UNIVERSIDAD DE LOS ANDES DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLGICAS BIOLOGA MOLECULAR LABORATORIO SECCIN 6 TALLER VISUALIZACIN DE COMPUESTOS DE LA PCR Y SECUENCIACIN

PRIMERA PARTE (ANTES DE LA PRCTICA) ALEJANDRO VALENZUELA LINA SOTAQUIR CAROLINA AGREDO JUAN SEBASTIN SANCHEZ 1. Adems de los mtodos convencionales, encontramos en el mercado a precios mucho ms costosos, kit comerciales que resultan ser ms eficientes en la purificacin de los productos de PCR. Entre ellos encontramos:

ExoSAP-IT PCR Clean-up Kit: Est compuesto por dos enzimas hidrolticas, como lo son la exonucleasa (EXO) y la fosfatasa alcalina de camaron (SAP), y un buffer especializado para la eliminacin de primers y dNTPs no deseados. Las ventajas de ste mtodo son: En primer lugar, tarda tan solo 30 minutos para hacer la purificacin de los productos de PCR y como segunda ventaja presenta un 100% de recuperacin y purificacin de productos menores a 100 pares de bases y mayores a 20 pares de bases, sin necesidad de geles, columnas de rosca, filtraciones, separaciones magnticas o partculas, herramientas caracteristicas de los otros protocolos.

Figura 1. Diagrama esquemtico del mtodo ExoSAP-IT PCR Clean-up Procedimiento en 30 minutos: - Un solo paso de pipeteado (adicin de mezcla de enzimas) - Una incubacin de 15 minutos a 37C

- Inactivacin de la enzima a 80C durante 15 minutos (Las enzimas inactivadas por calor no interfieren en posteriores aplicaciones).

Figura 2. Degradacin perfecta de primes ExoSAP-IT es capaz de digerir por lo menos 25 pmol de primers en 5l en solo 15 min a 37C, lo que equivale a diez veces la concentracin promedio de primers en una reaccin de PCR

CARACTERSTICAS: A. Simple: En un solo paso y en tubo No necesita de geles, columnas o sedimentaciones, ya que las enzimas EXO y SAP son activas en los buffers de PCR que comunmente se usan, evitando la tapa de intercambio de buffer. La EXO remueve los primers residuales de cadena sencilla y cuaquier ADN extrao de cadena sencilla producida durante la PCR, mientras que la SAP elimina los restantes, dNTPs no incorporados de la mezcla de PCR (ver Fig. 2). B. Alto rendimiento: 100% de recuperacin de la muestra

Figura 3. No hay prdida de los productos de PCR despus del tratamiento de ExoSAP-IT El marcador de ADN (carril M). Gran variedad de tamaos de productos de PCR pueden ser tratados con ExoSAP-IT, incluyendo por ejemplo un fragmento de 125 pb, sin tener prdida de muestra.

Otros protocolos poseen metodologas con mayor nmero de pasos y con recuperciones en rangos del 70 90%. EXOSAP-IT purifica procesos de PCR de menos de 100 pb a ms de 20 kb sin prdida de muestra. En la etapa de tratamiento enzimtico, se asegura que todos los productos de PCR sean conservados en el nico tubo de reaccin. C. Escalable: Menor tiempo y mayor rendimiento El nico paso de pipeteado, permite la adicin de enzimas al tubo de reaccin de PCR, haciendo ms facil el procesamiento de mltiples muestras, de forma manual o automtica mediante dispositivos robticos.

D. Secuenciacin de alta calidad con productos de PCR ExoSAP-IT puede ser utilizado como un mtodo de purificacin previo a lasecuenciacin de ADN fluorescente o radiactivo (GE Healthcare, 2006). Aplicaciones: Es posible encontrar el uso de este mtodo en diferentes artculos cientficos, entre ellos tenemos: An improved method for post-PCR purification for mtDNA sequence analysis

El anlisis de ADN mitocondrial (ADNmt) en muestras tipicamente forenses, es llevado a cabo cuando se evidencia una insuficiente calidad y cantidad de ADN para el anlisis de ADN nuclear. Dicho procedimiento puede llegar a ser largo y complejo, es por esto que se propone un procedimiento ms simple que requiere la purificacin de los amplicones (conjunto de molculas de ADN similares o clon molecular resultado de una PCR) por filtracin centrfuga, posterior a la PCR y previo a la secuenciacin del ciclo. Para tal fin, se hace uso de columnas de purificacin de PCR Qiagen QlAquick y Concert Rapid, y el reactivo ExoSAP-IT. Al evaluarse el rendimiento de dichos amplicones purificados, la calidad del perfil de secuencia y la facilidad de la prueba, se decidi reemplazar el mtodo de filtracin por el uso del reactivo Exo SAP-IT para la purificacin de los productos de PCR (Dugan, Lawrence, Hares, Fisher & Budowle, 2002)..

1. Sequencher 5.1 from Gene Codes Corporation

Figura 4. Sequencher 5.1 (Gene Codes Corporation) The Sequence Manipulation Suite

Figura 5. The Sequence Manipulation Suite (Bioinformatics) 2. El buscador ORFF (Open Reading Frame Finder) es una herramienta de anlisis grfico, utilizada para encontrar todos los marcos de lectura abiertos de un mnimo tamao seleccionable en una secuencia proporcionada por el usuario o en una secuencia ya existente en la base de datos. ORFF los identifica haciendo uso de cdigos genticos preestablecidos y estandarizados. La secuencia de aminocidos deducida es posible guardarla en diferentes formatos y en las bsquedas de las bases de datos de secuencias, haciendo uso del servidor www blast. En pocas palabras dicha herramienta bioinformtica nos permitira la preparacin de una secuencia completa y precisa.

Figura 4. Open Reading Frame Finder (NCBI).

BIBLIOGRAFA:

Bioinformatics. (n.d.). The sequence manipulation suite. Retrieved from http://bioinformatics.org/sms/ Dugan, K., Lawrence, H., Hares, D., Fisher, C., & Budowle, B. (2002). An improved method for post-pcr purification for mtdna sequence analysis . (Master's thesis), Available from Medline. (12136989)Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12136989 Gene Codes Corporation. (n.d.). Dna sequence analysis software. Retrieved from http://genecodes.com/?referrer=Google_SAD_DNA_soft&gclid=CObboq2NoboCFUdk7AodoSAAXg GE Healthcare. (2006). Exosap-it pcr clean-up kit. Retrieved from http://www.promix.ru/manuf/ge/genom/bro/ExoSAP-IT.pdf NCBI. (n.d.). Orf finder (open reading frame finder). Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html