Monitorizao de Bioprocessos

Monitorizao de Processos Biolgicos:

I. Monitorizao in-situ e on-line da Concentrao Celular em Bioprocessos Industriais
Andr A. Neves1 , Lisete S. Pinto1 , Luis M. Vieira1 , J. Cardoso de Menezes2,* .
1

CIPAN SA, Vala do Carregado, P-2601-906, Alenquer, Portugal 2 Centro de Engenharia Biolgica e Qumica, IST, Av. Rovisco Pais, P-1049-001 Lisboa, Portugal * E-mail: cardoso.menezes@ist.utl.pt Internet: http://bsel.ist.utl.pt

diferentes concentraes celulares, quer atravs de diferentes taxas especficas de produo, ou ainda da combinao de ambas. Se no fr conhecida a concentrao de clulas presentes no possvel determinar se os resultados obtidos so consequncia de maiores actividades metablicas para o produto pretendido ou simplemente de maiores concentraes celulares. A necessidade de dispr de tcnicas de monitorizao da concentrao de biomassa vivel assim evidente (Reardon e Scheper, 1991, Krairak et al .1999). Na Tab. 1 resumem-se alguns dos mtodos mais conhecidos e utilizados em condies controladas i.e., culturas escala laboratorial ou baixas concentraes celulares ou meios definidos quimicamente. No entanto, a generalidade destes mtodos fornece apenas uma indicao pouco exacta da verdadeira concentrao celular, em condies reais i.e., na presena de substratos parcialmente insolveis, culturas de microorganismos filamentosos, ou em caso de lise celular intensa. Todos estes factores so caractersticos de bioprocessos industriais, e constituem alis as principais razes da viabilidade tcnica e econmica de processos como a produo de antibiticos por fermentao. Estes processos utilizam substratos complexos parcialmente insolveis (e.g., produtos ou sub-produtos da indstria agro-alimentar), microorganismos com uma morfologia filamentosa ou em agregados densos em cultura submersa (e.g., Streptomycetes ou Penicillyum), e concentraes elevadas de biomassa a qual no fim dos processos se encontra significativamente lisada e inactiva. Todos estes factores interferem com medidas comuns como a fraco compactada de clulas ou de miclio (PCV ou PMV) e as determinaes da biomassa total em base seca (peso seco DW ou peso seco de clulas, DCW); ou mesmo com medidas mais sofisticadas como as obtidas com tcnicas espectroscpicas baseadas na medio da fluorescncia de compostos intracelulares, uma vez que a maioria dos substratos complexos so tambm fluorforos fortes. Assim, em processos de fermentao industriais so utilizados quase sempre em simultneo mais do que um dos mtodos referidos na Tab. 1, de modo a que conjugando os resultados de vrias medidas se possam monitorizar a biomassa de forma semi-quantitativa nas vrias fases de cada processo. Contudo, nenhum destes mtodos utilizado in-situ, e s em processos aerbios,

Resumo
Descreve-se a quantificao in-situ e em-linha (on-line) da concentrao de biomassa vivel em bioreactores industriais, por espectroscopia dielctrica. O princpio do mtodo baseia-se na medio da capacitncia do meio de cultura, atravs de uma sonda colocada in-situ no bioreactor, a qual se correlaciona com a concentrao de clulas no-lisadas (viveis). Neste artigo, descreve-se a utilizao da tcnica em bioprocessos e apresentam-se resultados da sua implementao industrial na monitorizao de processos de produo de antibiticos numa empresa farmacutica em Portugal.

1. Introduo
A concentrao de biomassa uma das variveis fundamentais num processo de fermentao e simultaneamente uma das mais difceis de medir, conforme atestam as mais de 20 revises bibliogrficas publicadas nos ltimos 25 anos sobre este assunto (vide Harris e Kell, 1985; Reardon e Scheper 1991). De facto, qualquer estratgia racional de investigao ou de desenvolvimento de bioprocessos (e.g., formulao de meios cultura, optimizao das condies operatrias, estudos de aumento de escala), exige o conhecimento da concentrao de clulas viveis presentes no meio de cultura (Gaden,1959). O clculo de taxas especficas i.e., referidas quantidade de biomassa presente como a taxa especfica de crescimento, de respirao, ou de consumo ou produo de determinado metabolito, permite comparar entre si diferentes ensaios laboratoriais e batchs industriais de determinado bioprocesso, mesmo que conduzidos em condies diferentes. Por exemplo, possvel modificar um bioprocesso para obter diferentes produes de determinado metabolito, quer atravs de

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O principal objectivo deste artigo , pelas razes anteriores, o de divulgar uma tcnica que pode ser aplicada num grande nmero de problemas biotecnolgicos e.g., em digestores anaerbios em estaes de tratamento como ETARs apresentando para isso dados de implementaes industriais na rea farmacutica da produo de antibiticos por fermentao. Iniciamos com este trabalho uma srie de quatro artigos dedicados monitorizao da concentrao celular em processos industriais de produo de antibiticos, com tcnicas pouco divulgadas ou que para as quais so desconhecidas aplicaes industriais em Portugal.

Tabela 1. Mtodos mais comuns de monitorizao da concentrao celular.

Tipo Mtodo

mtodos qumicos

doseamento espectrofotomtrico ou qumico de constituintes da clula, viz., DNA, RNA, ATP ou fosfolpidos gravimtrico, biomassa em base seca (DCW) centrifugao, fraco volumtrica de miclio compactado (PMV) pticos em-diferido, viz., densidade ptica (D.O.)

mtodos fsicos

espectroscpicos em-linha e in situ (fluorescncia) atravs da concentrao intracelular de NADH e NADPH anlise de imagens digitais, utilizando luz visvel e marcadores moleculares (epifluorescncia) espectroscopia dielctrica em-linha e in situ contagem de clulas (viz., contador de Coulter) medio da viscosidade aparente do meio de cultura

mtodos inferenciais

mtodos de inferncia com modelos matemticos ou estequiomtricos, viz., a partir da taxa de consumo de O2 ou de produo de CO2, em processos aerbios

* Harris e Kell (1985) e Reardon e Scheper (1991)

2. Monitorizao de Bioprocessos com Espectroscopia Dielctrica

atravs da tcnica de anlise das concentraes e O 2 e CO2 no ar exausto, se consegue obter indirectamente a quantidade total de biomassa vivel num bioprocesso em condies industriais, em tempo real e em-linha com o processo (i.e., on-line, de modo automtico e sem a interveno de um analista). A anlise computacional de imagens digitais obtidas em-diferido (off-line) mesmo sendo possvel junto do processo (i.e., at-line, permitindo obter resultados em tempo til, ou seja, escala dos tempos de resposta do prprio processo) requer a interveno de um analista especializado. H cerca de 10 anos surgiu uma nova tcnica, baseada na espectroscopia dielctrica, que capaz de operar em condies industriais de modo automtico por longos perodos de tempo, in-situ e em-linha, apresentando a especificidade necessria para a biomassa vivel, mesmo na presena de meios de cultura complexos e de clulas lisadas (Fehrenbach et al ., 1992; Sarra et al., 1996). Dado o preo relativamente elevado (ca. 50.000 para um sistema simples de uma sonda) e o facto de ser uma tcnica dedicada monitorizao de um nico parmetro em condies que s quase exclusivamente ocorrem em bioprocessos industriais, a sua adopo tem sido quase exclusiva de grandes empresas farmacuticas. Em Portugal, em particular, desconhece-se a existncia deste tipo de tcnica de monitorizao em qualquer centro de investigao pblico, ou mesmo em qualquer outra empresa da rea biotecnolgica.

Harris et al. (1987) verificaram que na gama das frequncias rdio (0.1-10 MHz) a membrana celular comporta-se com um capacitor elctrico, polarizando-se pelo chamado efeito de disperso- e que a intensidade da polarizao proporcional ao volume da clula. Assim, a monitorizao em-linha da capacitncia de um meio de cultura, utilizando uma sonda adequada, pode ser directamente relacionada com a concentrao celular (Kell et al., 1990). Nos estudos realizados por laboratrios de investigao em diversas universidades com o Biomass Monitor , um dos aparelhos no mercado, verificou-se que as medidas no so afectadas pelo teor de insolveis ou por variaes no hold-up gasoso do meio de cultura, e que desde que a biomassa morta esteja lisada, as medidas com este tipo de tcnica correspondem quantitativamente concentrao de clulas viveis (Fehrenbach et al., 1992; Sarra et al., 1996; Krairak et al.,1999). Neste trabalho comparam-se os resultados da monitorizao in-situ e em-linha com uma sonda de capacitncia com os resultados obtidos com mtodos usuais (biomassa seca, fraco volumtrica compactada de clulas, viscosidade, concentrao de DNA e a quantidade total de CO2 respirada) em condies de cultura industriais de produo do cido clavulnico com o Streptomyces clavuligerus.

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10 (a)
Conductance (mS) 15

Biomass Monitor . As frequncias baixa e alta utilizadas foram 0.4 e 10 MHz, respectivamente. Para efeitos de calibrao do Biomass Monitor em unidades de concentrao, realizaram-se fermentaes com um meio de cultura solvel (Neves et al., 2000), tendo-se obtido a relao linear cap (pF) = (0.46 0.05) DCW (gL-1) vlida at ca. 20 gL-1 de DCW, o valor mximo de DCW obtido naquelas experincias ( 95% confidence intervals, r = 0.998).
TOTCO (g/L)

8
10

Cap (pF);

6 4 2 0 14 (b) 12
TOT CO 2 Cap Cond

15

4. Resultados e Discusso
10

Conductance (mS)

TOTCO2 (g/L)

10 8 6 4 2 0 -2 0 20 40 60 Time (h)
TOT CO 2 Cap Cond

Cap (pF);

80 100 120 140

A seguir apresentam-se os resultados da monitorizao da concentrao celular de S. clavuligerus, em bioreactores piloto-industriais de 500 litros, com dois meios de cultura complexos: o primeiro solvel, contendo peptona, e o segundo, o meio utilizado industrialmente, parcialmente insolvel. A partir da actividade respiratria da cultura medida em-linha com analisadores de O2 e CO2 dedicados, foi possvel observar e definir as diferentes fases pelas quais passa a cultura: adaptao, crescimento exponencial, transio, crescimento linear (fase de produo) e lise (Neves et al., 2000). Foi possvel definir tambm a quantidade cumulativa (i.e., integral) de CO2 produzido pela cultura desde o instante de inoculao (TOTCO2). A Fig. 1 mostra os perfis de TOTCO2 e das medidas obtidas com a sonda de capacitncia viz., cap e condutncia em ensaios com os dois meios de cultura referidos. Observa-se uma correlao razovel entre cap e TOTCO2 na fase exponencial (i.e., at ca. 20 h para o meio solvel e ca. 25 h para o meio industrial), descrita pela equao na Tab. 2. A variao observada na condutncia do meio

Figura 1. Perfis da capacitncia (cap), condutncia e quantidade total de CO2 produzida, medidas em linha em culturas de S. clavuligerus. (a) com meio solvel. (b) com meio industrial insolvel.

3. Materiais e Mtodos
Em Neves et al. (2000) encontra-se uma descrio de todos os mtodos e condies experimentais utilizadas. Em seguida, apresenta-se apenas uma descrio sumria das condies em que foi utilizada a tcnica baseada em espectroscopia dielctrica.

Utilizou-se o instrumento Biomass Monitor , modelo 214 (Aber Instruments, Aberystwyth, UK), na verso dual-frequency (0.2-1.0 MHz e 10MHz). As Tabela 2. Relaes lineares entre as medidas de capacitncia dos medidas foram realizadas meios de cultura e as de outras medidas da concentrao de biomassa . com uma sonda de capacitncia inserida directamente no bioreactor Meio de Cultura Equao* Validade atravs de uma porta standard tipo Ingold de 25 cap = (0.83 0.02) x TOTCO2 + (0.00 0.04) fase exponencial r=0.997 mm de dimetro localizada cota aproximada do 1 cap = (0.510.02) x DCW (1.10.4) solvel fases exponencial, r=0.980 andar de agitao. A (peptona) de transio e linear esterilizao da sonda foi cap = (11.6 0.7) x DNA (0.8 0.3) realizada in-situ. Todas as fase exponencial r=0.996 medidas foram realizadas em modo low-range com o cap = (1.13 0.02) x TOTCO2 (2.65 0.09) fase exponencial filtro low-pass ligado. A r=0.999 parcialmente capacitncia (cap) e a insolvel (industrial) conductncia foram medidas cap = (9.8 0.5) x DNA (1.5 0.1) fase exponencial r=0.996 em-linha com uma frequncia de 0.2 min -1 atravs de um sistema de * ( desvio padro, intervalos de confiana a 95%) aquisio de dados ligado ao

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de cultura nas duas experincias, inferior ao valor limite de 20 mS, tornando desprezvel o seu efeito sobre a capacitncia medida. Na Fig. 2a) comparam-se as medidas de capacitncia feitas em-linha com os valores da concentrao de biomassa em base seca (DCW) realizadas em-diferido, verificando-se uma correlao elevada entre os dois tipos de medidas at s 80 h de fermentao (Tab. 2). Este resultado explica-se com o reduzido teor de matria em suspenso no ensaio com o meio solvel e com o facto da concentrao de biomassa morta ser baixa. Na verdade, observa-se que a viabilidade da cultura (% clulas viveis) a esta idade do processo , em geral, superior a 90% (Pinto,1999). A concordncia entre cap e DCW verificada consistente com a observada por Sarra et al. (1996) e por Fehrenbach et al. (1992) que estudaram a cultura de Streptomycetes em meios definidos solveis. Para a cultura com o meio industrial observa-se que as duas medidas anteriores diferem significativamente (Fig. 2b). As medidas de DCW so insensveis ao crescimento de biomassa at ao fim da fase exponencial, devido presena de substncias insolveis em quantidades elevadas (cf. Fig. 2a e 2b), enquanto que nas fases de crescimento seguintes, verificam-se tendncias de variao semelhantes nos perfis das duas medidas. Este ltimo resultado novamente consistente com a observao, por anlise digital de imagem (Pinto, 1999), de que neste processo com o meio industrial a percentagem de clulas viveis normalmente muito elevada (> 90%). Na Fig. 3 representam-se os perfis da fraco volumtrica de miclio compactado (PMV) e da capacitncia para os dois meios de cultura. Embora se observem tendncias globais semelhantes entre as medidas nos dois casos, verificam-se desvios significativos mesmo entre os resultados obtidos com o meio solvel. As alteraes de morfologia observadas no microorganismo durante o processo e a presena de insolveis permitem explicar estes desvios. Assim, ao contrrio da medidas de TOTCO2 e de DCW, a monitorizao baseada em medidas de PMV no chega a ser semi-quantitativa, podendo apenas considerar-se uma medida qualitativa aproximada do crescimento da cultura. Uma outra varivel que habitualmente medida industrialmente, por se ter constatado empiricamente que est relacionada com a concentrao de biomassa, a viscosidade aparente do meio de cultura. Diversos autores mostraram que a viscosidade aparente constitui um meio aceitvel para estimar a concentrao de biomassa em culturas de miclio, na ausncia de outras medidas (Perley et al., 1979; Sarra et al., 1996). A Fig. 4 mostra que de facto esta medida pode ser utilizada semiquantitativamente para descrever a concentrao de biomassa vivel presente durante todo o processo e nos dois tipos de meios de cultura (Tab. 2). A divergncia observada na fase final do ensaio com o meio industrial

30

14 12 10 Cap (pF) 8 6 4 2 0

(a)
25 20 15 10 5 0

14 12 10 Cap (pF) 8 6 4 2 0

(b) (b)

30 25

15 10 5 0

20

40

60

80 100 120 140

Time (h)

Figura 2. Perfis da capacitncia ( cap) e da concentrao em base seca (DCW) em culturas de S. clavuligerus. (a) com meio solvel. (b) com meio industrial insolvel. (barras de erro para 95% de confiana)

10 8 Capacitance (pF) 6 4 2 0

35

(a)
30 25 20 15 10 5 0

20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0

60

(b)
50 40 30 20 10 0 p.m.v (%v/v)

Capacitance (pF)

20 40 60 80 100 120 140 Time (h)

Figura 3. Perfis da capacitncia ( cap) e da fraco volumtrica de miclio compactado (PMV) em culturas de S. clavuligerus. (a) com meio solvel. (b) com meio industrial insolvel. (barras de erro para 95% de confiana)

(Fig. 4b) provavelmente o resultado das alteraes morfolgicas (viz., fragmentao) que so observadas neste perodo (Pinto, 1999).

p.m.v (%v/v)

D.C.W. (G/L)

20

D.C.W. (g/L)

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Por ltimo compararam-se as medidas da concentrao intracelular de DNA com as medidas da sonda de capacitncia inserida no meio de cultura. Observa-se a
12 10 8 Cap (pF) 6
200 500

(a) Apparent viscosity (cp)

400 300

existncia de correlao entre os dois tipos de medidas nas fases de adaptao e exponencial (Fig. 5 e Tab. 2). Durante a fase exponencial as generalidade das clulas so viveis e possuem como seria de esperar uma concentrao intracelular aproximadamente contante em DNA. Por isso os dois tipos de medidas so directamente proporcionais e observada a relao linear da Tab. 2.

4 2 0
100 0

Concluso
Demonstrou-se a utilizao em condies industriais de uma nova tcnica de monitorizao da concentrao celular, baseada em princpios da chamada espectroscopia dielctrica. Compararam-se as medidas obtidas com uma sonda de capacitncia a operar segundo aquele princpio, com as medidas que tipicamente so possveis realizar em ambiente industrial (DCW, PMV, viscosidade, concentrao de DNA e a produo cumulativa de CO2 pela cultura). Apesar de se terem obtido em determinadas fases do processo, para a maioria destas medidas, boas relaes lineares com a capacitncia do meio de cultura, nenhuma das tcnicas habitualmente utilizadas industrialmente permite monitorizar a concentrao de clulas viveis ao longo de todo o processo. Embora apenas se tenham apresentado resultados 3 escala de 0.5 m , nos ltimos 2 anos a tcnica tem sido aplicada na CIPAN S.A. na monitorizao da concentrao celular em bioreatores industriais com 25 m3 e 40 m3 com sucesso assinalvel (Pinto et al., 2000). No futuro, nestes processos podero substituir-se as tcnicas de monitorizao em-diferido pela tcnica emlinha descrita, permitindo a implementao de estratgias de investigao, desenvolvimento e operao dos bioprocessos mais exactas, reprodutveis e rpidas. Agradecimentos

500 400 300 200 100 0

20 40

60 80 100 120 140 Time (h)

Figura 4. Perfis da capacitncia ( cap) e da viscosidade aparente, em culturas de S. clavuligerus. (a) com meio solvel. (b) com meio industrial insolvel. (barras de erro para 95% de confiana)
12 10 8 Cap (pF) 6 4 2 0
1.0

(a)

0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0
(A ) 600nm

1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

DNA concentration ( A600 nm )

14 (b) 12 10 8 6 4 2 0 -2 0 20 40 60 80 100 120 140 Time (h)

1.6 1.4

DNA concentration

Apparent viscosity (cp)

16 14 12 10 8 6 4 2 0

800 (b) 700 600

Cap (pF)

Figura 5. Perfis da capacitncia ( cap) e da concentrao intracelular de DNA em culturas de S. clavuligerus. (a) com meio solvel. (b) com meio industrial insolvel. A sonda de capacitncia testada permite monitorizar in-situ e em-linha a concentrao celular, fornecendo com exactido, de modo automtico e em condies industriais a concentrao de biomassa no-lisada (vivel).

Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Programa PRAXIS XXI atravs da Agncia de Inovao (projecto FASTERPROD, L009-P31B-09/96). AAN agradece Fundao para a Cincia e a Tecnologia o financiamento da bolsa que teve tambm pelo programa PRAXIS XXI (FCT-BMCT/96/ 12352). Os autores agradecem CIPAN S.A. o apoio dado ao projecto e a autorizao para publicar os resultados anteriores. Os autores agradecem ainda a colaborao da ABER Instruments (http://www.aberinstruments.com/) tanto no incio do trabalho, permitindo atravs do aluguer de um aparelho realizar os pr-testes necessrios, como posteriormente sua aquisio o apoio dado na utilizao eficaz do Biomass Monitor

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Cap (pF)

Monitorizao de Bioprocessos Smbolos e Abreviaturas

cap DCW Capacitncia do meio de cultura Biomassa em base seca Fraco volumtrica de miclio Quantidade total ou cumulativa de CO 2 produzida at ao instante t PF (pico Faradays) g-peso seco .L-meio de cultura-1 % v/v Reardon, K.F. and Scheper, T.H. (1991) Determination of Cell Concentration and Characterization of Cells. in Measuring, Modeling and Control., vol. 4, pg. 179-223, Ed. K. Schgerl, 2nd ed., in Biotechnology, Eds. H.J. Rehm, G. Reed, VCH, Germany. Sarra, M., Ison, A.P. and Lilly, M.D. (1996) The relationships between biomass concentration, determined by a capacitancebased probe, rheology and morphology of Saccharopolyspora erythraea cultures. J. Biotechnol. 51,157-165.

PMV

TOT CO2

mmoles CO2. L-meio de cultura-1. h -1

Bionotcias (continuao da pgina 19)

Congresso sobre Genmica e Protemica (as tecnologias que esto a revolucionar as Cincias da Vida) Oeiras (Edifcio ITQB/IBET), 4 de Maio 2001 Data limite de inscries: 27 de Abril de 2001 Informaes: Gonalo Carneiro, STAB, Lda e-mail: carneiro@stabvida.com Tel. 214469765 Fax: 214469740 Jornadas Tcnicas FIOVDE2001 Tomar, 24 e 25 de Maio de 2001 Informaes: FIOVDE Federao das Indstrias de leos Vegetais, Derivados e Equiparados Av. Antnio Jos de Almeida, n 7 2 1000-042 Lisboa Tel. 217991550 Fax. 217991551 e-mail: fiovde@fiovde.pt Conferncia Internacional sobre Biotecnologia Informar para Decidir Auditrio 1 AIP, Parque das Naes Lisboa, 24 e 25 de Maio de 2001 Informaes: e-mail: iaca@mail.telepac.pt Tel. 213525091 Fax. 213530387 (continua na pgina 27)

Bibliografia
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