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MICROSCOPIO A FLUORESCENZA

Microscopia a fluorescenza
Il preparato viene illuminato con luce ultravioletta ad una determinata lunghezza donda ed i suoi componenti vengono esaminati in base alla fluorescenza emessa. La sorgente luminosa una lampada a vapori di mercurio che emette radiazioni ultraviolette (invisibili).

La microscopia a fluorescenza
La fluorescenza quella propriet per cui particolari sostanze (molecole), dette FLUORESCENTI, colpite da luce ultravioletta (radiazione eccitante con compresa tra 250 e 400 nm) vengono eccitate, cio sono capaci di emanare in risposta un fascio di luce (luce di fluorescenza) dello spettro del visibile ( compresa tra 400 e 700 nm) e quindi maggiore o uguale a quella della luce di eccitazione. Le immagini appaiono colorate su fondo scuro. Il colore della luce di fluorescenza dipende dal filtro di eccitazione e dal fluorocromo.

La fluorescenza decade pi o meno rapidamente (quenching) poich le molecole eccitate per tornare allo stato fondamentale trasferiscono lenergia assorbita a molecole circostanti sotto forma di agitazione termica; poich la luce accentua tale fenomeno, i preparati vengono allestiti in penombra, conservati e osservati al buio. Ogni molecola fluorescente ha un proprio: 1. Spettro di eccitazione: gamma di frequenze per cui essa si eccita; 2. Spettro di emissione Entrambi con un picco massimo.

La microscopia a fluorescenza
Le sostanze possono essere dotate di: A - Fluorescenza primaria: quando la fluorescenza viene emessa naturalmente (es. vitamina A, riboflavina, porfirine, clorofille, etc.). B - Fluorescenza secondaria: quando la fluorescenza viene indotta artificialmente trattando il preparato con particolari sostanze fluorescenti dette FLUOROCROMI (es. acridina orange, Hoechst, fluoresceina, rodamina, giallo lucifero, etc.). La specificit della fluorescenza dipende dalla specificit del legame tra fluorocromo e sostanze tissutali.

IL MICROSCOPIO A FLUORESCENZA a luce incidente (riflessa) Blocco di filtri per fluorescenza a luce riflessa

MICROSCOPIO A FLUORESCENZA a luce incidente (riflessa )

Lampada a mercurio

Filtro di eccitazione

Specchio interferenziale e filtro di sbarramento

Il colore della luce di fluorescenza dipende dal filtro di eccitazione il quale seleziona le lunghezze donda necessarie per eccitare i fluorocromi.
Sorgente luminosa Filtro deccitazione

Preparato

Filtro di sbarramento: fa passare solo le radiazioni fluorescenti

Larresto della radiazione eccitante importante poich le radiazioni ultraviolette sono lesive per la retina e possono impressionare la pellicola fotografica.

Fluorescenza del nucleo indotta da Hoechst


(Spermatodesma di Ortottero)

Spermatodesmi di cavalletta trattati con lectine FITC-coniugate e con propidium iodate


Le lectine sono delle proteine (spesso glicoproteine) di origine vegetale (per lo pi velenose) che si legano in maniera specifica a particolari zuccheri. Coniugate con fluoresceina e fatte incubare in tampone col campione, evidenziano gli zuccheri a cui si legano.

CONIUGAZIONE

Lectine + Isotiocianato di fluoresceina (o + Biotina) Preventiva incubazione con zucchero inibitore (controllo) Incubazione in tampone a pH specifico a t.a. al buio

Legame con lo zucchero specifico

No legame

Fluorescenza

No fluorescenza

Immunofluorescenza diretta e indiretta


Per mettere in evidenza una proteina (antigene) si effettua la coniugazione tra lanticorpo-anti-proteina e un fluorocromo. Il campione da esaminare si lascia incubare (in tampone a 37C), per un determinato periodo di tempo, con questo complesso; in presenza della proteina che si vuole determinare il complesso fluorocromo-anticorpo si lega alla proteina stessa.
fluorocromo

IMMUNOFLUORESCENZA

Anticorpo antitubulina

Fluoresceina (rodamina etc.)

(Anti-anticorpo antitubulina) Coniugazione Incubazione in tampone a 37C in :

Presenza di proteina specifica Assenza di proteina specifica

Fluorescenza

No fluorescenza

Immunocitochimic a diretta: Neuroni di ganglio cervicale superiore di ratto colorati con anticorpi fluorescenti diretti contro i recettori dellinsulina.

Immunocitochimica indiretta: fasi precoci della mitosi. I microtubuli sono messi in evidenza con anticorpi anti-tubulina coniugati con FITC (isotiocianato di fluoresceina).

Caratterizzazione delle proteine (TUBULINE) del citoscheletro di una cellula epiteliale mediante utilizzo di anticorpi fluorescenti.

MICROSCOPIO CONFOCALE

Microscopio confocale a scansione laser Leica TCSNT


Utilizza una sorgente di luce laser prodotta da una miscela di gas (generalmente Ar/Kr) capace di generare raggi luminosi allinterno dello spettro del visibile (488 nm, 568 nm, 647nm) e di laser UV (361365 nm).

Ar = argon;

Kr = kripton

Utilizzo del microscopio confocale a scansione


Analisi di campioni spessi: il fatto che il campione possieda diversi livelli di fuoco non consente di ottenere unimmagine perfettamente nitida poich i raggi luminosi provenienti da quelle parti dei campioni sopra e sotto il piano focale interferiscono con quelli provenienti dal piano focale.
Piano del fuoco

Le caratteristiche della luce laser (estrema coerenza, alta intensit e lunghezza d'onda unica) consentono di evitare fenomeni di aberrazioni e diffrazioni tipiche invece della luce prodotta da tradizionali lampade a incandescenza aumentando la risoluzione e la profondit di campo. In questo modo le aree superiori ed inferiori al piano di fuoco, non contribuiscono alla formazione dell'immagine, limitando la formazione di aloni e riducendo il rumore di fondo. fondo

La luce laser viene fatta convergere dalle lenti dell'obiettivo in un punto estremamente piccolo del campione osservato e lo analizza ad una data profondit, consentendo la messa a fuoco solo su quel punto. Tale punto, attraverso un sistema di specchi oscillanti (scanner), viene spostato attraverso tutto il campo visivo dell'obiettivo cos da effettuare una scansione completa di tutto il piano focale (sezione ottica).

La luce laser fornisce immagini puntiformi o sequenze di immagini puntiformi che per la nostra retina costituiscono delle Pinhole informazioni non-sense; i segnali luminosi puntiformi provenienti dal piano focale del preparato sono convogliati, ad uno specchio dicroico ove la luce viene scomposta e focalizzata nel piano della minuscola apertura del diaframma (pinhole). Scanner y I segnali luminosi puntiformi provenienti dai piani focali paralleli prossimi, sopra e sottostanti vengono fermati e non contribuiscono alla formazione Piano focale dellimmagine.

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Pinhole

Scanner

Limmagine puntiforme raggiunge il tubo del FOTOMOLTIPLICATORE che: li converte in segnali elettrici, amplifica lintensit del segnale, lo trasmette al calcolatore che lo converte in immagine digitale che viene osservata su monitor.

Piano focale

Microscopio a scansione confocale e sue applicazioni nella microscopia a fluorescenza.

L'intensit della luce laser sufficiente a eccitare i fluorocromi soltanto nel punto di massima concentrazione del raggio luminoso, corrispondente al piano di messa a fuoco dell'obiettivo.

In questo modo le aree superiori ed inferiori al piano di fuoco, non venendo eccitate, non contribuiscono alla formazione dell'immagine, limitando la formazione di aloni e riducendo il rumore di fondo.

Utilizzando unit di scansioni che permettono di esplorare in maniera sequenziale i diversi piani focali del preparato, possibile effettuare, mediante computer, delle ricostruzioni tridimensionali del campione (cellule, tessuti, oggetti vari).

Il tessuto, conservato in congelatore, stato trattato con due diversi fluorocromi: CALCEINA (verde) ed ETIDIO (rosso). Limmagine a sinistra, presenta una singola sezione ottica, isolata grazie al funzionamento del microscopio confocale, mentre la seconda immagine visualizza la sovrapposizione delle sezioni in una ricostruzione digitale della fettina di tessuto.

CELLULE VITALI (in VERDE), APOPTOTICHE (in ARANCIONE) E NECROTICHE (in ROSSO) DI UN TESSUTO POLMONARE.