Tema 7: 7.1.-Proceso de maduracin de los ARN ribosmicos y de transferencia. 7.2.-Concepto de intrn y exn. Intrones autocatalticos.

7.1.-Proceso de maduracin de los ARN ribosmicos y de transferencia.

TIPOS de CAMBIOS que SUFREN los TRANSCRITOS PRIMARIOS DURANTE la MADURACIN

1.- Roturas nucleotdicas para: a-liberar los precursores a partir de transcritos primarios ms grandes y b- eliminar nucletidos de los extremos 5 - y 3 -. 2.- Adicin de nucletidos en los extremos 5 - y 3 -. 3.- Modificacin de bases y nucletidos. 4.- Corte y empalme. Las modificaciones en el ARNr tanto en procariotas como eucariotas consisten mayoritariamente en la metilacin de nucletidos y la eliminacin de secuencias 5 - y 3 - sobrantes hasta alcanzar el tamao adecuado.

Procesamiento del ARNr en E. coli

En E. coli hay 7 operones que codifican para ARNr con algunos ARNt.
ESQUEMA GENERAL DE PROCESAMIENTO POR NUCLEASAS

Destacamos dos RNasas: RNasa III que libera los precursores de los RNA 16S y 23S y que fue la primera RNasa descrita capaz de digerir RNA de doble cadena; Y RNasa P genera los extremos 5 - de los ARNt y es una ribonucleoprotena formada por un RNA de 377 nucletidos (~125 kDa de PM) y una protena pequea de ~20kDa. El RNA es el catalizador, es una RIBOZIMA.

7.1.-Proceso de maduracin de los ARN ribosmicos y de transferencia.

RNasa III
RNAr 16S ~ 1600 NT
UAG C C C-G U-A C-G G-U C-G U-G G-C G-C A-U A-U C U C A G-U A-U U-A A-U G-C U-A G-C A-U G-U G-C C-G A-U U-A A G-C A-U A-U G-U C-G C U-A C-G A-U C-G G-C G-U G-U U-G G-C U-A G-C U-A C-G U-A A-U G-C A-U C-G A-U G-C U-A U-S G-U U-G U-A U-A

RNAr 23S ~ 2900 NT

U A U G A

RNasa III RNasa III

RNAm 0.3

RNAm 0.7

G-C A-U A-U U-A U-A G-C A-U G-U U-A G-C U-A U-A G-C G G-C G-C C-G U-A C-G C-G A-U C-G A-U A-U A-U G-U

RNasa III RNasa III

RNasa III

Ribonucleasa III se gua para cortar los precursores de los ARNr por las estructuras secundarias que se forman. Figura de la izquierda, muestra uno de los sitios de corte para RNasa III (hay 4 en total) del ARNm temprano del fago T7 (~7000nt). Este transcrito primario da origen 6 ARNms (4 ARNm monocistrnicos y 1 bicistrnico). Aqu se muestra el sitio de corte de RNasa III que da origen a los ARNm denominados 0.3 y 0.7. Figuras de la derecha horquillas de los RNAr 23 y 16 S de E. coli. No hay homologa de secuencia entre los sitios de corte de la RNasa III.

Procesamiento del ARNr en E. coli

METILACIN NUCLEOTIDOS

Los transcritos primarios de RNAr tambin se metilan, fundamentalmente en las secuencias de los ARNr 16S y 23S. Los enzimas implicados son metiltransferasas dependientes de SAM. Se metilan la ribosa en posicin 2 OH y la adenina en posicin N6 (dimetil normalmente).

H3C

7.1.-Proceso de maduracin de los ARN ribosmicos y de transferencia.

Resumen del procesamiento del ARNr en bacteria. 1.-antes de cortarse, el precursor RNA se metila en bases especificas. 2.-por rotura se liberan los pre-rRNAs y pre-tRNA(s). Sitios de corte de RNase III (1), RNase P (2), and RNase E(3). Los productos finales ARNr 16S, 23S, y 5S se generan por la accin de otras nucleasas. Las 7copias del pre-rRNA de E. coli difieren en el nmero, localizacin e identidad de los tRNAs que incluyen. LEHNINGER.

Procesamiento del ARNt en E. coli

E. coli adems de los operones descritos que contienen ARNr y ARNt hay ~60 genes que codifican para ARNt (1-7 molculas de ARNt cada gen).

PPP

RNasa P genera los extremos 5 de los ARNt

ARNt NUCLEOTIDILTRANSFERASA Se encarga de mantener el CCA 3 -OH

RNasa P
PPP P

RNasa P
P

Una endonucleasa rompe en 3 - y la exonucleasa D general el 3 -OH

Endonucleasa
PPP P OH OH P

RNasa D

RNasa D

7.1.-Proceso de maduracin de los ARN ribosmicos y de transferencia.

Bases modificadas en los ARNts. En los ARNt adems de los cambios indicados en los transcriptos primarios, se producen, en procariotas y eucariotas, numerosas modificaciones enzimticas de las bases. (entre parentesis: smbolo estndar de la base modificada).

Procesamiento del ARNr en eucariotas En nuestro genoma hay cientos de copias, repetidas en tndem, de genes ARNr.
ESQUEMA GENERAL DE PROCESAMIENTO

Organizacin de los genes ARNr: repeticiones en tndem

ARNr 18S 5,8S 28S
SECUENCIAS INTERGNICAS

18S 5,8S

28S

SECUENCIAS INTERGNICAS

18S 5,8S

28S

Procesamiento del pre-ARNr en vertebrados. 1.- el precursor 45S se metila en ms de 100 de sus 14,000 nucletidos (80% de las metilaciones son en 2 -OH de la ribosa). 2.- roturas enzimticas por nucleasas producirn los RNArs 18S, 5.8S, and 28S. 3.- modificacin de bases de U a . La metilacin, rotura y sntesis de pseudouridina ( ) (ver diapositiva bases modificadas) en los ARNr requieren unos ARN pequeos denominados snoRNAs (small nucleolar RNAs), que forman parte de complejos riboproteicos y actan como gua para encontrar los sitios de corte. El RNAr 5S se produce por separado. LEHNINGER

7.1.-Proceso de maduracin de los ARN ribosmicos y de transferencia. snoRNA (small nucleolar RNA) son RNAs pequeos no-codificantes (60-300 nt) de los que se conocen ms de 200 en genoma humano y que juegan un papel esencial en el procesamiento del ARNr en eucariotas. Tomaremos como ejemplo la familia C/D de snoRNA que estn implicados en la metilacin en 2 -ribosa de los ARNr . Estos snoRNA se caracterizan por tener secuencias cortas conservadas que llamamos cajas C y D y que son importante para que puedan asociarse con protenas formando una ribonucleoprotena que es la forma activa. Adems de estas secuencias tienen secuencias gua que por apareamiento de bases localizan un punto determinado del ARNr y metilan la ribosa ya que entre los componentes de la ribonucleoproteina hay una metiltransferasa.

Esquema de un snoRNA de la clase C/D. En recuadro las secuencias conservadas (C, C , D y D ) necesarias para su unin a protenas especificas. En posicin 5 - con respecto a las cajas D y D estn las secuencias gua que por apareamiento de bases reconocen un punto especifico de l correspondiente ARNr. El punto rojo indica el nucletido del ARNr cuya ribosa resultara metilada.

K Mannoor, J Liao, F Jiang (2012) Small nucleolar RNAs in cancer. BBA 1826:121-8

Procesamiento del ARNt en eucariotas Algunos ARNt tienen pequeos intrones, 14-46 nts, adyacentes al brazo del anticodon (en levaduras ~400 genes ARNt, 10% con intrones). En vertebrados, incluidos humanos algunos ARNt tienen intrones.

5-

3 -OH A C C

5-

3 -OH A C C

3 -OH A C 5-C

ENDONUCLEASAS Dependientes de ATP

RNA LIGASAS Dependientes de ATP

Su procesamiento requiere NUCLEASAS y LIGASAS

7.2.-Concepto de intrn y exn. Intrones autocatalticos.

Un intrn es una secuencia interna de un transcrito primario que es eliminada en el procesamiento del mismo. Un exn es aquella secuencia del transcrito primario que permanece en el ARN maduro. Los exones son unidos en el mismo orden en el que aparecen en el transcrito primario. Hay exones en el ARNt (visto), en el ARNr y en el ARNm. Un intrn autocataltico es aquel que puede catalizar su corte y empalme. Son secuencias de ARN que se pliegan y adquieren una conformacin capaz de generar un centro activo equiparable al de los enzimas. Actan como nucleasas y polimerasas y se denominan RIBOZIMAS (enzimas hechas de ARN). El primero en ser caracterizado fue un intrn en el ARNr nuclear del protozoo ciliado Tetrahymena thermophila por el laboratorio de Thomas Cech lo que le vali el premio Nobel en Qumica en1989.

Estructura secundaria del intrn autocataltico de Tetrahymena. Intron sombreado amarillo (414 nucletidos), exones 5 - y 3 - sombreados en verde. El ncleo cataltico esta incluido en el rectngulo sombreado. Regiones apareadas se denominan P1, P3, P2.1, P5a etc. P1 tiene la secuencia gua interna (nt 15-27), que localiza el sitio 5 - de corte y empalme (flecha roja). Parte de la secuencia gua aparea con el final del exn 5 - y lo acerca el inicio del exn 3 - (flecha azul).

Nuclesido nucletido de guanina que inicia la catlisis.

Estructura tridimensional del intrn del ARNr de Tetrahymena.

Feng Guo, Anne R. Gooding, and Thomas R. Cech (2004) Structure of the Tetrahymena Ribozyme: Base Triple Sandwich and Metal Ion at the Active Site. Molecular Cell 16:351-62.

REACCIONES de TRANSESTERIFICACION

CUCUCU U

EXON 5 =O CUCUCU GGAGG O-P-O-A O =O A-O-P-O-UUU O

HOG =O

EXON 3 =O CUCUCU OH GGAGG G-O-P-O UO =O AO-P-O-G 5 O GGAGG =O 3 HO-G A-O-P-O-UUU O =O

A-O-P-O-UUU O

=O

G-O-P-O UO

AO-P-O-G 5 O

IVS 414 nt

4nt 395nt L-19 ARN L-19 IVS

GGAGG

A-G

399nt

3 HO-UUU

15nt

AO-P-O-G 5 O

Intrn autocataltico del ARNr de Tetrahymena. El proceso de eliminacin del intrn implica dos reacciones de transesterificacin catalizadas por l. Solo requiere la presencia de una guanina.

=O

7.2.-Concepto de intrn y exn. Intrones autocatalticos.

Mecanismo de corte y empalme de intrones del grupo I. El nucletido del primer paso puede ser guanosina, GMP, GDP, or GTP. El intrn eliminado es degradado.

Mecanismo de corte y empalme de los intrones del grupo II. Similar al de los intrones del grupo I, excepto que el nuclefilo del primer paso no es G como en grupo I, sino un nucletido interno.