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Monitoraggio del rischio ambientale, cancerogeno, mutageno

Master Universitario di II livello (2013-2014)

Biologia cellulare e tecniche ultrastrutturali applicate al monitoraggio ambientale

Prof.ssa Fulvia Sinatra Dipartimento G.F.Ingrassia Universit Universit degli Studi di Catania

Campi di Applicazione della Microscopia elettronica


Tecniche di microscopia elettronica a trasmissione convenzionale che consentono di studiare la struttura fine di una cellula o di un tessuto mediante lanalisi di sezioni ultrasottili. Negative staining al microscopio elettronico a trasmissione per losservazione di campioni molto piccoli quali batteri, virus e macromolecole biologiche. Tecniche di immunoelettromicroscopia, in particolare immunogold in pre- e postembedding e su negative staining che permettono la localizzazione di antigeni di superficie ed intracellulari mediante utilizzo di anticorpi. Metodiche di ibridazione in situ in microscopia elettronica che permette di localizzare frammenti di acidi nucleici a livello ultrastrutturale. Tecniche di microscopia elettronica a scansione convenzionale che permettono di studiare la morfologia di superficie di campioni biologici ed abiologici mediante analisi di un campione spesso.

E possibile quindi analizzare: interazione tra batteri e cellule eucariotiche localizzazione cellulare degli antigeni selezionati e del loro possibile ruolo nellinterazione con le cellule eucariotiche allo scopo di sviluppare nuovi vaccini studio di biofilm batterici studi su dispositivi medici potenziali marker di malattie neurodegenerative Nanotecnologie Nanotecnologie in diagnostica ed in terapia medica Analisi strutturale e ultrastrutturale di sistemi biologici finalizzato ad applicazioni biomediche;

Ed ancora trova applicazione in: Scienza dei biomateriali Ingegneria tissutale Medicina rigenerativa Inquinamento ambientale Mineralogia: Analisi chimiche e morfologiche di strutture cristalline Geochimica: Analisi chimiche e morfologiche di rocce magmatiche metamorfiche e sedimentarie Micropaleontologia: Analisi morfologiche su microfossili Diagnostica per beni culturali: Reperti archeologici (ceramiche, vetri, monete), malte, affreschi. Analisi ambientali:Fibre asbestiformi massive o prelevate in ambiente Membrane polimeriche:Analisi morfologiche di strutture porose polimeriche

ecc.

Locchialino per vedere da vicino cose minime


Galileo Galilei: Lettera a Federico Cesi; Firenze 23 Settembre 1924

Microscopi ottici
Consentono di risolvere e ingrandire oggetti di piccole dimensioni, la cui analisi si realizza nell'ambito dello spettro elettromagnetico della luce.

Microscopi elettronici
Consentono di risolvere e ingrandire oggetti di piccole dimensioni per mezzo di un fascetto di elettroni

Come nasce la microscopia


, un cristallo trasparente, casualmente pi spesso al centro che ai bordi, e not che attraverso di esso poteva osservare oggetti ingranditi. .....quel cristallo poteva far convergere i raggi del sole dando fuoco a delle foglie secche o ad un panno. Le lenti da ingrandimento e quelle ustorie sono menzionate gi negli scritti di Seneca e di Plinio il vecchio, primo secolo d.c., ma apparentemente non sono state usate molto fino all'invenzione degli occhiali, verso la fine del XIII secolo. Furono chiamate lenti per la loro forma, che ricorda quella di una lenticchia.

Il microscopio semplice pi antico era costituito soltanto da un tubo con una piastra per l'oggetto da osservare ad un'estremit e, all'altra, da una lente obiettivo in grado di dare un ingrandimento di circa dieci diametri dieci volte la dimensione reale. pi lenti montate in un singolo tubo...... oggetti vicini apparivano notevolmente Ingranditi microscopio composto

Galileo, studi i principi fisici del funzionamento delle lenti e costru uno strumento di maggior qualit, dotato di un dispositivo di focalizzazione : occhialino diGalilei, Padre Giovanni Faber di Bamberga, medico del papa Urbano VIII, il13 aprile 1625 scriveva : "Et perch io fo anche mentione di questo nuovo occhiale di veder le cose minute, et lo chiamo microscopio".

molatura e la lucidatura delle lenti, che erano molto piccole e di grande curvatura, offrendo ingrandimenti fino a 270 diametri, il massimo conosciuto a quel tempo. Pot descrivere i batteri, il lievito, la vita presente in una goccia di acqua e la presenza di corpuscoli nei vasi capillari
l'olandese Anton van Leeuwenhoek (1632-1723)

(16351702)

Robert Hooke (1635-1702): migliora il microscopio precedente e osservando sezioni di sughero descrive le prime cellule

Gli strumenti di oggi, evoluti ma sostanzialmente immutati, offrono ingrandimenti fino a circa 1250 diametri con luce ordinaria e 5000 con luce blu.

Un microscopio luce, anche se con obiettivi perfetti e illuminazione ideale, non consente in modo semplice di distinguere oggetti che siano pi piccoli di met della lunghezza d'onda della luce utilizzata. La luce bianca ha una lunghezza d'onda media di 0,55 micrometri, la cui met 0,275 micrometri. Tutte le coppie di punti o linee che sono tra loro pi vicine di 0,275 micrometri saranno viste come singolo punto o singola linea e qualunque oggetto con un diametro inferiore a 0,275 micrometri sar invisibile o, nel migliore dei casi, sar rilevabile come una zona di sfocatura. Per vedere particelle molto piccole al microscopio, gli studiosi devono escludere la luce bianca ed usare una specie differente di illuminazione", con una lunghezza d'onda pi corta

MICROSCOPIA ELETTRONICA gli elettroni sono accelerati nel vuoto con una lunghezza d'onda estremamente corta, pari a un centomillesimo di quello della luce bianca. Il fascio di elettroni viene focalizzato su un campione che ne pu essere attraversato o dal quale gli elettroni possono essere assorbiti o deflessi in modo da formare un'immagine su uno schermo fluorescente o su di una lastra fotografica.

CRONOLOGIA DELLO SVILUPPO DEL MICROSCOPIO 1000 d.c. circa pietra da lettura, una sfera di vetro che ingrandiva il testo da leggere quandoveniva poggiata su di esso. 1284 circa L'italianoSalvino D'Armate accreditato come inventore delle prime lenti indossabili l'occhiale. 1590 Z Janssen ed il figlio, sperimentano le possibilit offerte da lenti multiple disposte in un tubo. gli oggetti osservati attraverso il tubo appaiono notevolmente ingranditi; nascono cos i precursori del microscopio composto e del telescopio. 1665 Un fisico inglese, Robert Hooke, osserva una striscia di sughero attraverso un microscopio e ne descrive la struttura a "pori" o "cellulare". 1674 Anton van Leeuwenhoek costruisce un microscopio semplice con una unica lente. Leeuwenhoek il primo a descrivere cellule e batteri; inventa nuovi metodi, per la costruzione e la lucidatura delle lenti, che permettono curvature tali da fornire ingrandimenti di fino a 270 diametri, le migliori lenti per microscopio disponibili a quel tempo.

XVIII secolo: innovazioni tecniche migliorano i microscopi, rendendoli popolar fra gli scienziati. Lenti costruite unendo due tipi differenti di vetro riducono "l'aberrazione cromatica", l'alone di disturbo che deriva dalle differenze nella rifrazione di luce bianca. 1830 Joseph Jackson Lister riduce l'aberrazione sferica o "l'effetto cromatico" dimostrando che numerose deboli lenti montate assieme a determinate distanze danno un buon ingrandimento senza offuscare l'immagine. 1872 Ernst Abbe, direttore di ricerca della Zeiss Optical Works di Jena, scopre una formula matematica "Abbe Sine Condition". La sua formula alla base dei calcoli che consentono di ottenere la massima risoluzione possibile in microscopia. 1903 R. Zsigmondy sviluppa l'ultramicroscopio che permette lo studio di oggetti al di sotto della lunghezza d'onda della luce. Premio Nobel per la chimica nel 1925. 1932 C. Zernike inventa il microscopio a contrasto di fase utilizzabile per lo studio di materiali biologici incolori e trasparenti. premio Nobel per la fisica nel 1953. 1931 Ernst Ruska inventa il microscopio elettronico ,premio Nobel per la fisica nel 1986. Un microscopio elettronico utilizza gli elettroni per osservare un oggetto; gli elettroni sono accelerati sotto alto vuoto fino a che la loro lunghezza d'onda non sia estremamente corta, soltanto un centomillesimo di quella della luce visibile. I microscopi elettronici permettono di osservazione dioggetti del diametro di un atomo. 1981 G Binnig e H Rohrer inventano lo Scanning Tunnelling Microscope (microscopio a scansione ad effetto tunnel) che fornisce immagini tridimensionali al livello atomico della superficie dei campioni esaminati. Premio Nobel per la fisica nel 1986. Il microscopio a scansione ad effetto tunnel il microscopio pi potente fino ad oggi ideato.

Scala Scalalogaritmica logaritmicadelle delledimensioni dimensioni 1mm Onde radio 100 m 10 m 1 m Visibile 0,1 m (1000 ) 0,01 m (100 ) 0,001 m (10 ) Limite microscopio elettronico 4 0,0001 m (1)
Micoplasmi 0,10,1-0,2 m Virus 0,10,1-0,01m Proteine 0,0050,005-0,01m Aminoacidi 8-12 Atomi 1-4
14

Limite dellocchio umano 75 m

Cellule epiteliali 40 m Emazie 6-7 m Batteri 2m

Infrarosso Limite microscopio ottico a luce bianca 1m

Limite microscopio ottico a luce ultravioletta Ultravioletto 0,2-0,1m

Il microscopio ottico come punto di partenza


Binoculare In campo chiaro In campo scuro A contrasto di fase A fluorescenza A luce polarizzata A contrasto interferenziale Confocale a scansione

Il limite inferiore di visibilit ()

E la minima distanza alla quale devono essere posti due punti per potere essere osservati come distinti. Il suo reciproco il potere risolutivo (D). A causa dei fenomeni di diffrazione della luce, un punto al microscopio ottico non visibile come tale ma come un cerchietto luminoso il cui diametro uguale ad .

Occhio umano: pu risolvere particolari fino ad un max di = 0,2 mm(o 200 m) Per migliorare questa risoluzione e consentire una visione distinta di particolari pi piccoli di 0,2 mm, si deve interporre tra loggetto e locchio stesso, una LENTE DI INGRANDIMENTO, max +4 diottrie: = 0,02 mm (20 m, x 10) MICROSCOPIO OTTICO: = 0,2 m (200 nm, x100, con un ingrandimento max rispetto allocchio di 1000 diametri) Lingrandimento ci fa vedere unimmagine di maggiore dimensioni ma non aumenta la risoluzione (unosservazione migliore dei dettagli).

Se i due punti sono posti ad una DISTANZA SUPERIORE OD UGUALE ad i due punti si osserveranno come distinti.

d = limite inferiore di visibilit

Se i due punti sono posti ad una DISTANZA INFERIORE ad i due cerchietti luminosi saranno pi o meno sovrapposti; il nostro occhio non in grado di distinguere i due punti che saranno pertanto osservati come se fossero un unico punto.

d<e

LIMITE INFERIORE DI VISIBILITAo di Risoluzione (Formula di ABBE)

= / 2n sen Apertura numerica dellobiettivo (AN) Indica il potere di risoluzione dellobiettivo (capacit di distinguere due punti vicini) = Lunghezza donda della luce utilizzata n = Indice di rifrazione del mezzo interposto tra preparato ed = Angolo di apertura della lente obiettivo (formato dai raggi luminosi rifratti pi esterni rispetto allasse dellobiettivo)

POTERE RISOLUTIVO
E il reciproco del limite inferiore di visibilit ():

1 2nsen D = --- = ----------

= -----------2n sena

AN

D ed sono grandezze inversamente proporzionali: Maggiore il potere risolutivo, minore lindice inferiore di visibilit e viceversa

Il potere risolutivo
Dello strumento di osservazione determina il livello di dettaglio contenuto nellimmagine.

Lingrandimento
Non determina un aumento di risoluzione delle immagini.

Apertura Numerica (A.N)


Se osserviamo con il microscopio oggetti di piccole dimensioni, la lucei ncidente su questi oggetti viene deviata (diffratta) rispetto alla direzione originaria. Quanto pi piccoli sono gli oggetti, tanto maggiore la deviazione. Per ottenere immagini nitide di piccole strutture, lobiettivo del microscopio deve raccogliere il pi possibile questa luce diffratta. Ci funziona particolarmente bene se lobiettivo copre un ampio angolo

Ogni mezzo ha il suo INDICE DI RIFRAZIONE, che la capacit di deviare i raggi luminosi secondo un angolo pi o meno pronunciato. L'indice di rifrazione dipende dalla densit del mezzo e dalle sue caratteristiche chimico-fisiche.

L'INDICE DI RIFRAZIONE si identifica con la lettera "n".

Confronto Confronto tra tra MO, MO, TEM TEM e e SEM SEM

Elettronico Elettronico a a trasmissione trasmissione

Ottico Ottico Elettronico Elettronico a a scansione scansione


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