UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

CATEDRA DE HEMATOLOGIA

INMUNOBIOLOGIA DE LOS TRASPLANTES

Dr. Walter Diaz Silva

MENDOZA CASTILLO FABRIZIO MENDOZA HERNANDEX ALEX MESTANZA MORON RICARDO MORENO VASQUEZ LUIGUI OCAA PAREDES CRISTHIAN PALACIOS APAESTEGUI ALBERTO PEDEMONTE MURILLO ELKY PEREZ PEREZ SANDRA

INDICE
1. OBJETIVOS 2. INTRODUCCION 3. OBSTACULOS DEL TRASPLANTE

4. ANTIGENOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD MAYOR 5. FASES DEL TRASPLANTE

5.1 ACONDICIONAMIENTO 5.2 PRENDIMIENTO: FASE INICIAL Y SEGUNDA FASE

6. COMPLICACIONES DEL TRASPLANTE

6.1 TOXICIDAD DEBIDO AL ACONDICIONAMIENTO 6.2 ENFERMEDAD VENOOCLUSIVA HEPTICA 6.3 ENFERMEDADES INFECCIOSAS 6.4 ENFERMEDAD INJERTO CONTRA HUSPED: AGUDA Y CRNICA 6.5 ENFERMEDAD INJERTO CONTRA LEUCEMIA

INMUNOBIOLOGIA DE LOS TRASPLANTES

1) OBJETIVOS: Comprender mejor los procesos inmunitarios. Conocer el papel de los antgenos MHC Conocer el papel de los linfocitos T en el rechazo Conocer las linfocinas mas importantes en las reacciones de rechazo Describir las tcnicas utilizadas en el tipaje HLA. Analizar el fundamento de las tcnicas de tipaje HLA.

2) GENERALIDADES: El rechazo de los injertos trasplantados se produce debido a que el sistema inmunitario del receptor reconoce los antgenos de histocompatibilidad ajenos que expresa el injerto y responde contra ellos. Los antgenos de histocompatibilidad ms importantes son los codificados por el MHC. Los linfocitos T reconoces directamente las molculas MHC ajenas y responden contra ellas. Las clulas T cooperadoras activadas sintetizan linfocinas que dan lugar a la activacin de muchos mecanismos efectores encaminados a destruir el injerto. Las linfocinas tambin promueven la expresin de molculas MHC y de adherencia sobre el propio injerto que aumenta la susceptibilidad del rechazo. Las respuestas de rechazo del injerto se pueden reducir al mnimo, llevando al cabo trasplantes entre donantes y receptores, cuyas molculas del MHC se parezcan lo ms posible entre s, especialmente en los de clase II. La inmunosupresin especfica se utilizara en el futuro para inactivar solo los clones de linfocitos que provocan el rechazo. INTRODUCCION A LA INMUNOLOGIA DEL TRASPLANTE El trasplante es un proceso por el que se toman clulas, tejidos u rganos, denominados injertos de un individuo y se colocan en otro, habitualmente distinta. El individuo que proporciona el injerto se denomina donante y el que lo recibe, receptor o husped. Cuando el injerto se coloca en su posicin anatmica normal, el

procedimiento recibe el nombre de trasplante ortotpico; si se sita en un lugar distinto, la intervencin se denomina trasplante heterotpico. La trasfusin en el trasplante de clulas sanguneas circulantes o de plasma de una persona a otra. En la prctica clnica, el trasplante se utiliza para corregir una deficiencia anatmica o funcional del receptor. Este tipo de tratamiento de las enfermedades humanas han experimentado un crecimiento sostenido durante los ltimos cuarenta aos y, en la actualidad, los trasplantes de rin, corazn, pulmn, hgado, pncreas y MO son procedimientos ampliamente utilizados. Una limitacin importante para el xito de los trasplantes es la respuesta inmunitaria del receptor frente al tejido del donante, al cual se le denomina rechazo. Los injertos pueden fracasar por diversas anomalas distintas al rechazo. En la prctica clnica, es importante distinguir entre el rechazo, un fenmeno de naturaleza inmunitaria, y las dems causas del fracaso de los injertos. Esta exposicin se centrara en las bases inmunitarias del rechazo. Los inmunlogos dedicados a los trasplantes han desarrollado un vocabulario especial para referirse a los tipos de clulas y tejidos relacionados con los trasplantes. Un injerto trasplantado de una a otra parte del cuerpo de un mismo individuo recibe el nombre de AUTOINJERTO (tambin denominado injerto autlogo). Un injerto trasplantado entre dos individuos genticamente idnticos es un ISOINJERTO (injerto isognico). Un injerto trasplantado entre dos individuos de la misma especie, pero genticamente distintos, es un ALOINJERTO (injerto alognico). Un injerto trasplantado entre individuos de especies distintas recibe el nombre de XENOINJERTO (injerto xenognico). Las molculas reconocidas como extraas sobre los aloinjertos se denominan aloantigenos, mientras que las de los xenoinjertos son antgenos extraos. Los linfocitos y anticuerpos que reaccionan contra los aloantigenos o antgenos extraos se describen como alorreactivos o xenorreactivos, respectivamente.

3) OBSTACULOS DEL TRANSPLANTE

Se deben principalmente a la disparidad gentica entre donante y receptor. De la misma manera, existen otros inconvenientes a tener en cuenta: Como en cualquier otro tipo de operacin, podemos encontrar grandes probabilidades de infeccin. La ciruga y su monitorizacin pueden ser costosas Existen problemas con el abastecimiento.

Tipos de trasplantes
Hay diferentes tipos de trasplantes segn la relacin gentica entre el donador y el receptor Autotrasplantes o auto injertos aquellos en los que el donador y el receptor son la misma persona, es decir que se utiliza tejido de un lado del cuerpo, para colocarlo en otro Entre estos tejidos estn la piel, msculos, huesos, sangre o mdula espinal. Isotrasplantes se realizan entre gemelos, es decir, cuando el donador y el receptor son genticamente idnticos y se pueden realizar con todos los rganos y tejidos trasplantables Homotrasplantes o alotrasplantes Son cuando el donador pertenece al mismo sexo y/o raza, pero que genticamente son diferentes. Heterotrasplantes o xenotrasplantes Son los que se realizan entre personas genticamente diferentes, de ambos sexos, de cualquier raza o en los que se utilizan rganos artificiales.

4) ANTIGENOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD MAYOR El inters y la curiosidad respecto a este tema surgieron al observarse el rechazo a tejidos transplantados en ratones de laboratorio. En la dcada de 1940 George Snell y colaboradores realizaron estudios para analizar el rechazo a implantes entre ratones de distintas cepas y ratones de la misma cepa. Para realizar esto, primero deban crear cepas endogmicas, es decir, que posean la misma secuencia de cidos nucleicos en todos los alelos del genoma, esto lo obtuvieron entrecruzando hermanos, y luego de veinte generaciones finalmente fue posible establecer cepas genticamente idnticas. Cuando se transplanta un tejido o un rgano, pueden ocurrir dos cosas, que el sistema inmunitario reaccione en contra de este y lleve al rechazo, o que sea aceptado. En el experimento de Snell, cuando se realizaron injertos de piel entre las cepas endogmicas, el rgano fue aceptado. Mientras que en los injertos a las cepas distintas fueron rechazados. Este estudio nos lleva a la conclusin, que el reconocimiento de un tejido como propio o extrao es un carcter hereditario. Adems que los genes encargados de esto varan de un individuo a otro. Esta idea sera atribuible al polimorfismo de los genes encargados del reconocimiento tisular. Cuando hablamos de polimorfismo, hacemos referencia al hecho que si bien, todos los ratones poseen los genes del reconocimiento de lo propio de lo extrao, existen variaciones entre cada cepa, es decir formas alternativas de expresarse, o variantes de una frecuencia estable dentro de una poblacin. A este grupo de genes polimorficos, que determina la

compatibilidad de tejidos entre individuos, se los denomino genes de histocompatibilidad. En estudios posteriores se trato de ubicar que gen era el encargado del rechazo a injertos, y se descubri que no era solo uno, al contrario era un grupo de genes. A este sector del genoma, que contiene los genes del reconocimiento de tejido se los denomino Complejo mayor de histocompatibilidad (MHC major histocompatibility complex ). Durante mas de 20 aos, el nico rol que se la asignaba al MHC era el de rechazo a injertos, esto era un problema para el entender de los inmunlogos, debido a que el transplante de tejidos no es un fenmeno natural, entonces, para que el genoma se reservara grandes segmentos gnicos? Durante las decadas de 1960 y 1970 se descubri la gran importancia de los genes del MHC en las respuesta inmunitaria frente a antgenos proteicos, los genes encargados de estas respuestas se ubican en el MHC. De hecho, el MHC codifica diferentes molculas que difieren en su capacidad para interactuar con los pptidos extraos. En cuanto a los seres humanos, el descubrimiento del MHC humano, llamado HLA ( Human leukocyte antigen ), se llevo acabo a travs de estudios de transfusiones sanguneas y transplantes de rganos, ya que no se puede realizar en las personas los experimentos llevado a cabo con los ratones. Jean Dausset, Jan Van Rood y colaboradores demostraron que los pacientes que rechazan los transplantes de rin presentan elevadas concentraciones de anticuerpos en el suero dirigidos hacia los leucocitos del donante. A este suero que reacciona en contra de clulas de individuos alogenticos (expresin de alelos diferentes) se lo conoce como aloantisuero, y se dice que contiene aloanticuerpos que estn dirigidos contra los aloantgenos. Se supuso que, al igual que en los ratones estos eran genes polimorficos que variaban de un individuo a otro. As se estudiaron a familias completas en busca de armar el mapa del locus del HLA. Los primeros genes que se descubrieron, por tcnicas exclusivamente serologcas, fueron HLA-A, HLA-B y HLA-C. Luego a travs de tcnicas de Reaccin leucocitaria mixta (MLR) se vio que, los leucocitos del receptor reaccionaban frente a los leucocitos del donante. El primer gen que se identifico con esta tcnica se encontraba adyacente al locus del HLA, por lo que se denomino HLA-D, luego se identifico a la molcula de este gen y se la bautizo HLA-DR ( HLA-D related ). Finalmente se descubrieron dos genes ms y se los llamaron HLA-DQ y HLA-DP. La nomenclatura internacional aceptada del MHC y de las protenas que codifican se basa en la homologa de la secuencia y la estructura, siendo aplicable a todos los vertebrados. As los genes identificados en el rechazo a injertos en los ratones y los identificados serologicamente en humanos (HLA-A, HLA-B, HLA-C) se los agrupa bajo el nombre de genes de clase I del MHC , en tanto los genes de la respuesta inmunitaria de los ratones y los genes humanos detectados por MLR (HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR) se conocen como genes de clase II del MHC. Todos estos genes, se encuentran ubicados en el brazo corto del cromosoma 6 y se expresan de modo codominante. De esta manera amplia aun mas la diversidad. Actualmente se sabe que existen diferencias individuales respecto a los alelos del HLA y que son determinantes importantes de la reaccin frente a tejidos extraos, as como en la activacin linfocitaria.

Organizacin de los genes del MHC En los seres humanos los genes del MHC se ubican en el brazo corto del cromosoma 6 y ocupan un segmento del ADN bastante extenso, alternando entre genes, segmentos de ADN no codificante .

Los genes de clase I del MHC, estn ubicados en la posicin ms telomerica del HLA. Mientras que los genes de clase II son ms centromericos. Entre los grupos de genes de clase I y II se encuentran otro grupo que codifican ciertas protenas del complemento y tres citoquinas estructuralmente relacionadas (TNF, LT y LT), a este grupo se los denomino genes de clase III del MHC. Los genes clase I del MHC, HLA-A, HLA-B y HLA-C sintetizan las molculas de clase I del MCH, (verse mas adelante la estructura completa de la molcula de clase I del MHC) encargadas de presentar a los antgenos peptdicos a los Linfocitos T CD8+. Dentro de la regin I tambin encontramos otros genes de polimorfismo muy bajo o nulo conocidos como class I-like genes (HLA-F, HLA-G, HLA-H, HLA-E, HLA-J y HLA-X). La funcin de estos class I-like genes no es conocido pero se cree que sirven como repertorio de secuencias de codificacin, que pueden ser utilizadas para generar nuevas secuencias polimorficas en las molculas de clase I y II por un proceso conocido como conversin gnica . En este proceso una porcin del ADN de un gen es reemplazado por una secuencia de otro de una manera no reciproca. De hecho el gran polimorfismo de los genes del MHC es debido a conversiones gnicas y no a mutaciones .

En cuanto al locus del MHC II, se encuentran los genes HLA-DP, HLA-DQ y HLA-DR, que sintetizan las molculas de clase II del MHC cuya funcin consiste en presentar a los antgenos peptdicos a los Linfocitos T CD4+. Dentro del locus de la clase II se encuentran tambin genes que codifican varias protenas encargadas del procesamiento del antgeno. Una de ellas es el heterodimero TAP (transportador asociado con el procesamiento del antgeno), encargado de transportar los pptidos desde el citosol al interior del retculo endoplasmico (estas funciones se vern mas adelante). Otros genes codifican subunidades del proteasoma. Y adems de estos, ubicamos aqu en el locus del MHC II a un par de genes que codifican la protena HLADM que esta involucrada en la unin del pptido a la molcula de clase II (ver mas adelante).

EXPRESIN DE LAS MOLCULAS DEL MHC Las molculas de clase I del MHC se expresan constitutivamente en todas las clulas nucleadas. Este patrn de expresin esta ntimamente relacionado con las funciones de los linfocitos T CD8+, quienes al reconocer a los pptidos presentados por las molculas de clase I se activan y lisan a la clula que se encuentre infectada por un microorganismo endgeno (en este caso cuando decimos endgeno hacemos referencia a intracelular). Este es un mecanismo de defensa muy efectivo para las clulas nucleadas infectadas, ya que no pueden migrar como lo hacen las APC profesionales (verse mas adelante), por lo tanto la nica manera de hacer saber al sistema inmunolgico que se encuentran afectadas es esta. Las molculas de clase II del MHC solo se expresan a un grupo celular denominado clulas presentadoras de antgeno (APC antigen presenting cells ). En este repertorio celular se encuentran los Linfocitos B, Macrfagos y principalmente las clulas Dendrticas (fig 5). Estas clulas son capaces de reconocer, fagocitar, procesar y luego presentar en su superficie celular a los pptidos exgenos unidos a las molculas de clase II (este mecanismo se explica mas adelante). Las APC poseen adems la capacidad de poder migrar de un tejido a otro en busca de los Linfocitos T CD4+, este es el caso de las clulas dendrticas, que pueden migrar desde la piel hasta los ganglios linfticos y as poder activar a los CD4+. Otra forma de establecer el contacto entre las APC y los T CD4+, es que estos ltimos migren al sitio afectado en donde los Macrfagos presentan el pptido y activan a las CD4+. El fin ultimo de las molculas de clase II es poder presentar antgenos exgenos, mientras que las molculas de clase I presentan a los antgenos endgenos. La expresin de las molculas tanto de clase I como de clase II, se ven afectadas por las citoquinas secretadas tanto en la inmunidad innata como en la inmunidad adaptativa. Los INF, , y son secretados en la respuesta inmunitaria temprana frente a los virus, en tanto el TNF (factor de necrosis tumoral) y las LT (Linfotoxinas) se liberan en las infecciones microbianas. Todas estas citoquinas aumentan significativamente la expresin de las molculas de clase I. Este es un mecanismo en que la inmunidad innata estimula a la inmunidad adaptativa. Las molculas de clase II son reguladas principalmente por el INF, esta citoquina es la mas importante activadora de macrfagos, y estos una ves activados aumentan la expresin de molculas del MHC.

Los Linfocitos B expresan constitutivamente MHC II, pero pueden aumentar la expresin bajo el estimulo de IL-4. Mientras que las clulas dendrticas aumentan la expresin a medida que maduran. El hecho que las APC expresen mayor o menor cantidad de molculas se relaciona con la tasa de transcripcin del MHC. Este efecto esta mediado por la unin de factores de transcripcin, activados por citoquinas, a las secuencias promotoras de los genes del MHC. Varios factores de transcripcin se ensamblan y luego se unen a una protena denominada Activador de transcripcin de clase II (CIITA class II transcriptor activator ), este complejo se une al promotor y as modula la transcripcin. El CIITA es sintetizado en presencia de INF, de esta manera explicamos el fundamental rol del INF en la expresin del MHC II. El INF regula adems de la expresin de las molculas de clase II, a las molculas de clase I, a la 2 -microglobulina, a los genes que regulan la expresin de las protenas TAP y los genes que codifican las subunidades del proteasoma.

5) MHC Y LINFOCITOS T Las clulas T son esenciales en el rechazo de injertos.. Los LT son los principales responsables del rechazo de los injertos slidos y pueden llegar a hacerlos sin ayuda de los LB. Esto no significa que que no intervengan otros factores como los Ac, que provocan lesiones en los injertos y tambin es posible que los macrfagos intervengan en las reacciones inflamatorias que se producen en los tejidos del donante. Los Ac pueden acelerar el proceso de rechazo, sobre todo si el receptor est sensibilizado. Hay infiltracin de linfocitos y macrfagos que destruyen el tejido en una respuesta parecida a la DTH. Los receptores de los linfocitos T (TCR) reconocen a antgenos expresado en el tejido injertado asociados a antgenos HLA (o CPH) expresados en este tejido tambin.

Las clulas T colaboradoras tambin intervienen en el rechazo, en concreto en el rechazo agudo. Las clulas Th son activadas por CPA (clulas presentadoras de antgeno) procendentes de la mducla sea del receptor y expresan molculas CPH o HLA de clase II.

6) FORMAS DE PRESENTACION DE MHC A LINFOCITOS T: DIRECTA E INDIRECTA La presentacin de las molculas de MHC a los linfocitos T del receptor del injerto para que estos puedan reconocerlas tiene lugar por dos vas distintas: Presentacin directa: Implica el reconocimiento de una molcula del MHC intacta ofrecida por las clulas presentadoras de antgenos (CPA) del donante existentes en el injerto, y se debe a la similitud entre la estructura de la molcula del MHC extraa (alomolecula) intacta y las molculas del MHC propias. Por tanto, la presentacin directa es exclusiva de las molculas MHC extrao. Presentacin Indirecta: Supone el procesamiento de las molculas MHC del donante por parte de las CPA del receptor y la presentacin de los pptidos derivados de las alomoleculas del MHC asociadas a molculas del MCH propio. En este caso, la molcula del CPH ajeno recibe el mismo tratamiento que cualquier antgeno protenico extrao y los mecanismos de la presentacin indirecta del antgeno son idnticos a los de cualquier antgeno protenico microbiano. Los antgenos de un injerto distintos a las molculas del CPH tambin pueden ser presentados a los linfocitos T del husped a travs de la va indirecta.

7) ACTIVACION DE LOS LINFOCITOS T ALOREACTIVOS Y RECHAZO DE ALOINJERTOS ACTIVACION DE LINFOCITOS T ALORREACTIVOS El trasplante de un rgano implica que el sistema inmunitario del receptor se enfrentar a clulas que expresan en muchos casos molculas de histocompatibilidad distintas (molculas alognicas) y por tanto susceptibles de ser reconocidas como extraas. A este fenmeno se le denomina alorreconocimiento y consiste en el proceso por el cual los linfocitos T del receptor de un trasplante reconocen las molculas de histocompatibilidad del rgano trasplantado. Las principales clulas implicadas en este reconocimiento son los linfocitos TCD4 y TCD8 que reconocen a los aloantgenos del injerto trasplantado y que, una vez debidamente presentados por clulas dendrticas, se activan y proliferan. Estas clulas actan reconociendo a las molculas de histocompatibilidad mediante su TCR, pero en otros casos todava no muy bien estudiados, en trasplante, estas clulas reconocen las molculas de histocompatibilidad mediante receptores inhibidores conocidos como receptores KIR. El reconocimiento alognico se produce principalmente en los ganglios linfticos del receptor por la migracin de clulas dendrticas del donante. En general se piensa que este reconocimiento se puede realizar por dos vas distintas: Alorreconocimiento directo Alorreconocimiento indirecto

La va directa implica el reconocimiento de las molculas HLA intactas presentadas por las clulas presentadoras de antgenos del donante (APC) existentes en el injerto y la va indirecta supone el procesamiento de las molculas HLA del donante por parte de las APC del receptor y la presentacin de los pptidos derivados de las molculas HLA asociadas a molculas HLA propias. Alorreconocimiento directo En condiciones normales, las molculas HLA que se expresan en las superficies celulares se encuentran unidas a pptidos. Los pptidos unidos a las molculas HLA pueden desempear varias funciones importantes en dicho reconocimiento. Es posible que los pptidos nicamente sean necesarios para estabilizar la expresin de las molculas HLA en la superficie de la clula. Se ha demostrado, sin embargo, que algunos clones de linfocitos T alorreactivos reconocen a las molculas HLA unidas a algunos pptidos concretos, pero no a otros. Estos linfocitos T (hasta un 2%), que son capaces de reconocer directamente y responder a una molcula aislada de un HLA extrao,

son los causantes de que los aloinjertos desencadenen respuestas inmunitarias intensas. El HLA alognico presente en las clulas dendrticas del donante, es una de las vas de estimulacin del sistema inmune. Debido a su funcin de molculas presentadoras de pptidos extraos, dichas clulas del donante median la activacin de las clulas efectoras que previamente han infiltrado el rgano del donante. Las molculas HLA extraas pueden ser reconocidas directamente sobre las APC del donante, mediante el llamado alorreconocimiento directo, que no precisa procesamiento del antgeno. En estas circunstancias podra decirse que el TCR confunde a la molcula HLA extraa con una molcula propia, presentando un pptido extrao. La extravasacin de las clulas dendrticas del rgano trasplantado al torrente circulatorio del receptor y, consecuentemente, a otros rganos linfticos, es la segunda va de activacin de las clulas efectoras. As se ha demostrado la presencia de clulas dendrticas provenientes del donante en el bazo y en los ndulos linfticos de ratones sometidos a trasplantes cardacos ectpicos. Alorreconocimiento indirecto La estructura de las molculas HLA del donante es distinta de la del husped, por lo que pueden procesarse y presentarse al igual que cualquier otro antgeno proteico ajeno por las APC del receptor. Las clulas dendrticas fraccionan en pptidos igual que a otros antgenos bacterianos y los presentan como pptidos extraos en el seno del HLA del donante. Como consecuencia, se produce un alorreconocimiento por parte de los linfocitos T CD4+, ya que las APC del receptor adquieren el aloantgeno principalmente por medio de vesculas endosmicas, por lo que es presentado por las MHC de clase II. Tambin, hay antgenos de las clulas del injerto fagocitadas, que se introducen en la va de presentacin de antgenos clase I, y por tanto, son objeto de un reconocimiento indirecto por linfocitos T CD8+. RECHAZO DE ALOINJERTOS El trasplante de un rgano a un receptor proporciona APC que expresan molculas HLA del donante. Las clulas dendrticas migran a los ganglios linfticos regionales, donde son reconocidas por los linfocitos T del receptor que circulan por los ganglios linfticos perifricos (alorreconocimiento directo). Las clulas dendrticas del receptor pueden migrar tambin al injerto o los aloantgenos del injerto pueden viajar a los ganglios

linfticos para ser capturados y presentados por las APC del receptor (alorreconocimiento indirecto). Para que se produzca el fenmeno de rechazo, es necesario en un primer momento que el sistema inmune propio reconozca las molculas HLA extraas por alguna de los dos vas anteriores. Pero en un segundo paso es necesario que se produzca el ataque al rgano trasplantado por las clulas que se han estimulado. A continuacin trataremos cmo las clulas efectoras llegan al rgano trasplantado y se produce la destruccin de este. Como hemos comentado, la respuesta al rechazo es iniciada esencialmente por las clulas dendrticas del rgano trasplantado bien in situ o tras su paso al torrente sanguneo, llegando a los ganglios linfticos del receptor. Los linfocitos Th (que secretan mayoritariamente IL-2 e IFN, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) se activan, as como los linfocitos B (que producen Ig) y los linfocitos Tc (CTL). Estos diferentes tipos celulares pueden migrar hacia el rgano trasplantado y producir lesiones en el mismo que generalmente comienzan por las clulas endoteliales, que seran las inicialmente expresadas. Tanto las clulas dendrticas como endoteliales vasculares de los injertos alognicos, a su vez, tambin inducen proliferacin de las clulas T del individuo receptor. La clula proliferativa principal es la clula T CD4, que reconoce a los aloantgenos de clase II, de forma directa en las clulas del donante o los pptidos aloantignicos que exhiben las clulas presentadoras de antgenos propios. Esta poblacin amplificada de clulas Th parece desempear una funcin central en la induccin de los diversos mecanismos efectores del rechazo de los aloinjertos. Migracin e infiltracin celular La infiltracin linfocitaria en el rgano trasplantado es el marco en el que se produce el rechazo celular. Para que este proceso de infiltracin se pueda realizar, es necesario sintetizar en diferentes pasos. Hasta que se produce la migracin de las clulas del sistema inmune hacia el rgano trasplantado, hay adhesin de estas al endotelio vascular, y posteriormente, migran a travs de la pared vascular y se adentran en el parnquima del rgano trasplantado. Una vez las clulas en el foco de la inflamacin, se produce retencin selectiva y proliferacin local de las mismas. Inicialmente, este proceso est mediado por las mltiples molculas de adhesin celular (CAM), que actan cmo receptores en los linfocitos de molculas existentes en las paredes vasculares y en los tejidos. Algunas de estas molculas involucradas en los procesos de adhesin clulaclula o matriz-clula pueden estar constitutivamente expresadas o ser

inducidas por linfocinas que participan en los fenmenos de inflamacin, como son la IL-1, TNF- y IFN-. Algunas de estas molculas que no se expresan en condiciones normales, s lo hacen durante el rechazo. As, en el rechazo agudo de trasplante heptico se ha observado la aparicin de ICAM-1 y LFA-3 en hepatocitos y clulas epiteliales del conducto biliar. Una vez adheridos los linfocitos al endotelio deben atravesarlo y migrar al interior del parnquima, para lo cual se requieren estmulos quimiotcticos. Una vez que las clulasya estn instaladas en el rgano trasplantado, se producen mecanismos de activacin y expansin clonal que favorecen el dao de dicho rgano, proceso que describiremos a continuacin. Fenmeno ltico La respuesta inmune contra el aloinjerto incluye, no slo la respuesta celular (tanto la especfica como la inespecfica) sino tambin la humoral, siendo ambas las responsables de la lisis de las clulas del trasplante, aunque por diferentes vas. De todas maneras, el mecanismo por el cual se produce el dao celular en el rgano infiltrado, no est todava completamente aclarado. Uno de los mecanismos conocidos, y a su vez de los de mayor importancia, es la lisis celular mediada por los linfocitos citotxicos CD8+, aunque tambin podran participar clulas CD4+ con capacidad citotxica. El predominio de los linfocitos CD4+ en el infiltrado se ha asociado a mayor grado de reversibilidad del rechazo, mientras que el predominio de los CD8 est ms relacionado con rechazos severos y crnicos. Otro mecanismo responsable de la destruccin del rgano, viene mediado por las clulas responsables de la respuesta inmune inespecfica. As, se produce una necrosis celular que se presentara como consecuencia de una inflamacin local, observndose en el infiltrado macrfagos, neutrfilos y clulas NK, pudiendo stas participar de forma directa o indirecta travs de los factores solubles (ILs, TNF, Acs, etc...) que se producen. Los anticuerpos pueden mediar el rechazo por diferentes mecanismos. As, anticuerpos pueden reconocer y unirse a antgenos HLA y activar el sistema del complemento, causando lisis celular. La extensin del dao producido depende de varios factores, como la concentracin de anticuerpos, clases y subclases de anticuerpos, densidad antignica y localizacin de estos antgenos.

Otra posibilidad, es la participacin de los mecanismos de citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC), en los que actuaran como clulas efectoras las clulas NK y macrfagos, participando en los procesos de rechazo agudo. La presencia de clulas B en los infiltrados puede producir anticuerpos anticlulas epiteliales y endoteliales y subsecuentemente favorecer la accin de clulas NK y macrfagos, gracias a sus receptores para la porcin Fc de las inmunoglobulinas. Para que acten los anticuerpos se necesita que el antgeno sea accesible a stos. Las clulas ms accesibles son las del endotelio vascular. Efectivamente, en los endotelios de capilares, venas y arterias se pueden encontrar antgenos de histocompatibilidad clase I. Tambin todas las clulas endoteliales pueden expresar antgenos de histocompatibilidad clase II, bien en reposo, bien al ser estimuladas por linfocitos incompatibles, -interfern o isquemia. Los antgenos localizados en el epitelio tubular del rgano trasplantado sin embargo, no son accesibles, por lo que no participaran en esta respuesta. Adems de anticuerpos participan muy activamente otros factores solubles, tales como las linfocinas IL-1, TNF- en el foco de infiltracin, producidas fundamentalmente por los macrfagos (aunque tambin por las clulas T) favoreceran los fenmenos de inflamacin local. La IL-1 actuara tanto sobre clulas del receptor como sobre clulas T del infiltrado, favoreciendo la activacin de ambas. En este sentido se ha publicado que el tratamiento con el receptor soluble para IL-1 previene el rechazo del trasplante ectpico cardaco en ratones. Por lo tanto, son los propios vasos, ms que las clulas parenquimatosas, la diana del ataque inmune. As, lesiones vasculares asociados con rechazo han sido atribuidos a la inmunidad mediada por clulas incluyendo clulas T, macrfagos y monocitos. Es de vital importancia conocer en su totalidad el mecanismo responsable del dao del rgano trasplantado, ya que conocido ste ser ms fcil encontrar la adecuada inmunosupresin para prevenir el dao a las paredes de los vasos. Este dao preferencial de los vasos es debido por tanto a su accesibilidad y a la mayor expresividad de molculas HLA (clase I y II) lo que los convierte en la diana preferente. El proceso de destruccin es altamente selectivo. As mientras el rechazo va dirigido a clulas alognicas del donante, clulas singnicas del receptor situadas en la proximidad no son daadas.

8) PAPEL DE LAS CITOQUINAS EN EL RECHAZO Las citoquina, liberadas por distintos tipos celulares (linfocitos, monocitos/ macrfagos, clulas epiteliales, etc.) y que actan como reguladores de la actividad funcional de otras clulas. Las citoquinas que tienen un papel ms importante en el rechazo son IL-2 y INF-3. Otras son las IL-4,-5 y -6, que activan los linfocitos B que da lugar a la produccin de Anticuerpos, estos a su vez, activan el complemento y producen lesiones en el endotelio vascular. Los LT CD4+ son activados por las CPA derivadas de mdula sea del donante o del Rc: Las CPA del donante llegan al injerto como leucocitos pasajeros (clulas dendrticas intersticiales) y provocan una activacin directa de los LT CD4+ y CD8+ del Rc. Las CPA del Rc alcanzan localizadas en los tejidos linfoides de drenaje y presentan el Ag desprendido del injerto a los LT CD4+, constituyendo una activacin indirecta.

La activacin directa es un estimulo ms potente para el rechazo que la va indirecta, ya que el Rc se sensibiliza al MHC del donante. Las clulas pasajeras pueden ejercer una notable influencia sobre la supervivencia de los injertos. Los LT CD4+ producen citocinas requeridas como factores de crecimiento y diferenciacin de otras clulas que intervienen en el rechazo: a. IL-2: activan a los LT citotxicos. b. IFN-gamma: El IFN-gamma y el TNF-beta activan a los macrfagos. Esta mezcla tambin regula positivamente las molculas de adhesin sobre el endotelio vascular. El IFN-gamma induce la expresin de MHC-I y II en las clulas que normalmente no lo expresan, aumentando el estmulo de la respuesta de rechazo y proporcionando un gran nmero de molculas dianas.

9) TIPAJE HLA. Se denomina tipaje HLA, al anlisis llevado a cabo en el laboratorio para conocer los alelos HLA de un determinado individuo mediante mtodos serolgicos, anlisis de genes por biologa molecular y mtodos celulares. El tipaje HLA tiene especial inters en las siguientes situaciones: Estudio de la asociacin con distintas formas clnicas de una enfermedad. Por ejemplo la diabetes insulino-dependiente est asociada a DR3 y DR4 y En trasplantes de rganos y medula sea y Estudios de filiacin familiar.

La mayora de los genes del HLA son altamente polimrficos, y cada especificidad definida en la superficie celular representara un alelo diferente a nivel genmico. As se han descrito numerosos alelos para los diferentes loci HLA: Mtodo Serolgico. Se utiliza: Suspensin de linfocitos viables, obtenidos a partir de sangre perifrica Separacin de LnT y LnB por perlas inmunomagneticas Complemento de conejo Placas Terasaky con sueros caracterizados Placas Terasaky con anticuerpos monoclonales

Fundamento: poner en contacto linfocitos aislados del sujeto a estudiar con un panel de aloanticuerpos o anticuerpos monoclonales anti HLA, capaces de reconocer determinadas especificidades antignicas. El mtodo serolgico ms comnmente utilizado es el test de microlinfocitotoxicidad, que se realiza enfrentando una poblacin de linfocitos a una batera de sueros o anticuerpos monoclonales que son especficos para cada uno de los antgenos posibles. Posteriormente se aade complemento de tal manera que en los pocillos en los que se encuentre el antisuero especfico para los antgenos de un individuo

determinado, se producir la lisis celular que podr ser visualizada al microscopio. Para visualizar la lisis, actualmente se usan una tcnica fluorescente con una mezcla de anaranjado de acridina y bromuro de etidio. El bromuro de etidio se fija al ADN de las clulas muertas (que aparecen de color rojo) y desplaza al anaranjado de acridina que tie a las clulas vivas de color verde brillante. Los cultivos se incuban y se hacen las lecturas de viabilidad celular.

Para llevar a cabo la tipificacin de los antgenos de clase II se utilizan poblaciones purificadas de linfocitos B, ya que en estas clulas los antgenos de clase II se expresan ms abundantemente que en los linfocitos T (de hecho, las clulas T expresan cantidades significativas de molculas MHC de clase II slo cuando estn activadas). Los linfocitos B se separan haciendo pasar suspensiones de linfocitos totales a travs de una columna empaquetada con fibra de nylon. Por sus propiedades adherentes, las clulas B se retienen en el nylon y posteriormente se despegan por manipulacin mecnica de la columna de la que previamente se han eliminado, por lavado, las clulas no adherentes. Existe a su vez, otro mtodo ms utilizado y menos perjudicial para la separacin de las clulas B que consiste en el uso de microesferas magnticas

acopladas a anticuerpos contra antgenos especficos de estas clulas (el antgeno CD19, por ejemplo). La sangre se mezcla con las esferas y luego stas se separan en un campo magntico (con un imn) y se lavan para proceder a su tipificacin por serologa. Mtodos de Biologa Molecular: Las tcnicas de biologa molecular ms usadas (no las nicas) para detectar polimorfismos en el ADN utilizan los mtodos de: a. Secuenciacin directa del ADN. b. Anlisis del tamao de los fragmentos de restriccin del ADN (RFLP restriction fragment lenght polymorphism). c. Reaccin en cadena de la ADN polimerasa (PCR, polymerase chain reaction). La secuenciacin directa del ADN no es prctica para su uso rutinario. Actualmente son utilizadas tcnicas de PCR-SBT en la que se secuencian los fragmentos amplificados mediante PCR. La tcnica de RFLP incluye la fragmentacin del ADN con enzimas de restriccin, la separacin electrofortica de los fragmentos, la transferencia de los fragmentos separados a membranas de nylon, la hibrida-cin con sondas, de secuencias conocidas, marcadas con istopos radiactivos o con enzimas y la deteccin del producto por autorradiografa, quimioluminescencia o colorimetra. La tcnica de PCR permite amplificar segmentos particulares de ADN en pocas. Las tcnicas que actualmente ms se utilizan para realizar tipaje HLA son PCR-SSO y PCR-SSP. La PCR-SSO que se basa en: amplificacin de la zona polimrfica del ADN por PCR, hibridacin con oligonucletidos especficos de secuencia (SSO) fijados a membranas de nylon. Con la tcnica de PCR-SSP (Primers especficos de secuencia) slo se consigue amplificacin en aquellas muestras en las que los primers reconozcan el alelo para los que son especficos por lo tanto lo nico que se hace es probar la existencia o no de los productos amplificados. Mtodos Celulares Tambin existe la posibilidad de detectar los antgenos de histocompatibilidad por mtodos celulares mediante el cultivo de mezclas de linfocitos, del donante y del receptor. Esta reaccin que se conoce como CML (cultivo mixto de linfocitos), se basa en la propiedad que tienen los linfocitos de proliferar cuando se incuban en presencia de linfocitos portadores de antgenos HLA diferentes. Los linfocitos con antgenos idnticos no estimulan las respuestas proliferativas entre ellos. La proliferacin celular

se puede cuantificar utilizando diferentes tcnicas, aunque la ms comn mide la incorporacin de timidina tritiada (3HT) por las clulas proliferantes. En una variante de la reaccin, denominada CML unidireccional, las clulas estimuladoras se tratan previamente con mitomicina C para inhibir su capacidad de divisin celular, sin modificar su viabilidad (la mitomicina se combina con los husos cromticos evitando la segregacin cromosmica y la mitosis) y as las clulas slo funcionan como antgeno. Los cultivos de clulas mezcladas se mantienen de 72 a 96 h antes de adicionar la timidina radiactiva. De 4 a 18 horas despus las clulas se colectan, se lavan y se procesan para determinar la cantidad de radiactividad incorporada. La incorporacin de 3HT se establece midiendo la emisin de radiacin beta en un contador de centelleo y los resultados se expresan como cuentas por minuto. 10) HLA Y ENFERMEDAD Desde hace varias dcadas se sabe que el padecimiento de ciertas enfermedades se asocia con el incremento en la frecuencia de un determinado alelo HLA. Esta asociacin cuando tiene un valor estadsticamente significativo, se viene considerando como un factor de susceptibilidad o un marcador de riesgo a padecer la enfermedad, que puede cifrarse estadsticamente como riesgo relativo (RR) y da una idea de la mayor o menor probabilidad que tiene un sujeto a padecer una determinada enfermedad si presenta dicho marcador o alelo HLA con respecto a aquellos individuos que no lo tienen. Efectivamente, a pesar del gran polimorfismo de las molculas HLA y de la ampliacin del nmero de subtipos allicos de clase I y de clase II, hoy se conocen mltiples enfermedades que estn asociadas a clase I y otras a clase II (Tabla 5.6). El nmero de enfermedades asociadas a alelos de clase I es menor que el de las asociadas a clase II. Las causas de esta asociacin HLA y enfermedad no es conocida completamente. Por ejemplo en espondilitis anquilopoytica (EA), enfermedad invalidante y que afecta a las articulaciones de la columna principalmente, y en la que se ha descrito una fuerte asociacin con HLA-B27, se ha podido observar que ciertos pptidos antignicos de origen articular serian capaces de formar un complejo con HLA-B27 especficamente que inducira fenmenos de autoinmunidad, bien por generar en la molcula B-27 modificaciones conformacionales que la haran no ser reconocida como propia, bien por generar complejos HLA-pptido con cierta similitud con antgenos bacterianos que provocaran reacciones cruzadas autoagresivas en individuos HLA-B27, previamente sensibilizados a tales antgenos bacterianos. En el caso de la diabetes mellitus insulin dependiente (DMID), enfermedad que cursa con una destruccin selectiva de los islotes de Langerhans del pncreas, con infiltracin linfocitaria, se considera que es el resultado de una respuesta autoagresiva frente a antgenos presentes en la membrana celular mediada por linfocitos T.

Conclusin: El MHC provocan el rechazo de tejitos genticamente diferentes denominados antgenos de hostocompatibilidad. Los linfocitos T son esenciales en el rechazo de injertos. El tipaje HLA tiene especial inters en situaciones como trasplantes de rganos y medula osea, para lo cual las tcnicas usadas son: el mtodo serolgico, mediante el cual se identifica antgenos clase I y clase II excepto HLADP2; los mtodos de biologa molecular que en la actualidad son los ms usados, como la PCR; y los mtodos celulares, mediante los cuales se identifican antgenos de la clase II y confirma la identidad HLA de estudios familiares.

BIBLIOGRAFIA R. Solana, N. Fernandez, R. Gonzlez, M. Jos Garca y J. Pea. Molculas de Histocompatibilidad, en: http://www.uco.es/grupos/inmunologiamolecular/inmunologia/tema05/etexto05.htm

Trasplante De Medula sea

BIBLIOGRAFIA
Farreras, Rozman. Medicina Interna.17 edicin. Editorial Elsevier.Espaa, Barcelona. 2012. Pag 1680-1682 Revista Medicine 7 Edicin noviembre 1996. M.Alvarez Mon soto