UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE Facultad de Qumica y Biologa Departamento de Biologa Dr.

Pablo Nelson Hunt

LABORATORIO 1 Separacin de Protenas por Cromatografa de Exclusin Molecular.

Introduccin Para estudiar la funcin o las propiedades de una protena, como por ejemplo su secuencia, actividad, o estructura, es de gran importancia obtenerla como una especie pura. Los mtodos habitualmente utilizados en la purificacin de protenas, se basan algunas de las caractersticas de stas, incluyendo su tamao, carga o capacidad de unin. El conjunto de mtodos que tienden a separar protenas provenientes de un extracto es denominado fraccionamiento, entre los que destacan las cromatografas en columna. Los mtodos cromatogrficos habitualmente utilizados en el estudio de protenas son las cromatografas de exclusin molecular o filtracin en gel, de intercambio inico, de afinidad y el HPLC. En el presente prctico se nos presenta como objetivo la separacin de protenas contenidas en una mezcla, mediante una cromatografa de exclusin molecular, utilizando como fase estacionaria Sephadex G75. Una de estas protenas es la fosfatasa cida de germen de trigo.

Procedimiento Experimental. 1.- Preparacin de la columna. Se montar una columna de Sephadex G-75. Coloque un pedazo de lana de vidrio en el fondo de la columna de vidrio. Cierre la llave de paso de la columna y llnela con agua destilada. Posteriormente, abra la llave de paso y deje escurrir el agua hasta llegar a la mitad de la columna. De esta forma evitar la formacin de burbujas a la salida de la columna. Agregue la suspensin de Sephadex G-75 y deje sedimentar. Posteriormente, abra el flujo de la columna y contine agregando Sephadex hasta formar una columna empaquetada de 10 a 12 cm. Equilibre la columna hacindole pasar 2 volmenes de agua.

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE Facultad de Qumica y Biologa Departamento de Biologa Dr. Pablo Nelson Hunt 2.- Sembrado y elucin de la muestra. Se utilizarn dos muestras. La primera de ellas, una solucin de Azul Dextrano, y la segunda una mezcla que contiene albmina srica de bovino (BSA; 2mg/mL), fosfatasa cida de germen de trigo (2mg/mL), y citocromo C (1mg/mL). Eluya el agua de la columna hasta que la superficie del gel est a punto de secarse. Con una micropipeta agregue 500 L de muestra. Eluya muy lentamente, hasta que la muestra haya ingresado completamente en el gel. Agregue agua a la columna. Comience la elucin de la muestra, colectando fracciones de 1 mL en tubos eppendorf.

3.- Confeccin del cromatograma. En papel milimetrado, se confeccionarn los perfiles de elucin de protenas obtenido. Mida la absorbancia de cada una de las fracciones colectadas a 280 y 550 nm, usando eluyente como blanco. Grafique Abs v/s nmero de fraccin. Interprete los resultados obtenidos, y guarde fracciones representativas para los mximos. No olvide guardar un mnimo como control negativo..

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LABORATORIO 2 Determinacin de la Concentracin de Protenas por el Mtodo de Bradford

Introduccin Se han descrito numerosos mtodos que permiten determinar la concentracin de protenas, todos ellos presentan ventajas y desventajas. La eleccin del mtodo depender de la naturaleza de la protena, la naturaleza de los otros componentes en la muestra o la sensibilidad o sencillez deseadas. Los mtodos ms tradicionalmente usados se basan en diferentes propiedades qumicas y fsicas de las protenas., siendo los principales los ensayos de Biuret, Lowry y Bradford. Este ltimo se basa en la propiedad del colorante azul de coomassie G-250 de unirse a las protenas, presentando un mximo de absorcin a 595 nm. La coloracin es proporcional a la concentracin de protenas, obtenindose un comportamiento lineal en el rango de 0 a 30 g de protenas. Anteriormente, fue determinado mediante el mtodo de absorcin UV la presencia de mximos de absorbancia a 280 nm en las fracciones colectadas en la separacin cromatogrfica. El objetivo del presente prctico ser calcular la concentracin de protenas presentes en las fracciones ms importantes. Procedimiento Experimental. 1.- Elaboracin de una curva de calibracin. Se trabajar a partir de una solucin stock de BSA de concentracin 1mg/mL. El reactivo de Bradford disponible es comercial, y se utilizar en una dilucin 1:5. Disponga de 10 tubos eppendorf, los cuales contendrn 0, 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40 y 50 g de BSA. Enrase a un volumen final de 50 L con agua destilada. Agregue 950 L de reactivo de Bradford. Mezcle y deje esperar por 5 minutos. Mida absorbancia a 595 nm. Grafique en un papel milimetrado los datos obtenidos y trace la recta correspondiente al rango lineal.

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE Facultad de Qumica y Biologa Departamento de Biologa Dr. Pablo Nelson Hunt 2.- Determinacin de la concentracin de protenas de la muestra. Para la medicin de protenas, Ud deber seleccionar las fracciones correspondientes a los mximos de su cromatograma. Tambin ser deseable utilizar un mnimo. En tubos eppendorf agregue 10 L la muestra y enrsela a 50 L con agua destilada. Repita procedimiento anterior. Recuerde que los valores de absorbancia obtenidos al medir las muestras deben entrar en el rango lineal de la curva de calibracin. De no ser as, plantese las soluciones al problema.

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LABORATORIO 3 Separacin Electrofortica de Protenas en Geles de Poliacrilamida en Condiciones Desnaturantes

Introduccin Una molcula con carga neta posee la capacidad de poder moverse a travs de un campo electrico. Este fenmeno, denominado electroforesis, es ampliamente utilizado para la separacin de diversas macromolculas, como protenas, DNA y RNA. Sin embargo, esta tcnica no es utilizado para la purificacin de grandes cantidades de protenas; mas bien se utiliza como mtodo analtico, que nos permitir separar y visualizar el nmero de protenas, y por ende, el grado de pureza de una muestra. Este objetivo es de gran importancia a la hora de determinar eficiencia de un proceso de fraccionamiento de protenas. Otra ventaja que nos proporciona esta tcnica es que nos permite estimar propiedades de la protenas como su punto isoelctrico y su masa molecular relativa. En experiencias anteriores, Ud ha separado protenas mediante una tcnica cromatogrfica y posteriormente ha cuantificado la cantidad de stas mediante el mtodo de Bradford. En el presente prctico, se buscar verificar el grado de pureza de sus fracciones, a la vez de determinar las protenas presentes en cada una de ellas, valindose del mtodo de electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturantes.

Procedimiento Experimental 1.- Preparacin del gel de poliacrilamida. El gel a preparar est formado por un gel separador (inferior) y un gel concentrador (superior). Para la preparacin de stos realice las siguiente mezclas: Gel Separador (5 mL poliacrilamida 10%): 1,9 mL H 2O 30% mezcla Acrilamida 1,7 mL 1,5 M Tris (pH 8,8) 1,3 mL 10% SDS 0,05 mL 10 % Persulfato de Amonio 0,05 mL TEMED 0,002 mL

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE Facultad de Qumica y Biologa Departamento de Biologa Dr. Pablo Nelson Hunt Gel Concentrador (2 mL poliacrilamida 5%): 1,4 mL H 2O 30% mezcla Acrilamida 0,33 mL 1,0 M Tris (pH 6,8) 0,25 mL 10% SDS 0,02 mL 10 % Persulfato de Amonio 0,02 mL TEMED 0,002 mL Antes de armar el sistema de vidrios (segn las instrucciones del profesor o del ayudante), lvelos con agua y etanol. Vierta la solucin del gel separador, hasta aproximadamente de la capacidad de los vidrios. Posteriormente, agregue mL de etanol o isopropanol. Una vez gelificada la solucin, retire el alcohol. Vierta la solucin del gel separador, y coloque la peineta antes su gelificacin.

2.- Preparacin de la muestra. De cada muestra se cargarn 20 L por bolsillo, que contengan 1 y 5 g de protenas. Adems de sus muestras, se dispondr de una solucin patrn de BSA (1mg/mL), de la cual se cargarn 1 g. En tubos eppendorf coloque sus muestras, con buffer de carga y complete con agua hasta 25 L (la proporcin de muestra y buffer de carga depender de la concentracin de este ltimo). Coloque sus muestras en agua hirviendo por 5 minutos. Posteriormente ponga los tubos en hielo, hasta cargar las muestras.

3.- Carga y corrida de la muestra. Coloque el gel en la cmara de electroforesis, segn instrucciones, y posteriormente agregue buffer de corrida (25 mM Tris, 250 mM glicina, 0,1% SDS). Con ayuda de una jeringa Hamilton, cargue 20 L de cada muestra. Cargue 5 L del estndar de peso molecular. Conecte la cmara de electroforesis a la fuente de poder y aplique 180 V. Una vez finalizada la corrida electrofortica, retire el gel y corte el gel separador. El gel ser fijado y teido en una solucin de cido actico en metanol, que contiene azul de coomasie (Comercial). El ayudante le facilitar una fotografa de su gel, a partir de la cual Ud. determinar los tamaos relativos de cada muestra resuelta.

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LABORATORIOS 4 y 5 Determinacin de las Propiedades Cinticas de la Enzima Fosfatasa Acida de Germen de Trigo
Introduccin Las enzimas son protenas con un gran poder cataltico y un alto grado de especificidad por su sustrato. Estas protenas poseen gran importancia en todos los procesos bioqumicos. Actuando en forma concertada, catalizan cientos de reacciones que llevan, entre otros, al metabolismo de nutrientes, la conservacin o transformacin de energa o la biosntesis de macromolculas. La reaccin ms simple que pueden catalizar las enzimas est representada por la ecuacin:

Donde E, S y P, representan a la enzima, al sustrato y al producto, respectivamente, mientras que ES y EP representan los complejos transitorios enzima-sustrato y enzima-producto. Para caracterizar el funcionamiento de una enzima, es importante determinar el como las condiciones ambientales, el pH y la temperatura, afectan su capacidad cataltica. En este trabajo prctico se trabajar con la fosfatasa cida de germen de trigo, la cual cataliza la hidrlisis de fosfatos monosteres, con liberacin de fosfato inorgnico, segn la siguiente reaccin:

Dentro de los objetivos a cumplir, se encuentran el determinar las condiciones ptimas de trabajo de la fosfatasa cida de germen de trigo, as como los parmetros cinticos de sta, comparando las actividades especficas tanto de la enzima comercial como la purificada en prcticos anteriores. En este ensayo, se usar un sustrato artificial, el p-nitrofenil fosfato (NPP). El grado de hidrlisis de ste se determinar espectrofotomtricamente cuantificando el p-nitrofenol liberado, que en solucin alcalina, absorbe fuertemente a 405 nm.

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE Facultad de Qumica y Biologa Departamento de Biologa Dr. Pablo Nelson Hunt Procedimiento Experimental. 1.- Elaboracin de una curva de calibracin de p-nitrofenol. Prepare 6 tubos que contengan 0, 125, 250, 500, 750 y 1000 L de una solucin de pnitrofenol 60 M (en NaOH 0,05M). Enrase cada uno de los tubos a 1 mL con NaOH 0,05 M. Para cada uno de los tubos lea la absorbancia a 405 nm. Verifique que su blanco sea el apropiado. En papel milimetrado grafique la curva obtenida

2.- Determinacin de las condiciones ptimas para la actividad de la fosfatasa cida de germen de trigo. Se verificar la obtencin de producto a tiempos fijos en diferentes condiciones de pH y temperatura. Prepare un tubo que contenga 200 L de amortiguador y 200 L del sustrato pnitrofenil fosfato (pNPP 2,5 mM, diludo en el amortiguador correspondiente), por cada temperatura de ensayo (4, 37 y 60C). Preincube cada tubo a la temperatura de ensayo por 2-5 minutos. Prepare una dilucin de enzima que sea 1:20 con respecto al stock (10 mg/ml) en el amortiguador respectivo. Agregue 100 L de la dilucin de la enzima (1:20) a cada tubo de reaccin. Mezcle e inmediatamente saque una alcuota de 100 L y deje el tubo de reaccin a la temperatura correspondiente. Adicione la alcuota a un tubo que contenga 900 L de una solucin de NaOH 0,05 M. Guarde el tubo en oscuridad. Este es el control denominado tiempo cero de reaccin. Al cabo de 5, 10 y 20minutos de incubacin, retire nuevas alcuotas del tubo de reaccin y adicinelas a respectivos tubos que contengan 900 L de NaOH 0,05 M. Determine la absorbancia a 405 nm de cada uno de los tubos. Verifique que su blanco sea el apropiado. Calcule los moles de Pi formados en cada tubo a diferentes tiempos y la velocidad (moles/min). Grafique en papel milimetrado la actividad enzimtica con respecto a la temperatura y el pH de reaccin.

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE Facultad de Qumica y Biologa Departamento de Biologa Dr. Pablo Nelson Hunt 3.- Determinacin de los parmetros cinticos de la fosfatasa cida de germen de trigo y el efecto del fosfato en la reaccin. Tras determinar los parmetros ptimos de pH y temperatura para el funcionamiento de la enzima, aplique stos en la determinacin de Km y Vmax para la enzima comercial. Prepare un serie de 5 tubos que contengan 0, 50, 100, 150 y 200 L de p-NPP 2,5 mM y enrselos a 400 L con el amortiguador apropiado. Repita esta serie, pero adicionando adems 5, 10 o 20 L de fosfato de sodio (50 mM). Preincube los tubos a la temperatura apropiada por 2-5 minutos. Agregue 100 L de la dilucin de la enzima (1:20) a cada tubo de reaccin. Mezcle e inmediatamente saque una alcuota de 100 L y adicinela a un tubo que contengan 900 L de NaOH 0,05 M. Seleccione 2 tiempos de reaccin (5, 10, 20 o 30 minutos) y retire nuevas alcuotas del tubo de reaccin, adicionndoselas a respectivos tubos que contengan 900 L de NaOH 0,05 M. Determine la absorbancia a 405 nm de cada uno de los tubos. Confeccione las curvas pertinentes tanto en presencia como en ausencia de fosfato y determine los valores de Km y Vmax.

4.- Determinacin de los parmetros cinticos de la fosfatasa cida de germen de trigo purificada en los prcticos anteriores. Trabaje con las mismas condiciones de pH y temperatura utilizadas anteriormente y determine los valores de Km y Vmax para una fraccin de su enzima purificada. Prepare un serie de 5 tubos que contengan 0, 50, 100, 150 y 200 L de p-NPP 2,5 mM y enrselos a 400 L con el amortiguador apropiado. Preincube los tubos a la temperatura apropiada por 2-5 minutos. Agregue a cada tubo de reaccin 100 L de su enzima diluida en el amortiguador apropiado, dejndola a una concentracin 0,5 mg/mL (protena total). Mezcle e inmediatamente saque una alcuota de 100 L y adicinela a un tubo que contengan 900 L de NaOH 0,05 M. Incube los tubos a los mismos tiempos anteriormente utilizados y retire nuevas alcuotas del tubo de reaccin, adicionndoselas a respectivos tubos que contengan 900 L de NaOH 0,05 M. Determine la absorbancia a 405 nm de cada uno de los tubos. Determine los valores de Km y Vmax. Calcule la actividad espcfica y comparela con la obtenida para la enzima comercial.

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Soluciones. Tampn Citrato (citrato de sodio 100mM; EDTA 150mM pH 5.0). Tampn PBS (NaCl 137mM, KCl 2,6mM, NaHPO4 8mM, KH2PO4 1,8mM, pH 7,4). Tampn Tris (Tris 100mM, pH 9,5) Solucin NaOH 0.05 M Solucin de p-nitrofenol 60 M en NaOH 0,05M. Solucin stock de p-nitrofenil fosfato de sodio 25 mM en agua. Solucin stock de fosfatasa cida 10mg/ml. Solucin de Fosfato de Sodio 50 mM en agua.