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Diversidade gentica de isolados monouredinias de Phakopsora pachyrhizi coletados em diferentes regies do Brasil.

Yokoyama, A
1,3*

; Darben, LM ; Lopes-Caitar, VS ; Aoyagi, LN ; De Carvalho, MCCG ; Soares, R. M.; Almeida, AMRA;


1

1,2

1,4

Marcelino-Guimares, FC .
1

Embrapa Soja, Londrina; 2 Dep. de Agronomia, Univ. Est. de Maring ; 3 Univ. Est. do Norte do Paran/ Bolsista CNPq Brasil*; 4Dep. de

Bioqumica e Biotecnologia, Univ. Est. de Londrina.

*E-mail: ale_yokoyama@hotmail.com

Introduo
A soja cultivada uma planta da famlia Fabaceae, gnero Glycine e espcie Glycine max (L.) Merrill. A sojicultura brasileira apresenta nmeros expressivos que traduzem a grande importncia econmica e social que a atividade gera para a economia do pas. Na safra atual (2013/14), espera-se que o Brasil se torne o maior produtor mundial, ultrapassando os Estados Unidos, chegando produo de 81,94 milhes de toneladas. (Conab, 2013) No entanto, fatores biticos e abiticos ainda limitam a produtividade dessa cultura. Atualmente, a principal doena que afeta a produo de soja no Brasil a Ferrugem Asitica da Soja (FAS), causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi Sydow & Sydow. De modo geral, as ferrugens so parasitas obrigatrios (biotrficos), desenvolvendo estratgias eficientes para explorar clulas vivas como fontes de alimento (ZAMBOLIN, 2006). O uso continuo de fungicidas aliado prtica do vazio sanitrio, adotada em todas as regies produtoras de soja no Brasil, tem sido cruciais para o controle da doena nos ltimos anos. No entanto, em condies ambientais favorveis, focos da doena ocorrem rapidamente. Na safra 2012/13 foram detectados pelo menos 461 focos da doena nas principais regies produtoras (Consrcio Nacional Anti-Ferrugem, 2013). Vrios genes de resistncia a FAS foram identificados em introdues de plantas ou cultivares, sendo denominados Rpp1-Rpp6 (Li et al, 2012). De acordo com Freire et al, 2008, mesmo com a disponibilidade de fontes de resistncia, a obteno de variedades comerciais com resistncia durvel ao fungo ainda no foram obtidas, dada a falta de compreenso sobre aspectos fundamentais da biologia do fungo, da interao entre planta-patgeno a nvel intra-especfico, bem como informaes sobre a variabilidade do fungo nas lavouras de soja brasileira e mundial . Embora diferentes trabalhos tenham avaliado a variabilidade gentica de populaes de P. pachyrhizi no Brasil (Freire et al, 2008 e Yamanaka et al, 2010), o estudo da diversidade gentica a nvel de isolados ainda indita. O conhecimento do espectro de virulncia e variabilidade do patgeno fundamental para que programas de melhoramento gentico possam realizar um planejamento estratgico, priorizando a obteno de cultivares que apresentem uma ampla resistncia aos isolados de determinada regio, por exemplo, pela piramidao de genes (Paul e Hartman, 2009). Para estudar a diversidade gentica de muitos organismos, dentre eles os fungos, ferramentas moleculares tem sido amplamente utilizadas. A anlise de sequncias do DNA ribossomal (rDNA) vem sendo utilizada para estabelecer relaes de filogenia molecular dentro de muitos grupos de fungos. Os trs genes do RNA ribossmico fazem parte de um cluster gnico, contendo o gene 18S, o gene 5,8 S e o gene 28S que so separados pelas regies de ITS1 e ITS2, as quais so transcritas e processadas para dar origem ao RNA ribossmico maduro. As regies ITS evoluem rapidamente e, ento, so apropriadas para discriminar espcies relacionadas ou at mesmo variedades de uma mesma espcie (Fungaro, 2000).

Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade gentica de isolados monourediais do fungo Phakopsora pachyrhizi coletados em diferentes regies produtoras de soja no Brasil, por meio da anlise das sequncias da regio do espaador interno transcrito 1 (ITS1).

Material e Mtodos
A anlise molecular foi realizada utilizando 22 isolados de P. pachyrhizi obtidos por meio de cultura monouredinial, com pelo menos 3 ciclos de purificao, a partir de amostras de folhas infectadas com o fungo P. pacrhyhizi coletadas em casa de vegetao e em reas da Embrapa Soja e parceiros em diferentes regies produtoras de soja do Brasil. Cada isolado recebeu um cdigo referente sua origem geogrfica (Quadro 1).
Quadro 1: Relao dos isolados obtidos neste estudo com seus respectivos cdigos e reas de coleta. Nmero 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Lucas do Rio Verde-MT Santo Antnio das Posses-GO Tamarana-PR Uberlndia-MG Ponta Grossa-PR Campo Verde-MT Primavera do Leste-PR Rondonpolis-MT Goinia-GO Conceio das Alagoas-MG Vilhena-RO Localizao Londrina-PR Cdigo do isolado L.LD5511 L.LDEB11 L.LDP211 L.LDP411 L.LD412 L.VL212 L.VL112 L.CA4A12 L.CA7A12 L.RD612 L.GO212 L.GO412 L.CV512 L.PL312 L.PL512 L.PG212 L.PG412 L.UB112 L.UB512 L.LRV312 L.STA212 L.TAM212

Esporos frescos de cada isolado foram utilizados para a extrao do DNA seguindo protocolo descrito por Dellaporta et al. (1983), com modificaes. Aps a extrao, o DNA foi quantificado em espectrofotmetro NanoDrop ND-1000 UVis e sua integridade verificada por meio de eletroforese em gel de agarose 0,8%. Por fim as amostras foram diludas para se obter uma concentrao final de 10g/L por amostra. Reaes em cadeia da DNA polimerase (PCRs) foram realizadas para a caracterizao molecular da regio ITS1 do genoma de P. pachyrhizi a fim de detectar a variabilidade intraespecfica entre os isolados, utilizando iniciadores especficos para essa regio: ITSPP5 (5-GCAACGGCACTTTACTGGCTC-3) e ITS6 (5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3) (Freire et al., 2008). Os fragmentos amplificados foram separados em gel de agarose a 1,2% em tampo TAE 1X. O

marcador de tamanho molecular de 100pb foi utilizado como guia para verificar o tamanho dos fragmentos obtidos. O produto de amplificao via PCR correspondente regio ITS1 foi purificado utilizando o Kit Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega). O DNA purificado foi ligado ao vetor de clonagem pCR2.1-TOPO (Invitrogen) utilizando o TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) e clulas de Escherichia coli DH5 eletrocompetentes foram transformadas por eletroporao. Para anlise dos transformantes, colnias brancas isoladas foram repicadas e analisadas por PCR. Os plasmdeos recombinantes foram extrados das colnias que apresentavam o inserto utilizando-se o Kit Wizard Plus Minipreps DNA Purification Systems (Promega), seguindo as instrues do fabricante. O produto purificado foi quantificado em espectrofotmetro e sua integridade verificada em eletroforese. As amostras foram diludas para uma concentrao final de 200ng/L. Quatro a seis clones de cada isolado foram sequenciados. Os contigs, quatro a seis para cada isolado, foram obtidos com o auxlio do programa Sequencher v.4. As sequencias j editadas foram inseridas no programa BioEdit 7.0.5.3. Esta sequencia foi utilizada para alinhamentos mltiplos realizados pelo programa ClustalX2. O mesmo programa foi utilizado para gerar a rvore filogentica pelo mtodo neighbor-joining. Por fim, a rvore filogentica foi visualizada no programa MEGA 5.05.

Resultados e discusso
O tamanho dos fragmentos sequenciados variou de 196pb para os isolados L.CV512, L.LDP411, L.VL112, L.LD412, L.LDP211, L.PG412, L.PL3.12, L.RD612, L.STA212, L.TAM212 a 199pb para o isolado L.CA4A12. O alinhamento das 22 sequncias revelou uma identidade de aproximadamente 94% entre os isolados, resultando na identificao de 13 hapltipos distintos. Tal resultado exprime uma elevada diversidade gentica presente entre as amostras coletadas no Brasil. A distribuio dos 13 hapltipos entre as 12 localidades analisadas apresentada no Quadro 2.
Quadro 2. Distribuio dos 13 hapltipos gerados pela anlise da regio ITS1 de isolados de P. pachyrhizi Localidades* Hapltipos LD VL CA RD GO CV PL PG UB LRV STA TAM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Total de hapltipos 1 1 1 1 2 1 3 1 7 1

11 12 13 Total de 5 hapltipos 2 2 1 2 1 2 1

1 1 1 1 1 1 1

*LD-Londrina, VL-Vilhena, CA-Conceio das Alagoas, RD-Rondonpolis, GO-Goinia, CVCampo Verde, PL-Primavera do Leste, PG-Ponta Grossa, UB-Uberlndia, LRV-Lucas do Rio Verde, STA- Santo Antonio das Posses, TAM-Tamarana.

Frederick et al. (2002) observaram a mesma variao no comprimento da regio ITS1 quando analisaram 13 isolados de P. pachyrhizi provenientes de diferentes pases, conferindo uma identidade maior que 98% entre as sequncias. Ao comparar os resultados destes autores com o observado no presente trabalho, pode-se considerar que houve uma alta diversidade de isolados encontrados no Brasil, j que as anlises foram realizadas a partir de isolados coletados em uma abrangncia menor, apenas um pas. A rvore filogentica baseada nas sequncias da regio ITS1 revelou a separao dos isolados em dois grupos principais e um isolado que no se agrupou a nenhum outro utilizado nesta anlise (Figura 1). No houve variao gentica entre os isolados L.LRV312 e L.PG212. Por outro lado, o isolado L.LDP211 no se agrupou a nenhum outro isolado, mostrando-se como o mais distante filogeneticamente entre todos os isolados analisados.

Figura 1: rvore filogentica construda partir das sequncias da regio ITS1 dos isolados de P. pachyrhizi.

A alta variabilidade observada entre os isolados pode ser explicada pela co-evoluo entre patgeno e hospedeiro como consequncia do uso de diferentes cultivares nas regies produtoras de soja, bem como pela forte presso seletiva exercida pelo elevado uso de fungicidas alm da elevada capacidade de disperso dos esporos. A ocorrncia de eventos de mutao, introduo de isolados geneticamente distintos e as prticas culturais tambm podem ter grandes influncias na diversidade gentica do patgeno. Outro mecanismo que poderia contribuir para a elevada variabilidade gentica observada em populaes de P. pachyrhizi a ocorrncia de anastomose seguida do ciclo parassexual, mecanismo j descrito na espcie (Vittal, 2011).

Concluso
Os resultados obtidos neste estudo indicam que a anlise da regio ITS1 foi eficiente na identificao de variao intraespecfica entre isolados de P. pachyrhizi revelando a existncia de 13 hapltipos diferentes dentre os 22 isolados analisados. O conhecimento sobre a variabilidade e estrutura gentica das populaes de P. pachyrhizi de extrema importncia, pois permite traar estratgias eficientes de controle com base na interao molecular entre patgeno e hospedeiro, no desenvolvimento de gentipos que apresentem ampla resistncia ao fungo P. pachyrhizi.

Bibliografia
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