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La expansin y la evolucin de programas de muerte celular

Abstracto La muerte celular histricamente se ha subdividido en los mecanismos regulados y no regulados. La apoptosis, una forma de muerte celular regulada, refleja la decisin de una clula a morir en respuesta a las seales y se ejecuta por la maquinaria celular intrnseca. La muerte celular no regulada (a menudo llamado necrosis) es causada por el estrs abrumadora que es incompatible con la supervivencia celular. Nuevas pruebas, sin embargo, sugiere que estos dos procesos no explican adecuadamente los diversos mecanismos de muerte celular. Los ltimos datos apuntan a la existencia de mltiples mecanismos de muerte celular regulada nonapoptotic, algunos de los cuales se superponen o se excluyen mutuamente con la apoptosis. Aqu examinamos cmo y por qu estos diferentes programas de muerte celular se han desarrollado, con la mirada puesta en las nuevas oportunidades teraputicas citoprotectoras. La muerte celular es una respuesta celular fundamental que tiene un papel crucial en la formacin de nuestros cuerpos durante el desarrollo y en la regulacin de la homeostasis del tejido mediante la eliminacin de clulas no deseadas. La primera forma de muerte celular regulada o programada (PCD) para ser caracterizado era la apoptosis, que se describi en Caenorhabitis elegans en la dcada de 1990. Anlisis gentico posterior de apoptosis de mamfero presenta un panorama ms complejo, en el que la apoptosis genes individuales de C. elegans han expandido a grandes familias de mltiples protenas (Figura 1). Estos hallazgos sugieren que la redundancia, la especializacin funcional y la regulacin de compensacin de la sealizacin de apoptosis de mamfero y ejecucin podran ser caractersticas importantes de la apoptosis de mamferos. Debido a su naturaleza conservada y uniforme, la apoptosis se define con frecuencia de manera mecnica como una va de la muerte celular regulada que implica la activacin secuencial de las caspasas, una familia de proteasas de Cys, y que est controlado tanto positiva como negativamente por el linfoma de clulas B de la protena-2 (BCL2) miembros de la familia. Los ensayos han sido desarrollados para mltiples pasos de la va, lo que permite la caracterizacin de la muerte apopttica in vitro e in vivo. La muerte celular apopttica se caracteriza por rasgos morfolgicos distintivos, incluyendo fragmentacin nuclear, formacin de ampollas en la membrana y la formacin de cuerpos apoptticos (ver. Ref. 2 para ms detalles), que se puede utilizar para identificar eventos de muerte de clulas apoptticas. Los estudios genticos han demostrado que la apoptosis tiene un papel importante durante el desarrollo normal de los mamferos, especialmente en el sistema nervioso central donde la deficiencia gentica de genes de apoptosis (tales como la caspasa-9, factor de apoptosis-1-proteasa activadora (APAF1), y BCL2-X asociada protena (BAX) y BCL2-antagonist/killer-1 (BAK) ratones dobles mutantes) se traduce en importantes abnormalities4-6. La apoptosis tambin funciona para mantener la homeostasis, especialmente en el sistema inmunolgico, ya que elimina las clulas no deseadas. La desregulacin de la apoptosis conduce a diversas enfermedades humanas, tales como el cncer y la autoinmunidad. La activacin inapropiada de la muerte celular es tambin la causa principal de la lesin tisular y declive funcional en un gran nmero de enfermedades agudas (tales como accidente cerebrovascular, infarto de miocardio y trauma cerebral) y enfermedades crnicas (tales como la diabetes y la neurodegeneracin). Sin embargo, las terapias citoprotectores efectivos para estas enfermedades siguen siendo una importante necesidad mdica no cubierta. En gran medida, el xito limitado de desarrollo de frmacos citoprotector se puede remontar a la vista simplificada que la muerte celular est bien regulada intrnsecamente por apoptosis o que no est regulada, causada por el estrs abrumador (llamada necrosis). Necrosis posee rasgos caractersticos, tales como orgnulo hinchazn, la disfuncin mitocondrial, el estrs oxidativo masivo y rpido permeabilizacin de la membrana plasmtica, que se cree que es indicativo de la naturaleza catastrfica de la muerte celular, en lugar de un resultado de la regulacin celular. La vista general de la relacin entre la apoptosis y la necrosis es que los insultos ms leves a la causa apoptosis de las clulas, mientras que los insultos ms intensos inducen necrosis incontrolable. Se cree que tal aparentemente no reguladas - y por lo tanto inalcanzable - cuentas de proceso para la mayor parte de los eventos de muerte celular en patologas

agudas. Sin embargo, en los ltimos aos, han surgido pruebas para una serie de vas de la muerte de clulas no apoptticas reguladas, incluyendo algunos con caractersticas morfolgicas que fueron atribuidos anteriormente a necrosis8. Ha quedado claro que la simple clasificacin de apoptosisnecrosis no representa adecuadamente la complejidad de la regulacin de la muerte celular endgeno. Ahora estamos empezando a apreciar las importantes funciones de la muerte celular apopttica no regulado en la regulacin y el desarrollo de las enfermedades humanas homeosttico. En esta revisin, primero ofrecemos una breve descripcin de la apoptosis y luego examinamos cmo los mamferos podran haber adquirido genes ms apoptosis y la regulacin de la apoptosis ms complejo a travs de la duplicacin de genes. A continuacin describimos ejemplos de vas de muerte celular no apoptticos regulados y considerar las posibles relaciones y orgenes evolutivos de los diversos procesos de muerte celular. La apoptosis - el mecanismo fundamental de PCD El mecanismo de PCD dilucidado por estudios genticos en el nematodo C. elegans define un paradigma primordial de apoptosis9. En C. elegans, la activacin de la CPD es controlado por una va elegante y simple (figura 1). El inicio de la apoptosis est regulada por la regulacin positiva de la transcripcin EGL-1, una homologa-3 pro-apoptticos BCL2 (BH3)-nico miembro de la familia de protenas BCL2. La unin de EGL-1 a antiapopttico CED-9 alivia la inhibicin que CED-9 ejerce sobre el adaptador de protena CED-4, lo que permite CED-4 para unirse y activar la proteasa CysCED-3, que a su vez escinde mltiples sustratos celulares especficos a ejecutar la muerte celular. Anlisis de la apoptosis en clulas de mamfero ha llevado a la identificacin de mltiples homlogos de mamferos para cada clase de la C. elegans CED protenas. Extensos estudios han puesto de manifiesto que el mecanismo de la apoptosis de mamfero es similar a la de C. elegans, a pesar de que se ha vuelto mucho ms compleja (figura 1). Por ejemplo, aunque la regulacin positiva transcripcional de los miembros pro-apoptticos de la familia BCL2 todava puede jugar un papel en la iniciacin de la apoptosis en clulas de mamfero, muchos BH3-slo los miembros pro-apoptticos de la familia BCL2, se pueden activar en un nmero de maneras diferentes ( incluyendo la escisin, la fosforilacin, ubiquitinacin miristoilacin y 13-16) para regular el inicio de la apoptosis. En clulas de mamferos, las EGL-1-como BH3-slo los miembros activados de la familia BCL2 tambin inhiben CED-9-al igual que los miembros anti-apoptticos de la familia BCL2 (como BCL2, Bcl-XL y MCL 1) mediante la interaccin directa (CAJA 1; la figura 1).. Sin embargo, un importante mecanismo por el cual los miembros anti-apoptticos de la familia BCL2 no protegen a las clulas es a travs de la inhibicin directa de la activacin de la caspasa en el nivel de molculas adaptadoras (por ejemplo, la protena APAF1 CED-4-como mamferos), pero mediante la proteccin la integridad de la mitocondria (BOX 1,. Figura 1). BH3-nicos factores se unen y antagonizan anti-apoptticos BCL2 miembros de la familia que residen en la membrana mitocondrial externa. Protenas antiapoptticas BCL2 ejercen su actividad mediante la prevencin de la pro-apoptticos de la familia BCL2 multidominio miembros BAX y BAK de causar dao mitocondrial, y la unin de BH3-slo las protenas alivia esta inhibicin. Adems, una subclase de BH3-nicos factores podra inducir directamente la formacin de un canal de BAX-BAK, a pesar de lo mucho que este mecanismo directo contribuye a la apoptosis sigue siendo un tema de debate. BAX y BAK se han propuesto para formar un oligmero (por lo menos tetramrica o ms grande) canal que conduce a dao mitocondrial y liberacin de citocromo c. En algunos casos, BAX y BAK pueden actuar a travs de interacciones con los componentes del poro de permeabilidad mitocondrial, es decir, con el canal aninico dependiente de voltaje (VDAC). Dao mitocondrial tambin podra ser causada por los mecanismos de BAX-y BAKindependent, tales como los inducidos por intramitocondrial K + afluencia, o causado por la accin directa de la caspasa-2 en las mitocondrias (que se produce, curiosamente, independientemente de la actividad de la proteasa de la caspasa-2) . Dao mitocondrial y la liberacin de protenas mitocondriales amplifica la sealizacin de apoptosis en clulas de mamfero, un paso que se considera que es menos importante para la apoptosis en los organismos inferiores, incluidas las moscas y los gusanos. El citocromo c, que se libera desde la mitocondria daada, promueve la

formacin de un megacomplejo heptameric 'apoptosoma' de APAF1 y la caspasa-9 (un miembro de la familia de las proteasas Cys CED-3-como). Esto conduce a que el cambio conformacional y la activacin de la caspasa-9 (figura 1). Activado caspasa-9, a su vez escinde y activa las caspasas aguas abajo, incluyendo la caspasa-3, caspasa-6 y caspasa-7, que llevan a cabo la fase de ejecucin de la apoptosis. Adems de la va de la apoptosis intrnseca, que se asemeja a PCD en C. elegans, clulas de mamferos tambin poseen una va de la apoptosis extrnseca, que es inducida por las citoquinas proapoptticas y pro-inflamatorias (tales como ligando FAS (FASL) y factor de necrosis tumoral (TNF), que son ligandos para el receptor de la muerte- familia).Mediante la unin a los receptores de muerte-dominio, FASL y TNFa inducir la formacin de complejos especficos intracelulares inducidas por la muerte de sealizacin (DISCs23), que activan caspasas aguas arriba, tales como la caspasa8. La activacin de la caspasa-8 a su vez puede escindir caspasas, como la caspasa-3 y caspasa-7, para ejecutar la muerte celular; alternativamente, caspasa-8 puede escindir la BH3-slo BID protena proapopttica, que a su vez amplifica la seal de muerte celular por causar dao mitocondrial y la muerte celular. El desarrollo de los programas de la apoptosis mediada por citoquinas en los organismos multicelulares superiores proporciona una manera fundamental la articulacin de la regulacin del nmero de clulas en el nivel organismal en respuesta a los estmulos ambientales. Expansin evolutiva de la apoptosis Aunque los reguladores principales de PCD en C. elegans consistir slo 4 genes - EGL-1, ced-3, ced4 y ced-9 - cada uno tiene varios homlogos de mamferos. Sobre la base de una estrecha homologa en las regiones clave, el ced mamferos como los genes probablemente surgi a travs de la duplicacin de genes y podra haber evolucionado y se ha seleccionado durante la evolucin para afrontar los retos que enfrentan los organismos altamente compleja multicelular.

Mltiples genes permiten la especializacin funcional Una consecuencia directa de esta duplicacin de genes es la especificacin -. Diferentes reguladores de la apoptosis responden a diferentes seales

pro-apoptticas. La familia de las caspasas de mamferos es un excelente ejemplo de la especificacin. Los diferentes miembros de la familia de caspasas poseen distintas funciones en las clulas de mamferos que se basan predominantemente en su localizacin subcelular y las interacciones protena-protena en lugar de en sus especificidades de sustrato. Caspasas de mamferos fueron asignados inicialmente a tres clases principales: caspasas apicales o activador, como la caspasa -2, -4, -8, -9, -10 y -12, que inician la cascada de caspasas en la apoptosis; caspasas ejecutoras, tales como la caspasa -3, -6 y -7, que actan en los pasos de ejecucin aguas abajo del proceso, y caspasas inflamatorias, tales como la caspasa -1, -5 y -11, que median la muerte celular y las respuestas inflamatorias. Otros anlisis sugieren que puede haber importantes diferencias adicionales entre los miembros de la familia en la misma clase. Caspasas Activator tienen funciones distintas que dependen de la activacin de los complejos que son reclutados para. Por ejemplo, la caspasa-8 contribuye especficamente a la sealizacin del receptor de la muerte y la proliferacin normal de los linfocitos; caspasa-2 media estrs genotxico mediada por la muerte; ratn caspasa-12 humana y la caspasa-4 mediar retculo endoplsmico (ER)-estrs mediada por la muerte; y la caspasa-9 es activado por los apoptosoma aguas abajo de la liberacin del citocromo c. Esta divisin del trabajo podra proporcionar un mecanismo sensible a permitir que los organismos multicelulares complejos para detectar y responder diferencialmente a los distintos estmulos ambientales. Una divisin similar de mano de obra se ha observado para los miembros de la familia BCL2. BCL2 miembros de la familia pueden subdividirse en tres categoras principales, sobre la base de differences17 estructural y funcional (cuadro 1). Sin embargo, estudios recientes sugieren que existen diferencias sutiles pero importantes en cada sub-clase. En particular, a pesar de todos los BH3-nicos factores similares poseen un modo de EGL-1-al igual que de accin, que pueden ser activados no-redundante por determinados tipos de seales de apoptosis. Por ejemplo, media BID sealizacin del TNF-familia y el estrs genotxico; BIM juega un papel clave en la induccin de la muerte en las clulas linfoides y mieloides

siguientes a la retirada de citoquinas; NOXA y PUMA de seal aguas abajo de p53 (Ref. 34), y BMF tiene una papel clave en anoikis. Las especificidades de BH3-slo los factores no slo el resultado de sus interacciones con los reguladores de aguas arriba, que tambin son el resultado de sus preferencias de unin diferentes para diferentes multidominio BCL2 miembros de la familia. Por ejemplo, el dominio BH3 de MAL se une BCL2 y BCL-XL, mientras que el dominio BH3 de NOXA muestra selectividad hacia MCL 1 y la protena A1 relacionada con BCL2 (Ref. 36). Tal selectividad en las interacciones de los diferentes miembros de la familia BCL2 proporciona una importante base mecanicista para la activacin de distintas vas de sealizacin de apoptosis en respuesta a diferentes estmulos pro-apoptticos.

Las ventajas de la redundancia. Un significado adicional y no conflictivo de la multiplicacin de los

reguladores de la apoptosis es el beneficio que se proporciona por la redundancia. La redundancia de los programas de la apoptosis en clulas de mamfero se muestra por la regulacin al alza compensatoria de las caspasas en diferentes ratones mutantes caspasa - la prdida de una caspasa puede ser compensada por la regulacin al alza de otra caspasa. Aunque la especificacin de los diferentes reguladores de apoptosis en una seal, y / o forma compartimentacin subcelular proporciona un mecanismo para respuestas celulares afinar, el peligro podra surgir si la respuesta especificada se ha perdido debido a una mutacin gentica. En este caso, parece que la regulacin positiva de una caspasa alternativa, o de sus reguladores, se puede compensar la prdida de una caspasa especfica. Aunque diferentes caspasas exhiben especificidad hacia ciertos sitios de escisin, tal especificidad es relativa. Cuando est presente en una concentracin suficiente y dado suficiente tiempo de incubacin, la mayora de las caspasas puede escindir la mayora, si no todos, de los sustratos de la caspasa que se han identificado hasta la fecha. La escisin preferencial de un subgrupo selectiva de sustratos de caspasa en la fase temprana de la apoptosis slo puede reflejar la proximidad de los sustratos de las caspasas activadas en ese momento especfico o que puede servir para modular la cintica del proceso. La capacidad de mltiples caspasas escinden a sustratos comunes podra servir para asegurar la ejecucin de la apoptosis, incluso cuando se pierde una caspasa. Por otra parte, aunque las caspasas aguas arriba se pueden activar preferentemente durante las primeras etapas de la apoptosis (tales como la caspasa -8 y -10, que se activa preferentemente en respuesta a una seal de FASL o TNF), todos los caspasas se escinden y se activan durante las etapas posteriores de la apoptosis. Por lo tanto, todas las caspasas puede contribuir a la ejecucin de la apoptosis. La apoptosis en clulas de mamfero est programado genticamente para maximizar la capacidad de matar las clulas una vez una orden apropiada se recibe. Ampliacin o reduccin. Aunque los hallazgos mencionados anteriormente nos llevan a sugerir que las vas de apoptosis expandieron durante la evolucin, otro punto de vista tambin es posible. C.elegans, junto con sus parientes evolutivos, podran haber experimentado una reduccin en la complejidad de la maquinaria apopttica de antepasados primordiales con maquinaria apopttica que podran haber sido ms cercano al de los seres humanos. Sin embargo, nos encontramos con este escenario menos probable, porque no hay tal maquinaria apopttica desarrollado, se asemeja a la de los mamferos, ha sido identificada en los organismos ms primitivos, tales como plantas, hongos y bacterias. Los mecanismos no-apoptticos de la muerte celular Nuevas evidencias sugieren que la apoptosis no es el nico mecanismo de suicidio celular, sino que las clulas puede elegir uno de los muchos mecanismos a morir cuando estn listos, con la apoptosis a menudo representa la mejor opcin. En C. elegans, eventos de muerte celular ms desarrollo se producen a travs del mecanismo de apoptosis y slo los eventos poco comunes, tales como la muerte del desarrollo de una clula enlazador, son no-apoptticos. Llene la muerte celular I, que muestra la morfologa caracterstica de la apoptosis como se discuti anteriormente, es tambin la forma ms frecuentemente observado de la muerte durante el desarrollo normal de ratn. Aunque la induccin de la muerte celular de desarrollo morfolgicamente no apopttica se hace prominente enratones in

vivo cuando la maquinaria apopttica se interrumpe genticamente (por ejemplo, en las neuronas

motoras de la caspasa-deficientes), se podra cuestionar si la muerte celular no apopttica tambin puede ocurrir en condiciones normales cuando la apoptosis Es posible. Se podra argumentar que los mecanismos no apoptticas representan rudimentarias formas de back-up de la muerte celular que slo son relevantes en circunstancias excepcionales, cuando la maquinaria apopttica es genticamente disponible. Sin embargo, la comprensin de los mecanismos moleculares que subyacen a la muerte de clulas no apoptticas in vitro ha comenzado a surgir, y ahora estamos empezando a apreciar la importancia de estos procesos. A continuacin, se resumen los datos que se describen tres nuevas nonapoptotic vas de muerte celular regulada: la muerte celular tipo II, necroptosis y poli (ADPribosa) polimerasa-1 (PARP1) mediada por la muerte necrtica.

Muerte de las clulas de tipo II. Muerte de las clulas de tipo II se caracteriza por la acumulacin de

vesculas de doble membrana-cerrados. Estas vesculas son caractersticos de la autofagia y la muerte celular por lo tipo II a menudo se llama la muerte celular por autofagia, aunque el papel de la autofagia en este tipo de muerte celular est siendo objeto de debate. La autofagia es un mecanismo catablico intracelular conservadas evolutivamente que opera en niveles bajos en condiciones normales para mediar la degradacin de los componentes citoplasmticos, agregados de protenas y orgnulos intracelulares caducados (por ejemplo, la sala de emergencia y mitocondrias) mediante la formacin de vesculas de doble membrana-cerrados llamados autofagosomas . El contenido de autofagosomas son degradados por enzimas lisosmicas despus de autofagosomas fusionan con los lisosomas. En condiciones normales, la autofagia tiene un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis intracelular. En esta funcin, la autofagia elimina orgnulos daados o disfuncionales y las protenas mal plegadas que pueden ser perjudiciales para la supervivencia (por ejemplo, de las neuronas). En condiciones de privacin de nutrientes, la autofagia promueve la supervivencia celular por degradantes contenido intracelular desechables, generando de ese modo los bloques de energa y la construccin para la sntesis de protenas. La autofagia es regulada por un gran grupo de genes (ATG autofagia relacionada) que se conservan de la levadura a los seres humanos (Cuadro 2). La activacin de la autofagia durante Drosophila melanogaster metamorfosis ha sido bien establecida. Uso de eliminacin gentica de los genes ATG, se demostr recientemente que la falta de la autofagia atenuada la degradacin de D. melanogaster glndulas salivales mediante el bloqueo de la CPD. Por lo tanto, este estudio proporciona evidencia del papel de la autofagia en la muerte celular en el desarrollo. Sin embargo, la falta de muerte celular efects en ratones mutantes deficientes en la autofagia (tales como ATG5 o Atg7 mutantes de ratn), as como en Atg7 deficiente en Drosophila, se plantea la cuestin de si la autofagia per se o slo una parte de la va de la autofagia est involucrado en la muerte celular de tipo II durante el desarrollo. La autofagia podra contribuir a la muerte celular que es inducido por virus. Virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) induce la acumulacin de beclin1 de protena y de la muerte celular en clulas T CD4 + no infectadas espectador cuando la protena VIH1 envoltura (Env) interacta con el receptor de quimiocinas CXCR4. Aunque el mecanismo por el cual la autofagia se activa por Env an no est claro, este resultado sugiere que la autofagia podra contribuir a la muerte celular de una manera no-autnomo de la clula, proporcionando un mecanismo por el cual un virus podra inducir la muerte celular independiente de la replicacin viral. La autofagia puede asumir el papel de asesino en la apoptosis no est disponible. Por ejemplo, la autofagia media la muerte celular en la apoptosis deficiente en BAX-/ - BAK-/ - clulas en respuesta a estmulos de estrs genotxicos o ER. Es posible que se induce la autofagia, aunque a niveles bajos, en condiciones normales, pero que se convierte en exacerba en respuesta a estrs celular durante las condiciones de la apoptosis-deficientes para promover la muerte celular. En este sentido, es interesante observar que beclin-1 - el homlogo de mamfero de la levadura Atg6 y un regulador del tipo III fosfatidilinositol 3-quinasa Vps34 - tiene un dominio BH3 e interacta con BCL2, que refleja la regulacin de la apoptosis y convergente celular por autofagia death55. Por otra parte, un subconjunto de BH3-slo los miembros de la familia BCL2 pro-apoptticos, incluyendo BNIP3 y BIK, puede inducir

la activacin de la muerte celular por autofagia. Aunque el mecanismo por el cual BNIP3 y BIK inducen la autofagia no est claro, y aunque queda por ver si la autofagia se induce como una consecuencia secundaria de dao mitocondrial, tales estudios plantean la posibilidad de que la muerte celular por autofagia podra ser inducido en una manera similar a que de la apoptosis.

Necroptosis como una forma de necrosis regulado. Necroptosis (Recuadro 2), lo que representa un

tipo de necrosis programada, es otro ejemplo interesante de un mecanismo de muerte celular nonapoptotic regulado. Su descubrimiento se debi a las observaciones que los estmulos apoptticos clsicos, como la participacin de muerte-domain-receptor por ligandos correspondientes, pueden llevar a la muerte de clulas no apoptticas (evaluada utilizando criterios morfolgicos) cuando apoptosis es inhibida por los inhibidores de caspasas oa travs de mutaciones en la caspasa -8 o protena muerte de dominio asociado a Fas (FADD). Aunque necroptosis es activada por los mismos estmulos que inician la apoptosis, las caractersticas morfolgicas de necroptosis - orgnulo hinchazn, rpido disfuncin mitocondrial permeabilizacin de la membrana plasmtica y la falta de fragmentacin nuclear - son caractersticas de necrosis patolgica, la cual se presume que la muerte no regulada que se produce por el estrs abrumador. Nuevas evidencias sugieren que la iniciacin del programa de necroptotic por TNFa se produce a nivel del receptor a travs del reclutamiento y la activacin de un complejo de sealizacin intracelular que implica la molcula adaptadora RIP1 (pero no el complejo TRADD-RIP1, que media en la activacin del factor nuclear kappa B (NF-kB) y la apoptosis). La activacin de la necroptosis requiere la actividad de la quinasa de RIP1, que no se requiere para la NF-kappa B y la apoptosis de sealizacin. La naturaleza diferente de la apoptosis y la necroptosis Se destac adems por el descubrimiento, en una pantalla basada en clulas al azar, de una serie de estructuralmente distintas de molculas pequeas necrostatins, todos los cuales inhiben especficamente y de manera eficiente necroptosis, pero no la apoptosis inducida por TNFa. El mecanismo que conduce a la ejecucin de aguas abajo necroptosis de RIP1 activacin de la quinasa sigue siendo poco clara. RIP1 se transloca dentro de la mitocondria, lo que conduce a la interrupcin de la asociacin de ADP-ATP translocasa (ANT) con ciclofilina D y esto podra explicar la disfuncin mitocondrial rpida que se asocia con la necroptosis. Curiosamente, el efecto protector del inhibidor de la necroptosis necrostatin-1 en un corazn in vivo de lesin de isquemia-reperfusin era dependiente de la expresin de ciclofilina D. Sin embargo, los detalles de la mecnica de este paso no se haban determinado.

La muerte necrtica PARP1 mediada. PARP1 es una enzima nuclear que tiene un papel clave en el

mantenimiento de la estabilidad del genoma. PARP1 se activa rpidamente por roturas de ADN de cadena y recluta factores de reparacin del ADN por unir unidades ADP-ribosa a protenas asociadas a la cromatina. La prdida de PARP1 conduce a un aumento de la sensibilidad al dao del ADN, lo que llev al desarrollo de inhibidores de PARP1 como chemopotentiators de agentes contra el cncer que daan el ADN. Sin embargo, el exceso de activacin de PARP1 puede conducir a la muerte celular independiente de caspasas. PARP1 puede mediar la muerte celular en una serie de escenarios diferentes (recuadro 2). En un escenario, alquilacin de dao en el ADN promueve el rpido agotamiento PARP1 mediada citoslica de NAD +, que conduce a la muerte necrtica por "colapso energa 'en las clulas glucolticas (estas clulas dependen de citoslica NAD + para la gluclisis y la generacin de energa). Este mecanismo puede ser visto como una extensin de la funcin del genoma de vigilancia de PARP1, ya que proporciona una forma elegante para regular diferencialmente las respuestas de dao de ADN en clulas que proliferan rpidamente glucolticas y en las clulas en un estado vegetativo, basndose en la respiracin mitocondrial para el mantenimiento de ATP niveles. Clulas que proliferan rpidamente glicolticas pueden representar un peligro significativo para el organismo si se acumulan dao en el ADN y, por lo tanto, tienen que ser eliminados de manera eficiente, por el contrario, las clulas vegetativas se puede permitir ms tiempo para completar la reparacin del ADN. A lo largo de estas lneas, PARP1 activacin tambin conduce a la liberacin

especfica de la citoquina inflamatoria grupo de alta movilidad de protena-B1 (HMGB1), que puede alertar a las clulas inmunes a la presencia de clulas peligrosas con DNA77 daado.PARP1 tambin media la muerte celular que es inducida por dao en el ADN secundario asociado con la lesin neuronal aguda. En este caso, la muerte de las clulas neuronales excitatorios conduce a la translocacin de la poli (ADP-ribosa)-polmero en el citosol, lo que provoc la translocacin del factor de apoptosisinducing protena (AIF) de las mitocondrias a los ncleos, en donde media la muerte celular. Curiosamente, el dao de ADN inducida por la muerte celular mediada por PARP1 implica receptor de TNF-factor asociado-2 (TRAF2) - activacin RIP1-dependiente de c-Jun N-terminal quinasa-1 (JNK1, tambin conocido como MAPK8), lo que contribuye a La disfuncin mitocondrial y la muerte necrtica. Sin embargo, la relacin entre este proceso y necroptosis sigue siendo poco clara. En la actualidad, es difcil llegar a conclusiones definitivas sobre la relacin de las dos vas de la muerte celular inducida por PARP1. Sin embargo, parece posible que el agotamiento de NAD + y FIA actividad actuando en la misma va y que sus contribuciones relativas a la desaparicin de clulas podran depender del entorno especfico de la clula. Aunque los detalles de la muerte celular PARP1 dependiente an no se han clasificado, est claro que la muerte celular mediada por PARP1 es un tema importante para la investigacin debido a su papel en diversas patologas humanas (Cuadro 3). Las races de la muerte celular regulada Curiosamente, a pesar de que el fenmeno de la apoptosis fue descrita por primera vez en el contexto de la regulacin del desarrollo, la funcin de la apoptosis en el desarrollo no es tajante; C.elegans ced3 (prdida de funcin) o ced-4 (prdidas offunction) mutantes son el desarrollo normal81. Si PCD no proporciona una ventaja evolutiva para los nematodos que lo han comparado con las variantes antiguas que carecan de ella, qu factores podran haber llevado a la seleccin y la evolucin de los mecanismos de PCD? Curiosamente, se encontr que los mutantes ced-3 y ced-4 a ser significativamente ms sensibles a la muerte causada por la infeccin de Salmonella typhimurium en comparacin con los gusanos de tipo salvaje, aumentando la posibilidad de que la respuesta de defensa del husped, en lugar de la muerte celular de desarrollo, podra ser la primordial funcin de la apoptosis. La funcin de defensa del husped de la apoptosis ha sido ampliado en clulas de mamfero. Protenas de una gran familia de NLR mamferos (NOD-like receptor), homlogas a C. elegans CED-4 y de mamferos APAF1, la funcin de regular la activacin de las caspasas en respuesta a los patgenos intracelulares. NLRs contienen tres dominios distintos: un dominio de reclutamiento de caspasas-N-terminal (CARD) o pirina dominio efector (con la excepcin de la protena inhibidora de la apoptosis-neuronal (NAIP) y, posiblemente, NOD5 (tambin conocido como NLRX1)); un nucleotidebinding y oligomerizacin de dominio (el llamado NACHT dominio), y un nmero variable de C-terminal repite Leu-ricos (LRR s) (Cuadro 1). Los 22 NLRs identificados se pueden dividir en dos grandes sub-clases - los NODs (NOD1-5), que activan la va RIP2-NF-kappa B, y los NLRs, que consta de NALP1-14 (NALP se nombra despus de Nacht-, LRR - y el dominio pirina (PYD)-que contiene protenas), IPAF (tambin conocido como NLRC4) y NAIP, que promueven la activacin de la caspasa-1. Adems, la protena NLR CIITA (complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II trans-activador) sirve la funcin de regulador maestro de la transcripcin de MHC de clase II. Al menos algunos de la funcin NALPs mediante el reclutamiento de la protena adaptador de ASC a travs de una interaccin PYDPYD homotipica, y ASC a su vez recluta la caspasa-1 a travs de una interaccin-TARJETA TARJETA. La oligomerizacin de NALPs trae las caspasas inflamatorias, tales como la caspasa-1 y la caspasa-5, en estrecha proximidad para promover su activacin. Este complejo de protenas NALP se llama la inflamasoma. La activacin de la caspasa-1 a su vez conduce a la transformacin y la liberacin de interleuquina-1 (IL-1) y la IL-18, que sirven funciones pro-inflamatorias importantes. El NALP1 mediada por la activacin de la caspasa-1 tambin est regulada por las protenas anti-apoptticos de la familia BCL2, proporcionando un posible papel de las protenas de la familia BCL2 en la regulacin de la respuesta de defensa del husped. Curiosamente, los orgenes de la familia NLR se remontan a los reguladores no apoptticas en organismos simples, lo que podra

proporcionar una visin interesante sobre los orgenes evolutivos de apoptosis de mamfero. NLRs de mamfero funcional y estructuralmente se asemejan a las protenas NLR-como, tales como las protenas R-codificados por genes de plantas, que estn presentes en muchos organismos primitivos (figura 2). Las protenasR-codificados por genes contienen LRR, que detectan patgenos intracelulares y las seales de peligro de patgenos inducida y activan la sealizacin inflamatoria. De una manera que es muy anloga a la del sistema inmune innato de la planta, inflamosomas de mamferos reconocen seales que se presentan por patgenos intracelulares y median en la activacin de la muerte en las clulas infectadas (tales como macrfagos) a travs de la apoptosis de la caspasa-1-dependiente (pyroptosis) y la induccin de la sealizacin inflamatoria a travs de procesamiento de la caspasa-1dependiente de la IL-1, IL-18 y, probablemente, IL-33. Similar a cientos de protenas-R codificados por genes de plantas, mamferos distintos complejos inflamasoma sentido particular patrones moleculares asociados a patgenos (PAMPs conservadas, que incluyen componentes de la pared celular bacteriana, la flagelina bacteriana, y ARN bacteriano y viral) y el peligro de patgenos inducida asociados a patrones moleculares (apaga, que incluyen cambios en los niveles de ATP y concentraciones de potasio intracelular). Por ejemplo, los sentidos NALP1 inflamasoma bacterianas peptidoglicanos de la pared celular, mientras que el IPAF inflamasoma se activa por citoslica flagelina. Adems, estudios recientes demostraron que las protenas R-codificados por genes de plantas pueden detectar PAMP en los ncleos para inducir cambios transcripcionales que promueven una respuesta inmune. Es importante determinar si esto tambin puede representar un modo adicional de accin de NLRs mamferos. Curiously, whereas the plant innate immune response can lead to cell death at the infection site, involving measurable induction of caspase-like activity, it is carried out by non-caspase molecules, such as legumains. Plant proteins displaying sequence homology and structure similarity to caspases, termed metacaspases, probably represent a different branch of the evolutionary tree. Based on these observations, the mammalian inflammasome might be a convergence point between a simple ced -gene-mediated apoptotic pathway and the NLR-mediated innate immune pathway, providing capabilities for PAMP or DAMP sensing by NLRs, as well as caspase activation. Therefore, the mammalian apoptotic machinery might have evolved by converging the simple apoptotic machinery, such as that found in C. elegans , with a separate and even more ancient and highly conserved innate immune system. Furthermore, because mammalian CED-4-like factors (such as NLRs, APAF1 and p53induced protein with a death domain ( PIDD )) function similarly in caspase activation, development of the mammalian apoptosis machinery might have been primarily driven by the requirements for a more efficient host defence system, rather than the more complex homeostatic and developmental regulation in higher eukaryotes. Although retaining the basic layout of the PCD mechanism in C. elegans , the convergence of this pathway with NLR regulation led to the acquisition of a number of unique features that are characteristic of mammalian apoptosis, including direct regulation of the mammalian CED-4 orthologues by specific activators (such as cytochrome c , ATP and pathogens) and divergence of the developmental, genotoxic and inflammatory pathways, which are regulated by separate sets of activating complexes (the apoptosome, PIDDosome and inflammasome, respectively) (BOX 1). Evolution of non-apoptotic cell death mechanisms Whereas PARP1-mediated non-apoptotic cell death probably evolved as part of the cellular response to DNA damage, other non-apoptotic cell death mechanisms might have evolved as a part of host defence responses. Autophagy has a well-established role in defending against viral and bacterial invasion. Sindbis virus, a single-stranded RNA virus of the Togavirus family, causes encephalitis, which can be ameliorated by overexpression of Beclin-1 in transgenic mice. Bacteria that escape into the cytosol from the endosomes can be engulfed by macroautophagy. Furthermore, autophagic machinery promotes the clearance of extracellular bacteria that are recognized by the TLR4 receptor. One could speculate that autophagic cell death might have arisen from the need to ensure the survival of the whole organism through sacrificing infected cells. Both type I and II interferons

(IFNs) modulate macroautophagy as a part of the antiviral response. In this regard, it is interesting that treatment of human HeLa cells with IFN leads to the induction of autophagy through the activation of death-associated protein ( DAP ) kinases, and overactivation of DAP kinases can lead to autophagic cell death. Thus, autophagic cell death might be part of the antiviral response that is activated by IFNs. The functional significance of necroptosis in the host defence response is less clear. However, RIP1, a kinase that is crucially involved in the activation of necroptosis, has an important role mediating the activation of NF- Band IFN genes in the context of the innate immune system, although apparently in a kinase-independent manner. RIP1 signalling can be triggered by extracellular pathogen-sensing Toll-like receptors, components of invading pathogens and inflammatory cytokines, such as TNF. The closest D. melanogaster homologue of RIP1, IMD, is also a key mediator of the innate immune response to Gram-negative bacteria, acting upstream of a number of factors that are also linked to RIP1 signalling in mammalian cells, including the D. melanogaster homologues of FADD, caspase-8, IKK (inhibitor of nuclear factor (NF)-B (IB) kinase) complex and NF-B. Furthermore, IMD can also mediate caspasedependent apoptosis, similar to the recently discovered RIP1-dependent, caspase-8-mediated apoptosis cascade in mammalian cells. Curiously, IMD lacks a kinase domain, so kinasedependent induction of necroptosis might be an evolutionarily novel addition to the repertoire of RIP1 functions. Therefore, RIP1 might promote both the induction of specific inflammatory signalling (by NF-B and IFN upregulation) and the elimination of infected cells through a pro-inflammatory process (necrosis). The promotion of necrosis can by itself serve to potentiate the antibacterial response by causing a leakage of cellular contents and the specific release of pro-inflammatory mediators, such as IL-6. Recently discovered cell-deathindependent activation of autophagy by TLR4RIP1 as a potential mechanism for bacterial clearance also fits well with this notion. These data suggest that the evolution of the innate immune response might have led to the acquisition of the RIP1-kinase-mediated necroptotic response by the IMD pathway. Opportunities for cytoprotective therapy Catastrophic cell death is the main underlying cause of death and lifelong disabilities in a broad range of human diseases, from acute disorders (such as stroke, myocardial infarction, brain and spinal cord trauma and septic shock) to chronic neurodegenerative conditions. Cell death is also an important compounding factor as a side effect of chemotherapy, many inflammatory diseases, diabetes and other conditions. Therefore, the development of efficient strategies to inhibit pathological cell death remains a key challenge of cell death research and a crucial unmet medical need. The discovery of apoptosis and the development of specific genetic and small molecule methods to inhibit pathological apoptosis in vivo have shown that pathological cell death can, indeed, be targeted for therapeutic benefit. However, the success of anti-apoptotic therapies has been limited, perhaps because of our lack of understanding of the complexity of cell death regulation in mammalian cells. The appreciation of such complexity leads us to suggest that when considering the possibility of inhibiting a specific pathological mechanism of cell death, we must consider several issues. Does one particular form of cell death have a major role in the injury (FIG. 3)? Alternatively, are several cell death mechanisms operational in the injured tissue? If several mechanisms are operational, then combination therapy might provide maximal benefit. Whether a combination therapy will be effective depends on the contribution of each form of death, not only to the tissue injury, but also to the functional decline of the tissue (FIG. 3c). We must also consider whether a possible backup cell death mechanism that might be activated in the event of the primary mechanism is being inhibited. Given these possibilities, cytoprotective treatment might not only be improved by combination treatment, it might require combination treatment (FIG. 3d). It is important to keep in mind that although apoptosis may be the preferred type of physiological cell death, the option to die by apoptosis might not always be available under in vivo conditions. Situations that involve an imbalance of RO Sgeneration and RO S-detoxification, limited energy metabolism or a lack of proper protein synthesis

might restrict the ability of cells to activate apoptotic cell death. Under such circumstances, cells might choose to die through one of the alternative cell death pathways. The existence of other cell death options suggests that there might be some plasticity in the choice of cell death programmes, with apoptosis being only one of the spectrum of available regulated cell death options. Furthermore, rather than considering a hierarchal regulation of multiple cell death mechanisms, in which cells first activate apoptosis and only undergo non-apoptotic cell death if apoptosis is inhibited, we propose that commitment to apoptosis might not even be necessary for the activation of non-apoptotic cell demise. In other words, non-apoptotic signalling can be initiated independently through alternative mechanisms to carry out the order of cellular execution under conditions that are ill-suited for apoptosis, but ideal for non-apoptotic cell death (FIG. 4). The discovery of the apoptotic programme opened the door for the development of specific cell-death-targeting 'smart' therapies. Pathological cell death processes might represent a 'conscious' decision of the cell in response to specific pathological signals, which would allow the development of specific approaches to influence this 'choice' by small molecule or protein-based agents that could target the apoptotic signalling machinery. This has already led to the development of multiple classes of agent, such as BCL2 and inhibitor of apoptosis (IAP) proteins, that specifically trigger apoptosis in cancer cells. Although these agents are still in the early stages of clinical development, preliminary evidence is promising. At the same time, therapies to eliminate catastrophic tissue damage and functional decline, which are associated with pathological cell death in various human pathologies (from stroke to myocardial infarction), are still limited. The recent discovery of regulated nonapoptotic cell death might offer a new hope for treating these diseases. Although the study of these forms of cell death is still in its infancy, a number of promising results have already been generated (BOX 3). Conclusin Less than 2 decades ago, cell death was categorically considered to be passive and uninteresting. The discovery of mammalian homologues of C. elegans cell death genes led to the understanding that cell death, in the form of apoptosis, can be a highly regulated cellular mechanism. In-depth characterization of mammalian apoptosis uncovered both conservation of the basic layout of apoptotic signalling in C. elegans and evolutionary expansion of the protein families of apoptotic regulators. Moreover, these features allowed specialized activation of cell death responses by various upstream stimuli, improved integration of apoptosis with other cellular signalling and metabolic pathways, and increased fidelity of apoptosis execution, due to the redundancy in the functions of individual members of apoptosis regulatory families. Recent characterization of the inflammasome pathway of caspase-1 activation revealed that the evolution of mammalian apoptosis probably involved convergence of the primitive apoptosis machinery with the innate immune system. In the past few years we have also begun to appreciate that apoptosis is not the only form of regulated cell death. Three of the best-understood examples of non-apoptotic cell death are type II cell death, necroptosis and PARP1- mediated necrotic death (see above). Although these processes can serve functions that are complimentary or reinforce apoptosis, it is likely that they have evolved to serve specific non-redundant functions in responses to pathogen infection, nutrient and energy deprivation, and DNA damage. The changing perception of regulated cell death as an array of diverse responses, rather than a single apoptotic pathway, implicates complexity and provides novel opportunities for cytoprotective therapies. In particular, the discovery of the specific regulated, morphologically necrotic, non-apoptotic cell death mechanisms suggests that at least a subset of necrotic pathological cell death might also be regulated by cellular mechanisms and, therefore, could be amendable to therapeutic drug development. Understanding how cell death operates under the specific conditions of particular human diseases might bring in a new era of cytoprotective drug development.

Figure 1 | Evolutionary expansion of C. elegans apoptotic machinery in mammalian cells. Side-by-side comparison of the Caenorhabditis elegans CED protein pathway and the core apoptotic machinery in mammalian cells shows the conservation of the general outline of the pathway. Extension of the apoptotic machinery can also be observed at every step of the pathway, including multiple B-cell lymphoma protein-2 (BCL2) homology-3 (BH3)-onlyprotein activating signals, complex regulation of the BCL2 family and the addition of mitochondrial cytochrome c release, which drives the formation of an apoptosome and activation of the upstream caspases (first caspase-9 and then the executioner caspases, such as caspase-3 and caspase-7). Added complexity is provided by the existence of multiple family members in each class of the apoptotic regulators, with both redundant and non-redundant functions. These regulators provide 'fail-safe' apoptosis machinery that can generate specialized responses to various upstream stimuli. Possible direct activation of BAX and BAK by BH3-only proteins is indicated by a dotted line. APAF1, apoptotic protease-activating factor-1; BAK, BCL2antagonist/killer-1; BAX, BCL2-associated X protein. Box 1 | Major classes of apoptosis mediators Caspases Caspases are a family of Cys proteases (humans have 11 caspases) that cleave their substrates after Asp residues. Caspases contain three main domains: a prodomain and large (p20) and small (p10) catalytic subunits. The large domain contains the active site Cys residue. Activation of caspases involves the proteolytic cleavage of zymogens, the removal of the prodomain and separation of the p20 and p10 subunits, or allosteric conformational changes. The prodomains of activator and inflammatory caspases contain proteinprotein-interaction domains (such as the caspaserecruitment domain (CARD) and the death-effector domain (DED)) that link them to apoptosis signalling molecules21. BCL 2 family The B-cell lymphoma protein-2 (BCL2) family is subdivided into three subclasses: anti-apoptotic (such as BCL2, BCL-XL and MCL1), multidomain pro-apoptotic (BAX and

BAK) and BH3-only (such as BID, BIM, BAD, NOXA and PUMA). The BH1, BH2 and BH3 domains of multidomain family members form a hydrophobic cleft that serves as a heterodimerization interface for the BH3 domains of BH3-only proteins. The BH4 domain of anti-apoptotic BCL2 family members directly interacts with a voltagedependent anion channel and inhibits apoptotic mitochondrial changes113. Anti-apoptotic BCL2 family members can be cleaved by caspases, which results in the loss of the BH4 domain and in the proteins exhibiting pro-apoptotic, rather than anti-apoptotic, activity114. BH1/BH2/BH3, BCL2 homology-1/2/3 domain; TM, transmembrane domain. APAF1, NLR and PIDD adaptors NLR (nucleotide-binding and oligomerization domain (NOD)-like receptor), APAF1 (apoptotic protease-activating factor-1) and PIDD (p53-induced protein with a death domain) activate caspases following pathogenic infection (caspase-1), cytochrome c release (caspase-9) and genotoxic stress (caspase-2), respectively. The NLR family (22 proteins in humans) can be subdivided into NOD factors (which sense bacterial peptidoglycans and signal through RIP2 to activate NF-B), inflammasome-forming NALPs, IPAF, NAIP and CIITA (which regulates major histocompatibility (MHC) class II transcription). Activation of APAF1, NLRs and PIDD proteins leads to the formation of large multimeric caspase-activating complexes 115,116. Caspase recruitment can be direct (through CARD domains) or can involve additional adaptors (such as RAIDD (also known as CRADD) interacting with the death-domain (DD) of PIDD116). The nucleotide-binding and oligomerization domain (the NACHT domain) and NB-ARC domains are required for oligomerization. The NB - ARC domain of APAF1 also binds to dATP, which is required for apoptosome formation. The WD - 40 repeats of APAF1 bind cytochrome c . The Leu-rich repeats (LRRs) of NLRs probably have a key role in sensing pathogen-associated molecular patterns83. CIITA, major histocompatibility complex (MHC) class II trans-activator; IPAF, ICE-protease activating factor; NAIP, neuronal apoptosis-inhibitory protein; NALP, NACHT - , LRR- and pyrin domain (PYD)-containing proteins; NFB, nuclear factor-B. Box 2 | Three pathways of non-apoptotic cell death

Autophagic cell death. Eighteen yeast autophagy-related ( ATG ) genes, which are required for autophagosome (AP) formation, have been identified (APAtg proteins). Several mammalian homologues have been identified (shown in figure panel a ). The activity of the class III phosphatidylinositol 3-kinase complex is subject to inhibition by B-cell lymphoma protein-2 (BCL2) and to activation by the tumour suppressor UVRAG (UV radiation resistance-associated gene protein). Nutrient-deprivation signalling induces autophagy through the suppression of mammalian target of rapamycin (mTOR) activity. Functional analysis has implicated the same core ATG proteins in the

formation of different types of autophagosomes, including those that have pro-death roles118. The molecular machinery of mammalian autophagosomes is still only partially characterized. Intrinsic differences in the composition of autophagosome protein machinery might determine its function as a pro-survival mechanism, rather than a pro-death mechanism. PAS, phagophore assembly site. See REF. 117 for further details. This panel is modified, with permission, from ref. 117 (2007) Cold Spring Harbor Laboratory Press. Necroptosis. The activation of RIP1 kinase increases reactive oxygen species (ROS) production (from the mitochondrial respiratory chain and the RIP1Rac1 NADPH oxidase complex) and activates c-Jun N-terminal kinase (JNK) kinase (which might be crucial for the execution of necroptotic cell death in some cell types). Autophagy can be prominently activated during necroptosis, but it only appears to contribute to cell death in some cell types. Other execution steps, including the activation of phospholipase A2, lipoxygenases and acid sphingomyelinase, have been described. The exact roles of these steps remain to be elucidated. Given the similarity of many of the downstream execution steps in necroptosis to those attributed to 'classic' unregulated necrosis, the main difference between these two mechanisms might be in the method of activation (regulated by internal signalling mechanisms rather than caused by overwhelming stress) of similar relatively nonspecific execution events. SMase, sphingomyelinase; TNF, tumour-necrosis factor-; TNFR, TNF receptor. PARP1-mediated cell death. Two pathways are shown: energy collapse and apoptosis-inducing factor (AIF) translocation. In addition to the cell death role, poly(ADPribose) polymerase - 1 (PARP1) is involved in initiating DNA repair. Genetic deletion of PARP1 leads to sensitivity to DNA-damaging agents. Oxidoreductase activity of AIF also has a homeostatic role, as it is crucial for mitochondrial complex I function124 and a mutation in mice that is associated with severe progressive neurodegeneration has been mapped to AIF 124. TRAF2, TNF receptor-associated factor-2. Box 3 | The contribution of non-apoptotic cell death to pathological injury Recent studies have shown that non-apoptotic cell death is not just a nuisance of in vitro experimentation it makes important contributions to pathological regulation in vivo . Autophagy has been prominently observed in various disease models and its inhibition can provide therapeutic benefit. For example, recent studies suggest that Beclin-1-dependent autophagy promotes injury in mouse models of heart ischaemia reperfusion injury and heart failure. In addition, autophagy suppresses apoptosis in MYC-dependent lymphomas, promoting tumour growth. Conversely, genetic analysis has clearly established that Beclin-1 functions as a tumour suppressor. Autophagy promotes the survival of cancer cells that express apoptosis-inhibiting BCL2 family members under the conditions of hypoxia. However, inhibiting autophagy under such conditions unleashes necrosis, which might promote inflammation and, ultimately, tumorigenesis. These data suggest a complex role of autophagy in tumour formation. As the morphology of necroptotic cell death is similar to that of necrosis, it has been investigated whether pathological necrosis might actually represent, if only in part, regulated necroptosis. Indeed, administration of necroptosis inhibitor necrostastin - 1 (Nec - 1) provides significant tissue protection and functional improvements in a range of acute tissue injuries in vivo in mouse models (brain and heart ischaemiareperfusion) by mechanisms that are clearly distinct from the inhibition of pathological apoptosis. In particular, in a mouse model of stroke, the effect of Nec - 1 was both temporally and mechanistically (measured through caspase - 3 activation) distinct from that of apoptosis inhibitors. Furthermore, the protective effect of Nec - 1 did not require co-administration of caspase inhibitors, although the pan-caspase inhibitor zVAD. fmk and Nec - 1 did have an additive effect (FIG. 3). Poly(ADPribose) polymerase - 1 (PARP1) inhibitors provide significant protective effects in mouse brain and heart ischaemiareperfusion injury, mouse models of colitis and other inflammatory diseases, neurodegeneration and diabetes mellitus (reviewed in Refs 131133). PARP1 inhibitors have also emerged as promising anti-cancer agents, increasing the sensitivity of resistant cancer cells to various DNA-damaging agents and also selectively killing some tumour cells.

Figure 2 | Mammalian NLR proteins and NB - LRR proteins from simpler organisms have similar functions. Although NLR (panel a ) and NB - LRR (panel b ) proteins (such as those encoded by plant R-genes) have variable domain architecture83,89,90, all NLR and NB - LRR proteins are characterized by the presence of: Leu-rich repeats (LRR), which have significant variability (because of alternative splicing136) and are involved in pathogenassociated molecular pattern (PAMP) sensing; nucleotide-binding ATPase oligomerization domains (NACHT or NB; these make-up the 'oligomerization domain'); and effector domains (CARD and pyrin in NLRs; TIR and coiled coil (CC) in NB -LRRs), which are involved in the recruitment of downstream factors, such as caspase - 1 or RIP2 in the case of IPAF and NOD proteins, or additional adaptors, such as ASC, in the case of NALP3 protein83. The mammalian NLRs (panel a ) also display multiple functional similarities with NB - LRRs (panel b ) in that they function as part of the innate immune response. Other similarities include: NLRs and NB - LRRs both require SGT1HSP90 binding to maintain the proteins in an inactive, but signalcompetent state; they are both activated by PAMPs and danger-associated molecular patterns (DAMPs) in vivo and in vitro; and their cell death and inflammatory responses are activated through effector domains. These similarities suggest that mammalian NLR proteins (and other APAF1-like molecules, such as APAF1 and PIDD) probably evolved from primitive NB - LRR proteins. ASC, apoptotic speck protein; IPAF, ICEprotease activating factor; NB-LRR, nucleotide-binding Leu-rich-repeat; NLR, nucleotide-binding and oligomerization domain (NOD)-like receptor; NALP3, NACHT - , LRR- and pyrin domain (PYD)containing protein-3; TIR, translocated intimin receptor. Figure 3 | Plasticity activation in vivo. of cell death

The existence of multiple cell death mechanisms suggests that careful consideration should be given to determine which mechanism (or mechanisms) is primarily activated in any particular injury paradigm if therapeutic approaches are to prove useful. As an example, multiple outcomes of anti-apoptotic or antinecroptotic therapies can be anticipated depending on the specific injury

paradigm. a | Predominant necrotic death might occur when the endogenous conditions prohibit apoptosis. Use of necrostatin - 1 (Nec-1), which inhibits RIP1-dependent necroptosis, might provide maximal cytoprotective benefit as a single agent under these circumstances. b | Alternatively, apoptotic cell death might be predominant in cell populations that are not subjected to excessive external stress, or that are intrinsically deficient in necroptosis activation58,63. zVAD.fmk prevents apoptosis by inhibiting caspases. c | A mixture of apoptotic and necroptotic cell death might occur, leading to a significant, but partial, cytoprotective effect of each treatment and an additive effect of combination therapy. d | Apoptosis might be the predominant 'primary' form of cell death. However, inhibition of apoptosis might result in the activation of necroptosis. In this scenario, neither apoptosis nor necroptosis inhibitors might work as single agents, and combined treatment could provide maximal cytoprotective benefit. Figure 4 | Activation of alternative cell fates following TNF stimulation.

In many cell types, apoptosis is not the default response to tumour-necrosis factor - (TNF) stimulation multiple cell fates can be independently adopted. a | In many cases, activation of nuclear factor-B (NF - B) signalling, resulting from NF - B-activating complex I formation and RIP1 polyubiquitylation136, is a primary response to TNF. In this scenario, RIP1 ubiquitylation limits the formation of pro-apoptotic signalling complexes137. In addition, NF-B transcriptionally upregulates the expression of pro-survival genes137. The low level of caspase - 8 cleaves RIP1, which inhibits necroptosis. b | Activation of apoptosis as a primary response to TNF requires specific apoptosis-promoting conditions, such as the presence of protein synthesis inhibitors (cycloheximide), the overexpression of zinc finger-like protein (ZFRA) polypeptide138 or a deficiency in focal adhesion kinase (FAK) kinase signalling139. This leads to efficient pro-apoptotic death-inducingsignalling complex (DISC) formation136 and caspase - 8 activation. c | Activation of necroptosis as a primary response to TNF requires suppression of apoptotic signalling or, at least, caspase activity (by caspase inhibitors). Rapid loss of ATP140143, conditions of excessive reactive oxygen or nitrogen species production144 or ischaemic conditions63,130 can provide environments that are nonpermissive to apoptosis. Notably, all three of these pathways represent independent cell fates that are selected on the basis of the specifics of the cellular regulation. IKK, inhibitor of NF-B (IB) kinase; NIK, NF-B-inducing kinase; RIP1, receptor-interacting protein-1; TRADD, TNF receptor type 1-associated death domain protein; TRAF2, TNF receptor-associated factor-2; Ub, ubiquitin.