,6,24. Por este mismo motivo, debe descartarse la presencia de formas inmaduras en sangre en los casos asociados a displasia, mediante citologa o el estudio de antgenos, como CD13 y CD11b. Los granulocitos deben procesarse en las 24h siguientes a la extraccin de la muestra. Los hemates pueden conservarse hasta 2 semanas a 4C4,6. Tcnicas disponibles 1) Tcnica de la aerolisina-FLAER (fluorescein-labelled aerolysin): la variante no hemoltica de la toxina procedente de la Aeromonas hydrophila marcada con fluorescena permite detectar leucocitos tipo HPN con una sensibilidad del 0,5%, asociado o no a otros marcajes leucocitarios25. El grupo de citometristas carece de suficiente experiencia para hacer recomendaciones. 2) Red-Quant y Cell-Quant (Byocytex, Marsella, Francia): son sistemas de bolas precalibradas para el estudio de hemates y leucocitos. El grupo no aconseja utilizar esta tcnica, ya que considera como normal detectar hasta un 3% de clulas de HPN25,26. 3) Estudio en slo un tubo: permite el estudio simultneo de hemates y leucocitos en slo un tubo mediante un sistema de doble adquisicin27. La tcnica es sencilla, rpida y fcilmente reproducible. El inconveniente es que pueden no quedar suficientes leucocitos para realizar una segunda adquisicin, necesaria si el clon es escaso. 4) Estudio en tubos independientes: la mayora del grupo procesa y adquiere los hemates y los leucocitos por separado. Otra opcin vlida es realizar un rastreo inicial en neutrfilos y monocitos y, si es compatible con HPN, procesar despus los hemates. Diagnstico de HPN: estudio de poblaciones celulares 1) Leucocitos (figura 1): el marcaje con mltiples anticuerpos monoclonales (AcMo) es de eleccin, ya que permite aumentar la sensibilidad5,6,21. El grupo coincide en utilizar marcaje directo con AcMo; es preferible elegir molculas que se expresen de forma intensa y homognea en clulas normales de sangre, con poca afinidad por uniones inespecficas5,6,28. Los ms utilizados son CD16 (FcRIIIB), CD24, CD66, CD55 y CD59 en neutrfilos; CD14, CD55 y CD59 en monocitos, y CD59 y CD55 en hemates. Menos tiles son CD52 (linfocitos y monocitos), CD87 (neutrfilos, monocitos y linfocitos T activados) o CD48 (linfocitos y
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monocitos). Los AcMo deben estar a la concentracin adecuada y se recomienda usar una sangre normal como control positivo6.

Figura 1. Mujer de 76 aos con anemia hemoltica no inmunitaria diagnosticada de hemoglobinuria paroxstica nocturna (HPN). Las flechas indican la posicin que deberan ocupar los leucocitos en un individuo sano. En esta paciente, sin embargo, slo un pequeo porcentaje de neutrfilos (celeste) y monocitos (azul) mantiene la intensidad de expresin adecuada de CD16, CD66 y CD24 (neutrfilos), CD14 (monocitos) y CD59 y CD55 (neutrfilos y monocitos). A diferencia de ellos, el clon de neutrfilos HPN+ (rojo) y monocitos HPN+ (violeta) presenta una menor intensidad o carece de la expresin de estas molculas. El clon de HPN (tipo ii y iii ) representa el 98% de los granulocitos y el 97% de los monocitos. La expresin de CD55 y CD59 en leucocitos est condicionada por el hecho de que los hemates absorben estos 2 AcMo, lo que reduce la intensidad de fluorescencia y aumenta el coeficiente de variacin, hecho que no ocurre con el resto de los AcMo no expresados en hemates. Para el estudio de CD55 y CD59 en leucocitos, el grupo recomienda lisar los hemates y despus marcar los leucocitos6 (tcnica de lisado-marcaje). Para el resto de marcadores se puede realizar marcaje seguido de lisis (tcnica habitual de marcaje-lisado). El grupo recomienda utilizar CD16, CD24 y CD66 para el marcaje de neutrfilos y CD14 para el marcaje de monocitos5,6,21. En un primer paso pueden utilizarse nicamente CD16 y CD142,29 con procesamiento habitual. El estudio de CD55 y CD59 en leucocitos se puede realizar posteriormente cuando exista un clon de clulas de HPN y siempre por la tcnica de lisado-marcaje. Para descartar la presencia de neutrfilos hipogranulados se recomienda incluir un anticuerpo no asociado a GPI6 (CD15 o CD33), que permita separar neutrfilos de monocitos. No se recomienda el estudio de linfocitos (mayor vida media)5,6 ni el de plaquetas (expresin dbil y variable de CD55 y CD596). 2) Hemates (figura 2): aunque tradicionalmente est descrito un mayor riesgo de aglutinacin, la evaluacin multiparamtrica permite aumentar el nivel de sensibilidad de la tcnica y reducir la tasa de falsos positivos y negativos5,6,21. El grupo recomienda el marcaje simultneo de hemates con CD55 y CD592,5,6,21 y, dadas las caractersticas de tamao y complejidad, se recomienda realizar la adquisicin con el diagrama forward scatter component (luz dispersada hacia delante) (FSC)/side scatter component (luz dispersada en ngulo recto) (SSC) en escala logartmica5,6. Puede aadirse el AcMo CD235 (glucoforina A) para seleccionar la poblacin eritroide. Hay que ajustar la concentracin de hemates (dilucin 13%) y el tiempo de incubacin de los AcMo, ya que influye en la intensidad de fluorescencia y en el coeficiente de variacin27. La recomendacin del grupo es incubar 15min, y puede aumentar a 30min si la poblacin clonal es escasa o se utiliza la tcnica en slo un tubo. Dos lavados separan mejor las poblaciones21, pero uno es suficiente.

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Figura 2. Identificacin del clculo del tamao clonal en hemates. La expresin de glucoforina A identifica al conjunto de hemates y la intensidad de expresin de la molcula CD59 permite separar un 66% de hemates normales o tipo i (amarillo), un 28% de hemates con dficit parcial o tipo ii (verde) y un 6% de hemates con dficit total o tipo iii (negro). Tamao del clon de HPN: clculo, seguimiento y sensibilidad. El Registro de HPN exige incluir el tamao del clon de clulas de HPN, imprescindible para valorar el riesgo trombtico y hemoltico de cada paciente1,5,6. El clculo en granulocitos es independiente de transfusin y se recomienda utilizar cualquiera de los antgenos ya descritos: CD16, CD66, CD24 o CD55 (mejor que CD59). Se debe informar el porcentaje de granulocitos tipo ii ms tipo iii . La clasificacin fenotpica de la HPN en los tipos i , ii y iii debe hacerse en los hemates, ya que esta poblacin permite la mejor definicin de cada tipo2,3,4,5. El antgeno CD59 es el que mejor permite identificar las subpoblaciones de hemates de HPN, pero puede utilizarse CD55 y CD59 en marcaje combinado1,2,5,6 (figura 2). Debe informarse el porcentaje de hemates tipo i , ii y iii , especialmente este ltimo. En pacientes transfundidos, debe repetirse el estudio transcurrido un mnimo de un mes1,2. El seguimiento del tamao clonal debe incluir las siguientes determinaciones30: 1) en pacientes con HPN tratados con eculizumab al inicio del tratamiento, a los 6 meses y de forma anual; 2) en pacientes con HPN clsica sin tratamiento y HPN asociada o subclnica anual, y 3) ante cualquier cambio clnico. La capacidad de detectar clones pequeos de HPN depende del nmero de AcMo utilizados: el 23% de las clulas HPN con un nico AcMo, el 1% con 2 AcMo y hasta el 0,01% con 3 AcMo. La mxima sensibilidad (el 0,003% en granulocitos y el 0,005% en hemates) se consigue con tcnicas de alta resolucin con marcaje mltiple (mnimo 3 AcMo) y al adquirir un mnimo de 100.000 episodios9,23. Hay que advertir que pueden detectarse clones de HPN en individuos sanos, en muy baja cantidad (1050 granulocitos/milln; 8 hemates/milln), sin que ello suponga el diagnstico de HPN5,31. El problema de la sensibilidad se plantea porque el Registro permite incluir tambin los casos de HPN asociada a otra enfermedad medular (tamaos clonales inferiores al 30%) y los casos de HPN subclnica (clones menores del 1%). Adems, en AM y SMD, los clones de HPN oscilan entre un 5068% y un 1223% de los casos, respectivamente, de acuerdo con la sensibilidad de la tcnica. En el 40 al 80% de los casos, los clones son menores de un 1% (figura 3). Este grupo de pacientes parece tener una mejor respuesta a tratamiento inmunosupresor, con mayor tasa de remisin completa y supervivencia libre de enfermedad9,23,32,33. En los sndromes de fallo medular, la tcnica debe identificar clones cuyo porcentaje sea menor del 1%1,4. El grupo
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recomienda alcanzar una sensibilidad del 0,1% y adquirir 100.000 episodios con marcaje mltiple.

Figura 3. Varn de 19 aos diagnosticado de aplasia medular. Las flechas indican la posicin que ocupan los neutrfilos (celeste) y los monocitos (azul) sanos de este paciente. Sin embargo, existe un clon de clulas de hemoglobinuria paroxstica nocturna (HPN) + que abarca a un 2% de los neutrfilos (rojo) y a un 1,2% de los monocitos, con una menor intensidad de expresin de las molculas CD16 y CD24 (neutrfilos) y CD14 (monocitos) y CD59 y CD55 en ambas poblaciones. El antgeno CD64, que no se ancla a la superficie a travs de la glucosil-fosfatidilinositol, tiene la misma intensidad de expresin en las clulas de HPN+ y las clulas de HPN. Tabla 1. Resumen de las conclusiones de los puntos esenciales del diagnstico de la hemoglobinuria paroxstica nocturna por citometra de flujo Muestra Conservacin Lneas celulares Sangre perifrica obtenida en EDTA Granulocitos 24 h y hemates 15 das a 4 C Demostrar prdida de 2 antgenos en 2 lneas celulares Hemates y neutrfilos (+/ monocitos)

Leucocitos Antgenos Marcaje

CD16, CD66, CD24 en granulocitos y CD14 en monocitos Marcaje-lisado Para CD55 y CD59 en leucocitos: lisado-marcaje Usar un anticuerpo no asociado a GPI para separar poblaciones (CD15 y CD33)

Hemates Antgenos Marcaje Tiempo de incubacin Estudio inicial

CD59 (preferente) y CD55 Multiparamtrico (CD55 /CD59). Puede aadirse GlyA Adquisicin con FSC y SSC en escala logartmica Mnimo 15min En leucocitos: CD16 en granulocitos y CD14 en monocitos Si es HPN, estudiar hemates

Fenotipo de HPN (I, CD59 en hemates II, III) Tamao del clon En granulocitos: tipo ii + iii (riesgo trombtico) Seguimiento En hemates: tipo iii (riesgo hemoltico) Tratados con eculizumab: al inicio, a los 6 meses y anual
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No tratados, subclnica o asociada: anual Siempre que cambie la clnica Indicaciones Anemia hemoltica no inmunitaria Hemoglobinuria Trombosis en localizaciones infrecuentes Aplasia medular Sndromes mielodisplsicos tipo anemia refractaria simple o hipoplsicos Citopenias mantenidas no explicables Para los casos de HPN subclnica o asociada: el 0,1% (adquirir 100.000 episodios con marcaje multiparamtrico)

Sensibilidad

EDTA: cido etilendiaminotetractico; FSC: forward scatter component (luz dispersada hacia delante); GlyA: glicoforina A; GPI: glucosil-fosfatidil-inositol; HPN: hemoglobinuria paroxstica nocturna; SSC: side scatter component (luz dispersada en ngulo recto). Conclusiones La aprobacin de eculizumab ha cambiado el enfoque de la HPN y ha puesto en marcha el Registro Internacional de HPN en Espaa. La CFM es fundamental en el diagnstico, la evaluacin inicial del riesgo hemoltico y trombtico, el clculo del tamao clonal al diagnstico y su evolucin tras el tratamiento. Su capacidad para detectar pequeos clones de clulas de HPN en casos de fallo medular permite seleccionar a pacientes con posibilidades teraputicas especficas. Este documento de consenso entre citometristas espaoles describe los puntos esenciales para el estudio de HPN por CFM y asegura unos criterios comunes en la recogida de datos para el Registro. Conflicto de intereses Los autores declaran no tener ningn conflicto de intereses. Agradecimientos El grupo agradece al laboratorio Alexion Pharma Spain la colaboracin prestada para la realizacin de la reunin que deriv en este consenso. Anexo I. Grupo Espaol para el estudio de HPN por citometra: Marta Morado (Hospital Universitario La Paz, Madrid, Espaa), Dolores Subir (Fundacin Jimnez Daz, Madrid, Espaa), Jos M. Bosch (Hospital Insular de Las Palmas, Las Palmas, Espaa), Mara ngeles Cuadrado (Hospital Universitario Marqus de Valdecilla, Santander, Espaa), Angelina Lemes (Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrn, Las Palmas, Espaa), Amparo Sempere (Hospital Universitario La Fe, Valencia, Espaa), Mara Beln Vidriales (Hospital Universitario de Salamanca, Salamanca, Espaa) y Montserrat Lpez Rubio (Hospital Universitario Prncipe de Asturias, Madrid, Espaa) (coordinadora del Registro de Hemoglobinuria Paroxstica Nocturna en Espaa). Recibido 29 Junio 2009
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Aceptado 10 Septiembre 2009 Autor para correspondencia. mmorado.hulp@salud.madrid.org

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