Historia e Importancia de la Resonancia Magntica Nuclear (RMN)

Historia e Importancia de la Resonancia Magntica Nuclear (RMN)

Descripcin Bsica del Fenmeno de la RMN

Propiedades Magnticas de los Ncleos (ver Tabla 1)

P = h/2 I

=P
Carga movindose en un crculo Ncleo esfrico girando sobre s mismo

= h/2 I

= momento magntico P = momento angular

= constante magnetogrica o giromgnetica h = constante de Planck (6.6256 x 10-34 J s)

I = nmero cuntico de espn nuclear I = 0, 1/2, 1, 3/2, 2, 5/2,.......

Relacin entre n msico, n atmico y n cuntico de espn (I)

N msico par impar par

N atmico par par/impar impar

I
0 1/2, 3/2, 5/2 1, 2, 3

Ncleos
12C , 16O , 32S 6 8 16 1H, 13C, 19F, 15N, 31P 11B 2H , 14N 1 7

Ncleo sin espn I=0

Esfera girando I = 1/2

Elipsoide girando I = 1, 3/2, 2, 5/2

Descripcin Bsica del Fenmeno de la RMN

Campo Magntico B0 (Teslas) 1T = 104 gauss

Par de fuerzas

Movimiento de precesin

Ecuacin de Larmor Cuantizacin Direccional

0 = /2 B0

0 = frecuencia de precesin (frecuencia de Larmor)

Pz = h/2 m

m = nmero cuntico magntico o direccional

m = I, I-1,........-I

I = nmero cuntico de espn nuclear

z = h/2 m
Existirn 2I + 1 valores posibles de m y por lo tanto 2I + 1 orientaciones posibles del momento angular (Pz) y del momento magntico (z) respecto a la direccin del campo magntico B0.
1H

y 13C

I = 1/2

2 posibles orientaciones

m = 1/2, -1/2

2H

y 14N

I=1

3 posibles orientaciones

m = 1/2, 0, -1/2

Descripcin Bsica del Fenmeno de la RMN

Niveles de Energa
La energa de interaccin entre un dipolo magntico (ncleo) y un campo magntico con una densidad de flujo B0 viene dada por la ecuacin (1).

(1) E = z B0

E = m h/2 B0

Para un ncleo con 2I + 1 orientaciones posibles existirn tambin 2I + 1 estados de energa que se denominan niveles nucleares Zeeman.

I=1 I = 1/2
1 2

H, 14N E-1 = h/2 B0 E0 = 0 E+1 = - h/2 B0

H, 13C E = +1/2 h/2 B0

m = -1 m=0 E = -1/2 h/2 B0 m = +1

m = -1/2 ( ) 0 m = +1/2 ()

La diferencia de energa entre 2 niveles adyacentes ser

Variacin de E con B0

E = h/2 B0
Para un protn en un B0 = 7.04 T (300 MHz), la diferencia de energa entre los estados de espn es de slo 0.0286 cal/mol (0.120 J/mol)
Variacin de E con (B0 = 7.04 T)

B0 = 7.04 T

= 26.75

= 6.73

= 2.71

Descripcin Bsica del Fenmeno de la RMN

Distribucin de Boltzmann. Poblaciones de espn

N
E

N / N = eE / kT
N = poblacin en el estado de espn de menor energa N = poblacin en el estado de espn de mayor energa E = diferencia de energa entre los dos estados de espn k = constante de Boltzmann (1.3805 x 10-23 J K-1) T = temperatura absoluta

Experimento de RMN:

E = h/2 B0

N >> N

Temperaturas bajas y E grandes B0 grandes grandes (1H >> 13C > 15N)

La sensibilidad (intensidad) de la seal en un experimento de RMN es proporcional a la diferencia de poblaciones entre los niveles energticos correspondientes que a su vez depende de la constante magnetogrica () del ncleo, del campo magntico aplicado (B0) y de la temperatura. En el caso de los protones y para un B0 = 7.04 T (300 MHz), de cada milln de espines slo hay 50 ms en el nivel energtico inferior que en el superior.

Magnetizacin Macroscpica
Si N > N, la suma de todos los momentos magnticos dar lugar a una magnetizacin macroscpica M0 a lo largo de la direccin del campo aplicado B0 (eje z)

Condicin de Resonancia
Para que se d una transicin efectiva entre dos niveles energticos:

E = h rad

E = h/2 B0
espectro

rad = /2 B0 = 0 (frec. de Larmor)

condicin de resonancia

Descripcin Bsica del Fenmeno de la RMN

Instrumentacin
El imn es el componente esencial de cualquier espectrmetro de RMN. Estos imanes pueden ser permanentes, electroimanes y en los aparatos modernos estn basados en solenoides superconductores enfriados por helio lquido. 1) El campo magntico debe ser fuerte, ya que como hemos visto antes la sensibilidad del experimento de RMN se incrementa con la fuerza del campo magntico B0 aplicado. 2) El campo magntico debe ser extremadamente homogneo de manera que todas las partes de la muestra lo experimenten del mismo modo. Por ello la muestra se encuentra siempre girando durante el experimento de RMN. 3) El campo magntico debe ser muy estable durante el desarrollo del experimento que puede durar desde algunos segundos a varias horas e incluso das. Frecuencias de resonancia para el 1H y el 13C a diferentes densidades de flujo B0

B0 (T) 1.41 1.88 2.11 2.35 4.70 5.87 7.05 9.40 11.74 14.09 17.62 18.79

Frecuencias de Resonancia (MHz)

1H 13C

60 80 90 100 200 250 300 400 500 600 750 800

15.1 20.1 22.63 25.15 50.3 62.9 75.4 100.6 125.7 150.9 188.2 201.2

Existen dos mtodos generales para llevar a cabo un experimento de RMN: ONDA CONTINUA y PULSOS DE RADIOFRECUENCIA.

Mtodo de Onda Continua

rad = h/2 B0

Mtodo del campo variable Mtodo de la frecuencia variable

Espectro de Onda Continua a 60 MHz de terc-butilmetilcetona

CH3 O H3C C CH3 C CH3

Mtodo de Pulsos de Radiofrecuencia (Richard Ernst)

En el mtodo de pulsos todos los ncleos de una especie (todos los 1H o todos los 13C de una muestra) se excitan simultneamente por un pulso de radiofrecuencia muy intenso y de una nica frecuencia 0.

Pulso de Radiofrecuencia 0 p = anchura de pulso (s)

0 1/p

0 + 1/p

Si la irradiacin tiene lugar en un tiempo muy corto (p), se obtiene un pulso que contiene no slo la frecuencia 0 sino un rango que va desde 0 1/p hasta 0 + 1/p. Cuanto ms corto sea el pulso ms ancha ser la banda de frecuencias

Objetivo del Experimento de RMN

El objetivo de un experimento de RMN es medir la magnetizacin de la muestra despus de la irradiacin con el pulso de radiofrecuencia.

M0 Magnetizacin macroscpica (longitudinal) Magnetizacin transversal

B0

(1)

(2)

Bobina receptora

Sin embargo, como la bobina receptora est orientada en la direccin del eje y (2), habr que desviar la magnetizacin longitudinal M0 de la direccin del eje z (1) un cierto ngulo que permita obtener una componente de la magnetizacin en la direccin del eje y (magnetizacin transversal) y poder medirla (2).

Par de fuerzas

(3)

Transmisor RF

B1

(4)

Esto se va a conseguir situando el transmisor de radiofrecuencia en la direccin del eje x (4). Cuando se produce un pulso intenso y de corta duracin generado por un campo magntico adicional B1 en la direccin del eje x, se va a producir un par de fuerzas (3) sobre el vector M0 que le hace abandonar el eje z apareciendo una componente en el plano xy (magnetizacin transversal) que va a poder ser medida.

Tcnica de Pulsos en RMN

0

B0

(b) (a)

(c)

(a) En la situacin de equilibrio existe un exceso de espines que giran a la frecuencia de Larmor alrededor del eje +z, dando lugar a la magnetizacin macroscpica longitudinal M0 a lo largo de la direccin del campo B0. (b) Para inducir transiciones, se aplica un pulso de radiofrecuencia muy corto y muy intenso en forma de un campo magntico adicional B1, en la direccin del eje x perpendicular al campo magntico inicial B0. (c) Bajo la influencia del campo B1, los dipolos nucleares, que antes giraban de una manera uniforme distribuidos al azar, van a empezar a girar en fase agrupados (coherencia de fase) separados un ngulo de la posicin de equilibrio dando lugar a la componente xy de la magnetizacin que ser la seal detectada electrnicamente.

Tcnica de Pulsos en RMN

z

= B1 p = B1 p

y x x

y x

B1 0 < < 90 M0 > Mz > 0 0 < My < max

= 90
Mz = 0; My = max

= 180
Mz = - M0; My = 0

El ngulo que se desva el vector M0 del eje z despus del pulso de radiofrecuencia

= B1 p y su valor se puede modificar variando la intensidad (B1) y la duracin del pulso (p).
se denomina ngulo de pulso:

+ En la figura se representa como vara la intensidad de la seal de RMN de una determinada muestra con el ngulo de pulso y con la anchura de pulso, es decir, con la duracin del mismo (p). La Intensidad intensidad de la seal es mxima de la seal y positiva para una anchura de pulso de 15 s ( 90 grados), es cero para una anchura de 30 s (180 grados) y es mxima pero negativa para una anchura de pulso de 45 s (270 grados). +

pulso 90

pulso 180 anchura de pulso p (s)

pulso 270

Procesos de Relajacin
Si la aplicacin del pulso intenso de radiofrecuencia a travs de B1 se detiene cuando la magnetizacin alcanza el eje y (pulso de 90 grados) se podr detectar su seal electrnicamente y registrar la variacin de la magnetizacin transversal en funcin del tiempo. Despus del pulso, el sistema tiende a recuperar el equilibrio a travs de los llamados procesos de relajacin: relajacin espn-red y relajacin espn-espn.

Proceso de Relajacin Espn-Red o Longitudinal

El proceso de relajacin espn-red supone la vuelta al equilibrio de la magnetizacin longitudinal M0 ya que tras el pulso de 90 grados Mz = 0 (a). La velocidad a la que se recupera la condicin de equilibrio Mz = M0 tras interrumpir el pulso (t = 0) viene determinada por el Tiempo de Relajacin Longitudinal T1 espn-red (b).

(a)

(b)

El tiempo de relajacin longitudinal espn-red T1 se define como el tiempo necesario para reducir la diferencia entre la magnetizacin longitudinal Mz y su valor de equilibrio M0 en un factor de e.

Excitacin Pulso RF (c) 6 arriba 4 abajo 5 arriba 5 abajo

Relajacin T1 (d) 6 arriba 4 abajo

A nivel de estados de espn, esto supone que tras la excitacin (c) las poblaciones de espn de los dos niveles de energa se igualan N = N. La velocidad a la que los niveles de energa vuelven a su estado de equilibrio (d), es decir N > N, depende de T1. Este proceso implica transiciones desde el nivel superior al nivel inferior que conllevan la emisin de energa que es absorbida en forma de calor por la red, es decir, por las molculas vecinas en disolucin.

Proceso de Relajacin Espn-Espn o Transversal

El proceso de relajacin espn-espn supone la destruccin de la magnetizacin transversal My , cuyo valor es mximo tras el pulso de 90 grados (a), y el retorno a su situacin de equilibrio de valor cero. La velocidad a la que se recupera la condicin de equilibrio My = 0 tras interrumpir el pulso (t = 0) viene determinada por el Tiempo de Relajacin Transversal T2 espn-espn (b), es decir, tras la excitacin la magnetizacin transversal decae exponecialmente con el tiempo.

(a)

(b)

El Tiempo de relajacin transversal espn-espn T2 se define como el tiempo necesario para reducir la magnetizacin transversal en un factor de e.

A nivel de estados de espn, esto supone que los espines tienden a perder el movimiento de precesin sincronizado, es decir, la coherencia de fase que haban adquirido tras el pulso de radiofrecuencia, debido a que en ausencia de B1 cada paquete de espines empieza a manifestar un campo magntico un poco diferente y empieza a girar a su propia frecuencia de Larmor.

A efectos prcticos, si los procesos de relajacin son demasiado eficientes las seales observadas en el espectro de RMN sern muy anchas con la prdida de resolucin que eso implica. Si la relajacin es muy lenta la seal observada en el espectro de RMN es muy dbil, de poca intensidad.

Obtencin de la FID y Transformada de Fourier

Inmediatamente despus del pulso de 90 grados la magnetizacin transversal es mxima, los ncleos vuelven a su estado de equilibrio y el magnetismo de la muestra se detecta electrnicamente en funcin del tiempo. La reduccin de la magnetizacin transversal con el tiempo origina una curva (b) que se denomina FID (Free Induction Decay) y que decae exponecialmente a una velocidad determinada por el tiempo de relajacin espn-espn T2.
1/
FID (Free Induction Decay)

(a)

(b) FID de la acetona

t (T2)

Esta curva va ser ligeramente distinta a la que habamos visto antes (a) debido a que la frecuencia de irradiacin y la frecuencia de resonancia de los ncleos observados nunca es exactamente igual. El intervalo de tiempo entre mximos sucesivos vale 1/ donde es la diferencia entre las frecuencias de irradiacin y de resonancia.

(c) FID del acetato de metilo

(d)

Cuando existen dos ncleos resonantes como es el caso del acetato de metilo, sus curvas de magnetizacin se superponen creando una FID ms compleja (c). En general, la FID de cualquier compuestos es muy compleja (d) y contiene todas las frecuencias de Larmor (o de resonancia) de cada tipo de ncleos (protones por ejemplo) diferentes que hay en la muestra. Sin embargo, la FID no puede ser interpretada directamente.

Transformada de Fourier
Para obtener la informacin til que proporciona esta tcnica es necesario transformar la FID dependiente del tiempo (a) en un espectro de RMN dependiente de la frecuencia (b). Ernst descubri que era posible extraerlas frecuencias de resonancia de los ncleos de una muestra a partir de la FID mediante una operacin matemtica denominada transformada de Fourier que lleva a cabo un ordenador.

Transformada de Fourier

tiempo

frecuencia

El proceso completo de la tcnica de pulsos se puede comparar con presionar a la vez todas las teclas de un piano con ambos brazos. Todos los tonos estn ah pero son difciles de distinguir individualmente. Un ordenador puede discernir los diferentes tonos o frecuencias.

tiempo

frecuencia

Si los procesos de relajacin son demasiado eficientes, las seales observadas en el espectro de RMN sern muy anchas. A nivel de FID, cuanto mayor sea la cada exponencial de la misma, es decir, cuanto menor sea el tiempo de relajacin T2, ms ensanchadas aparecern las seales en el espectro de RMN como se comprueba en el grfico.

Acumulacin de Espectros
Normalmente, la intensidad de una FID individual es tan dbil que despus de la transformada de Fourier (TF) las seales en el espectro de RMN son muy pequeas comparadas con el ruido de fondo. La ventaja del mtodo de pulsos es que se necesita un tiempo muy corto para obtener una FID por lo que en un breve espacio de tiempo se pueden sumar (acumular) un gran nmero de FIDs individuales y al final realizar la TF de todas ellas para obtener el correspondiente espectro con mucha mejor resolucin.

N = Nmero de veces que acumulamos la FID S = Intensidad de la seal en el espectro de RMN, proporcional a N R = Intensidad del ruido de fondo, proporcional a N

S R

El resultado de la acumulacin de N FIDS ser que la intensidad de la seal del espectro de RMN va a aumentar en un factor de N, mientras que el ruido se incrementa slo en un factor de la raz cuadrada de N. La relacin seal / ruido ser entonces proporcional a la raz cuadrada del nmero de medidas. La tcnica de pulsos es la ideal para realizar experimentos de RMN en los que intervengan ncleos con una abundancia natural muy baja como el C-13 o el N-15.

FID y espectro de 1H-RMN (Transformada de Fourier) de terc-butilmetilcetona

O CH3 CH3 CH3 CH3

Instrumentacin

1. Imn
a) bobinas superconductoras b, c) entradas del helio y nitrgeno lquidos d) camisas de vaco y aislamiento

2. Sonda 3. Muestra 4. Turbina 5. Bobinas transmisora y receptora Transmisor de radiofrecuencia Amplificador/Receptor Ordenador

Aspectos Experimentales
Preparacin de Muestras
Los espectros de RMN se suelen medir en disolucin utilizando un tubito de vidrio de unos 5 mm de dimetro. Normalmente se requiere un volumen de disolvente de 300-400 l y la cantidad de muestra depender del ncleo que queramos estudiar: para espectros de RMN-1H normalmente es suficiente en torno a 5 mg, mientras que para RMN-13C se requieren ente 50 y 100 mg.

Tubo de RMN

Muestra en disolucin

Disolventes (ver Tabla 2)

La muestra debe ser totalmente soluble en el disolvente que utilicemos que deber ser uno que no contenga protones para evitar que la seal del disolvente aparezca en el espectro. En un principio se usaron disolventes sin protones como el CCl4, muy txico, o el CS2, que huele muy mal. Sin embargo hoy en da se utilizan disolventes deuterados como el CDCl3, el D2O o la CD3COCD3 debido a que el ncleo de deuterio no va a dar seal en el espectro de RMN de protn. Dado que el grado de deuteracin nunca es del 100%, siempre se observarn pequeas seales debidas a la porcin de disolvente que queda sin deuterar. Por ejemplo, en el caso de utilizar CDCl3, que es uno de los ms comunes, siempre va a aparecer un pico que va a corresponder a la seal del CHCl3 sin deuterar.

CLOROFORMO-d 1

CH Cl 3

Si el disolvente o la muestra no estn secos puede aparecer una seal un poco ancha que va a corresponder a trazas de agua que contenga alguno de los dos.