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INTRODUCCIN Los mecanismos de defensa (o estrategias de afrontamiento) son procesos psicolgicos automticos que protegen al individuo frente a la ansiedad y las amenazas externas o internas, y en general individuo, en este caso la planta suele ser ajeno a estos procesos. En la naturaleza las plantas estn expuestas a un gran nmero de organismos patgenos como insectos, hongos, bacterias y virus. Es entonces sorprendente constatar que, a pesar de la inamovilidad y la ausencia de un sistema inmune, la muerte de plantas por enfermedad termine siendo una situacin excepcional. Esto hace pensar que los mecanismos de defensa de las clulas vegetales, tanto aquellos constitutivos como aquellos inducidos por la presencia del patgeno, son muy efectivos para detener o contrarrestar una infeccin. Adems se ha comprobado que las plantas son capaces de reaccionar ante estmulos externos, como puede ser la intensidad de luz, la cantidad de agua o la presencia de algunas sustancias en los alrededores. Las plantas poseen un patrn de conducta lineal, segn el cual actan de forma directa ante cualquier estmulo. La agresin que sufre la planta desencadena una serie de reacciones qumicas por las que se liberan unas sustancias al aire. Para ello, es imprescindible la presencia de una serie de componentes que la propia planta sintetiza, como es el caso de las protenas. Adems han tenido que sufrir adaptaciones a estrs abitico y elaborar estrategias hbiles para la defensa y hacer frente a las agresiones tanto de tipo bitico (insectos, hongos, virus), como de tipo abitico (agua, calor, oxido ntrico). 2.1. Las plantas tienen una doble lnea defensiva Las plantas estn expuestas a muchos agentes patgenos diferentes en el entorno. Sin embargo, slo algunos pueden afectarlas. Si un agente patgeno particular es incapaz de atacar con xito a una planta, se dice que sta es resistente a aqul; en otras palabras, que no puede hospedar al patgeno. Aunque en la naturaleza este tipo de inmunidad detiene a casi todo parsito, ha sido objeto de poca investigacin. Algunos cientficos han desvelado los componentes moleculares de esa primera lnea defensiva. En sus descubrimientos, deducen paralelismos entre los sistemas inmunolgicos vegetales y animales. Los investigadores han constatado que el gen conocido como PEN es un componente importante del mecanismo de resistencia en la primera lnea defensiva. Aislaron mutaciones de plantas Arabidopsis parcialmente susceptibles a algunos mohos, como el de la especie Blumeria graminis. Si estos genes son defectuosos o si falta la protena que codifica en las clulas de la planta, el hongo puede invadir la epidermis foliar. Por eso, los cientficos examinaron cul es exactamente la funcin de la protena PEN2 en la defensa contra los agentes patgenos. La planta idopsis thaliana se defiende contra un parsito invasor. A la derecha, con el gen PEN2 desconectado. La PEN2 es una enzima localizada en la membrana de los llamados peroxisomas. stos son compartimientos celulares separados, en los que a menudo tienen lugar reacciones metablicas que seran peligrosas para el organismo si ocurrieran en otro lugar. Si un hongo trata de invadir una clula vegetal, los peroxisomas son conducidos al sitio de entrada mediante la PEN2. Una o ms molculas de azcar pueden separarse de otro componente celular a travs de la actividad enzimtica de la PEN2, una glicosil hidrolasa. La sustancia liberada parece tener un efecto fungicida, que mata al patgeno. Sin embargo, en ausencia de PEN2, la planta no est completamente indefensa contra los hongos atacantes. Existe una segunda lnea de defensa que es una medida drstica: la clula muere conjuntamente con su agresor, protegiendo al tejido circundante de la infeccin. En esta lnea defensiva suicida, protenas muy diferentes desempean un papel crucial, particularmente las conocidas como EDS1, PAD4 y SAG101. Slo si este segundo mecanismo tambin falla, puede producirse 1

una colonizacin plena por Blumeria graminis. 2. 2. PROTEINAS INVOLUCRADAS EN EL MECANISMO DE DEFENSA DE LAS PLANTAS Las plantas, careciendo de un sistema de defensa basado en anticuerpos similar al que existe en los animales, basan su proteccin en caractersticas fsicas y en una serie de componentes que la propia planta sintetiza. Dentro de esos compuestos, las protenas constituyen una de las principales fuentes de defensa, no slo por su elevada especificidad y eficiencia, sino porque adems algunas de ellas son altamente reguladoras, respondiendo su sntesis al ataque de los depredadores (insectos) o de los patgenos. Estas protenas representan una interesante alternativa para producir plantas con mejores caractersticas de resistencia, ya que a travs de mecanismos de fitomejoramiento o bien introduciendo el gen a plantas sensibles, por medio de la ingeniera gentica. El conocimiento de sus mecanismos de accin representa una forma importante para aprender a combatir plagas y enfermedades de las plantas, sin tener que utilizar compuestos altamente contaminantes, como son los insecticidas comerciales. El constante ataque de insectos y de patgenos sobre las plantas y granos almacenados, produce prdidas muy elevadas para los agricultores, quienes han tenido que recurrir al uso intensivo de pesticidas. Sin embargo, su utilizacin presenta grandes problemas, ya que al no ser especficos contra una clase particular de organismos, y dado que su toxicidad abarca una amplia variedad de organismos, han generado daos considerables tanto a la ecologa como a los organismos superiores. Adems al llegar las lluvias, stas arrastran a los insecticidas, produciendo serias contaminaciones de los mantos freticos. Es por ello que se estudian mecanismos que permitan generar plantas con mayor resistencia al ataque de insectos y de patgenos, tales como los hongos, virus y nematodos, buscando mecanismos naturales que tengan una elevada selectividad y que adems, en las condiciones en las que el producto se ingiere, no presenten toxicidad contra los humanos o contra los animales. Las plantas han generado con la evolucin una serie de sistemas de defensa contra el ataque de insectos y patgenos basados en barreras estructurales o qumicas o generando una respuesta metablica activa. La resistencia de las plantas est frecuentemente dividida en defensa constitutiva, expresada como una caracterstica normal del desarrollo de la planta, o defensa inducible, la cual se activa al contacto con un organismo invasor. Este ltimo requiere un sistema de vigilancia, el cual permita el reconocimiento de la amenaza, generando un sistema de transduccin de seales y una ruta de respuesta, usualmente regulada a nivel transcripcional por medio de la expresin de genes relacionados con la defensa. Existe un nmero elevado de protenas que han sido descritas como parte de los mecanismos de defensa de las plantas, las cuales, slo actuaran sobre los depredadores que ataquen a la planta o a los granos, no produciendo ningn efecto sobre otros organismos. Por esta razn, es importante considerar que estos mecanismos no deben ocasionar dao cuando el hombre o los animales los utilizan como alimento. Esto puede ocurrir debido a su estricta selectividad que le permita reconocer como blanco solamente al insecto o patgeno correspondiente. Interacciones de plantas con parsitos y depredadores Existe una enorme variedad de agentes biticos con el potencial de depredar o parasitar tejidos de plantas, entre los que se incluyen invertebrados, especialmente insectos, nematodos y microorganismos tales como hongos, bacterias, micoplasmas y virus. Las relaciones entre estos agentes y la planta husped tambin varan desde transitorias en tejidos expuestos, hasta asociaciones ntimas de largo tiempo con un alto grado de dependencia y especificidad. Muchos hongos parasticos de plantas, algunos nematodos e insectos y todos los virus son completamente dependientes de clulas vegetales vivas para completar su ciclo de replicacin. Tipos de defensa de plantas La resistencia de las plantas a plagas y patgenos es compleja y basada en la accin combinada de varios factores. En la resistencia a invertebrados, tal como sucede con los insectos, se incluyen factores que modifican el comportamiento del animal sobre la planta husped, as como los que afectan la calidad de la planta como 2

fuente de alimentacin. As, Los componentes estructurales o qumicos, pueden actuar para repeler o disuadir al insecto de la planta seleccionada como fuente de alimento. Si tales defensas fallan, entonces, otros componentes tales como los antinutricionales, pueden asegurar que la planta sea un husped pobre en cuanto a valor nutricional, limitando as el grado de dao. La respuesta activa al ataque incluye efectos sistmico tales como la sntesis de inhibidores de proteasas en tejidos lejanos al sitio inicial de dao. Los factores constitutivos, tanto anatmicos como qumico tales como: cutcula, pared celular e inhibidores enzimticos, son utilizados para prevenir la colonizacin de tejidos de la planta, por la mayora de los microorganismos no patognicos. Si ocurriera una penetracin por parte del microorganismo, entonces los sistemas de defensa inducibles seran activados. Esto incluye una rpida generacin de especies activas de oxgeno, cambios en los polmeros de pared celular, sntesis de compuestos de bajo peso molecular como las fitoalexinas, produccin de protenas relacionadas con la defensa, y muerte celular hipersensitiva. Colectivamente estos sistemas primero inhiben y despus sellan al colonizador potencial. En trminos genticos es usual distinguir entre genes de reconocimiento, los cuales codifican protenas receptoras o asociadas con rutas de transduccin de seales, y genes de respuestas, los cuales codifican protenas que actan como factores de defensa o como enzimas biosintticas en rutas que dirigen a la produccin de compuestos de defensa. Las protenas de las plantas adems tienen papeles claves en muchos aspectos de la defensa, tanto como factores constitutivos de resistencia, como formando parte de la compleja cascada de respuesta de resistencia. Protenas protectoras, propiedades generales Las protenas protectoras pueden ser divididas en dos grandes grupos basados en sus patrones de expresin, aunque hay una considerable sobreposicin entre ellas. El primer grupo de protenas puede ser descrito como constitutivo o tejidoespecfico, y su expresin no est relacionada a la infeccin o dao, aunque stas pueden estar restringidos a rganos, tejidos o tipos de clulas especficos. stos estn particularmente diseminados en semillas y otros tejidos de almacenamiento donde su presencia podra estar confiriendo resistencia a un dao o infeccin. Las protenas protectoras constitutivas ms ampliamente estudiadas son los inhibidores de enzimas hidrolticas, principalmente de proteasas y amilasas. Estos inhibidores, los cuales estn frecuentemente presentes en altas cantidades, actan como protenas de reserva. Los inhibidores de enzimas de plantas estn clasificados en familias, basados en la secuencia de aminocidos, estructura y sus especificidades. En el caso de los inhibidores de proteasas, los mejor estudiados han sido los de sern proteasas como tripsina, quimotripsina y subtilisina. Sin embargo, tambin se han caracterizado inhibidores de otra clase mecanstica, como carboxipeptidasas y cisten proteasas, as como los inhibidores de (alfa)amilasa, aunque estos ltimos pueden ser altamente especficos para enzimas de una particular fuente(por ejemplo, algunos tipos de insectos, bacterias o hongos).Pero algunos inhibidores podran tener otras actividades como puede inducirse por su semejanza con secuencias de aminocidos de protenas conocidas. Las semillas son ricas fuentes de muchas otras protenas que tienen funciones protectoras. Por ejemplo: la cebada, que contiene tioninas, endoquitinasas, protenas que inactivan ribosomas(RIP), Bglucanasas, LTP, lectinas, peroxidasa, y protenas tipo taumanina. El segundo gran grupo de protenas protectoras exhiben patrones de expresin ms altamente regulados, siendo inducidos a respuesta a infeccin o dao. stas, incluyen las protenas relacionadas con la patognesis(PR), que adems estn presentes en el tabaco. Se localizan en las vacuolas ms que en el apoplasto, y estn, involucradas con la defensa de plantas, como las quitinasas y protenas antifngicas. Otras protenas relacionadas con la defensa inducida por infeccion o dao incluyen los inhibidores de 3

proteasas PI y PII de papa. Estos inhibidores de tripsina y quimotripsina, no slo son inducidos por dao mecnico en hojas, sino tambin son expresados en tubrculo y flores. Dos de los principales grupos de las protenas PR inducidas por infeccin en tabaco por el virus del mosaico del tabaco, son las B1,3gluacanasa y endoquitinasa. Ya que los bglucanos y la quitina estn presentes en la pared celular de muchos hongos patgenos. Las endoquitinasas de plantas frecuentemente muestran actividad de lisozima, y algunas lisozimas de endoquitinasa; ambas actividades requieren de la hidrlisis de enlaces B1,4 entre homopolmeros de Nacetilmurmico y Nacetilglucosamina para lisozima. Los lisozimas inhiben el crecimiento bacteriano por hidrlisis de peptidoglicanos de la pared celular, por lo que juegan un papel en la defensa contra bacterias patgenas. Resistencia a patgenos microbianos Durante la colonizacin de tejidos, los microorganismos patgenos de plantas, especialmente los patgenos necrotrficos, despliegan enzimas hidrolticas extracelulares contra polmeros de pared celular. Tales enzimas, incluyen pectato liasas y pologalacturonasas, las cuales han sido implicadas como factores de patogenicidad de bacterias y hongos patognicos de plantas. Protenas que inhiben poligalacturonasa han sido detectadas en una amplia variedad de plantas dicotiledneas, y en frutos tales como tomate, manzana y pera. Las poligalacturonasas pueden actuar como factores potenciales de virulencia, por la liberacin en presencia de PGIP de molculas seal que activan la ruta de defensa de la planta. Inhibidores de proteasas En las plantas los polipptidos y protenas proteolticas estn generalmente concentradas en tejidos de almacenamiento, como semillas y tubrculos. Su abundancia en estas familias no es nica, ya que se han encontrado en races y hojas en gneros de otras familias. Los inhibidores de proteasas son elementos importantes de la respuesta de defensa de la planta a la degradacin. El papel de los inhibidores en la regulacin de las actividades proteolticas es muy importante por la proteccin que proporcionan a tejidos y fluidos de la degradacin no deseada. Los inhibidores de proteasas encontrados en plantas, generalmente contienen altos porcentajes de cistena formando puentes disulfuro, lo cual los hace resistentes a la desnaturalizacin por calor y ph extremos. La produccin de estos inhibidores est altamente regulada por una ruta de transduccin de seales que es iniciada por el ataque del patgeno y transducida como una respuesta de dao. Los inhibidores de proteasas se acumulan durante la maduracin de la semilla, y se ha argumentado que la maduracin de semillas es un indicador de su funcin de defensa. Con el ataque de herbvoros se inicia la respuesta de defensa de la planta que incluye la induccin de la expresin de genes de inhibidores de proteasas que pueden estar ligados directamente con la resistencia al ataque del insecto. La induccin de expresin de genes de inhibidores de proteasas ocurre tanto en clulas del sitio del dao, como en lugares distantes a ese sitio. La respuesta de defensa puede incluir la expresin de mltiples inhibidores de proteasas que pueden inhibir un amplio nmero de proteasas digestivas del herbvoro. Respecto al dao mecnico, los fragmentos de oligosacridos pctidos que son liberados de la pared celular de la planta, y oligmeros de quitosana derivados de la pared celular de hongos, se asume que actan como inductores extracelulares de la ruta de seales que dirige a la expresin de genes de inhibidores de proteasas. Los polisacridos inductores no parecen ser inmviles en la planta, por lo que es probable que estas molculas nicamente induzcan en forma local la expresin de genes de inhibidores de proteasas. La magnitud de respuesta de defensa es mucho mayor en plantas atacadas por insectos que en plantas daadas mecnicamente. 4

3. Tipos de agresiones: Estrs bitico y abitico. Los vegetales son hipersensibles y, por su imposibilidad de huir, han elaborado estrategias asombrosamente hbiles de defensa activa y pasiva para hacer frente al estrs al que estn sometidos. Explican los cientficos que las plantas estn expuestas a dos tipos de agresiones: las que proceden de otros seres vivos, como el hombre, los animales, los hongos o los virus, que se denomina estrs bitico. La otra procede del ambiente, como la sequa, el calor o el viento, que se le conoce por estrs abitico. 3.1. Estrs bitico en vegetales: Estrs bitico se denomina al conjunto de agresiones que padecen las plantas y que viene producido por otros seres vivos, como insectos, hongos, virus, agentes patgenos, plagas, etctera. Este estrs provoca en la planta la prdida de rendimiento. A continuacin se detalla y se explica los tipos de agresores ms importantes: % Mamferos herbvoros: Los herbvoros ejercen una gran presin sobre las plantas, por ejemplo, en el bosque mediterrneo, cada vez aumenta ms el nmero de herbvoros debido a la caza, la explotacin ganadera, etc. Los herbvoros pueden limitar la regeneracin forestal, ya que consumen semillas y plntulas jvenes. Sirva como ejemplo el caso del pino albar en Sierra Nevada, del cual los depredadores consumen casi el 99% de sus semillas, lo cual constituye una dificultad mayor para que la semilla del pino pueda germinar. En ocasiones, las plantas usan como mecanismo de defensa la asociacin con otras plantas ms resistentes que ellas, este es el caso de algunas plantas del bosque, que crecen en zonas de matorral el cual los protege del pisoteo y la depredacin de la herbivora al hacer de barrera entre dichos herbvoros y la planta. %Insectos y plagas: Los insectos y las plagas producen en las plantas un dao mecnico sobre todo provocado por la accin de insectos fitfagos. Las plantas reaccionan al ataque por plagas activando una batera de genes de defensa en el tejido daado y tambin en zonas distales no daadas en la planta herida. La planta transporta una enzima hacia el lugar de infeccin. Puesto que tiene un efecto fungicida, all mata al patgeno, si este sistema falla, entra en accin la segunda defensa de la clula, que consiste en provocarse la muerte y, de ese modo, producrsela tambin al patgeno, de esta forma consigue poner a salvo al resto de la planta del contagio de dicho agente patgeno. Las plantas interaccionan con los insectos depredadores, para percibir la presencia de stos, las plantas detectan las secreciones orales de stos. Entre las defensas vegetales directas inducidas por los herbvoros destaca la produccin de metabolitos secundarios toxicos o repelentes y de molculas voltiles. Estas desempean tambin un importante papel en le defensa indirecta de la planta. Algunos compuestos voltiles suelen ser comunes a muchas especies, como alcoholes, aldehdos, steres y terpenoides. Otros compuestos son, por el contrario especficos de cada especie. Los hay que sirven para atraer depredadores y parsitos que destruyan a los herbvoros agresores, es decir, utilizan la ayuda de otros artrpodos. En otros casos, la porcin de cido graso de ciertos compuestos, como la volicitina, sufre una modificacin en el intestino de los insectos, que concluye en la emisin de compuestos voltiles los cuales atraen parsitos del insecto, por lo que ayudan a la planta a deshacerse del insecto no deseado. Esta liberacin de sustancias voltiles puede reducir el ataque de la herbivora hasta en un 90%. Pese a esto, y como resultado de la coevolucin, algunos insectos herbvoros se han adaptado a las defensas de las plantas, se puede observar que los colepteros y los lepidpteros hacen frenta a la presencia de los inhibidores de proteasas mediante la sntesis de proteasas insensibles a la inhibicin, esto es una capacidad propia de cada especie.

%Agentes patgenos: En la naturaleza las plantas estn expuestas a un gran nmero de organismos patgenos como insectos, hongos, bacterias y virus. Sin embargo, slo algunos pueden afectarles. Si un agente patgeno particular es incapaz de atacar con xito a una planta, se dice que sta es resistente a aqul; en otras palabras, que no puede hospedar al patgeno. Pese a esta gran variedad de estresantes biticos y ante la ausencia de sistema inmune y movilidad de las plantas es difcil que una planta muera por enfermedad. Esto hace vigente que los mecanismos de defensa de las clulas vegetales, tanto aquellos constitutivos como aquellos inducidos por la presencia del patgeno, son muy efectivos para detener o contrarrestar una infeccin. Las plantas presentan barreras estructurales que intentan impedir la entrada de patgenos. Entre ellas se encuentran la pared celular, lignina, cutcula, y las aperturas naturales de las plantas (estomas, lenticelas, etc.). Para superar estas barreras, los patgenos necesitan de enzimas hidrolticos que destruyan estas barreras estructurales, as algunos producen peptinasa que afecta a la pared celular de las plantas, otros cutinasa que altera la cutcula, etc. Adems de estas barreras, las plantas acumulan metabolitos secundarios, que en muchos casos poseen propiedades antamicrobianas, y que van a actuar en el lugar de penetracin del patgeno. Tras el ataque de los patgenos a la planta, sta pone en marcha mecanismos de respuesta local como son la lignificacin, la formacin de papilas, el enriquecimiento de la pared celular en glucoprotenas ricas en hidroxiprolina, o la oclusin vascular. Junto al desarrollo de estructuras locales para bloquear la entrada de los patgenos, tambin se acumulan sustancias alrededor del lugar de la infeccin, conocidas como fitoalexinas, que incluyen una gran cantidad de productos naturales, que se producen en mayor cantidad tras la entrada de un patgeno y poseen capacidad antimicrobiana. Adems de la defensa local, la resistencia de las plantas puede extenderse hacia regiones totalmente intactas de la misma que no han sido lesionadas por el patgeno. Esta resistencia se ha denominado Sistmica Inducida o Adquirida. La respuesta tiene una duracin de semanas y no es especfica, ya que acta de forma semejante para una amplia variedad de patgenos, o incluso tras lesiones mecnicas no causadas por patgenos invasores (la produccin de pequeas lesiones a las plantas ha sido utilizada por agricultores desde antiguo para inducir resistencias en las mismas frente a la invasin de diversos patgenos). El mecanismo a travs del cual las plantas reconocen a los patgenos no es del todo conocido, pero parece que componentes que se liberan durante la interaccin plantapatgeno, conocidos como inductores, van a ser reconocidos por receptores presentes en la planta. La interaccin con estos receptores llevar a la activacin de genes de resistencia sistmica y a la sntesis de las protenas antes comentadas denominadas protenas de resistencia sistmica (PRS). Reaccin hipersensibilidad provocada por la infeccin de plantas de tabaco con el virus del mosaico del tabaco (TMV). Se muestran las lesiones necrticas que se desarrollan en los sitios de ingreso del patgeno. 3.2. Estrs abitico en vegetales: La evolucin transcurrida durante millones de aos, ha condicionado su gran diversidad que resulta de la adaptacin frente a distintas condiciones ambientales. La diversidad de especies vegetales existentes, resultante de una evolucin continua en el tiempo, ha debido implicar el desarrollo de mecanismos fisiolgicos y morfolgicos que han hecho posible la adaptacin de las plantas a los hbitats ms diversos y ms extremos del planeta. Forma y funcin han estado siempre relacionados y se complementan para optimizar la vida en ambientes diferentes, ya sea para dotar de tolerancia frente a rangos extremos de temperatura o donde existen limitaciones de disponibilidad de agua, ambientes permanentemente inundados, en suelos contaminados por el hombre o en sustratos por naturaleza 6

adversos, las plantas se ajustan para su evolucin a las diferentes condiciones de estrs del medio ambiente. Estas son algunas de las diferentes estrategias adaptativas: TOLERANCIA A LA SALINIDAD Y A ELEMENTOS PESADOS Las plantas pueden ajustar su metabolismo a diferentes condiciones negativas ya sea de extrema salinidad, en ambientes contaminados con elementos pesados o en presencia de residuos industriales. Muchas otras especies pueden tolerar la sequa y salinidad tpica de desiertos y, alternativamente, un conjunto denominado "manglares" son plantas que pueden adaptarse y crecer aun sumergidas sus races en agua marina conteniendo 31 gramos de sal por litro aprox. Adems, existen las denominadas especies "acumuladoras" que poseen la propiedad de almacenar en cantidades extremas uno o ms elementos pesados y txicos para las plantas presentes en el suelo como Uranio, Cadmio, Plomo, Arsnico, Zinc, Cobre, Fierro, Nquel, Selenio, etc. Las plantas acumuladoras pueden cumplir con un rol esencial vinculado a descontaminacin de suelos al incorporar, acumular, metabolizar e inactivar varios de dichos elementos. Este proceso se llama "fitorremediacin". Existen varios mecanismos de tolerancia de las plantas frente a un exceso de iones y metales pesados en el ambiente. Entre ellos, junto con lograr un impedimento de ingreso al citosol, existe fijacin de metales en las paredes celulares, formacin de complejos inorgnicos, inmovilizacin por protenas especficas (fitoquelatinas), unin e inactivacin con cidos carboxilicos, (uniones a malato, citrato, oxalato) y fijacin a varios compuestos orgnicos a acumularse en la vacuola.

Mecanismos de Transporte, Detoxificacin y Resistencia de las Clulas Vegetales frente a Metales Pesados. (a) Inmovilizacin de metales en la pared celular y membrana plasmtica (plasmalema); por accin de 7

pectinas, protenas, aminocidos y otros componentes. (b) Transporte activo de metales (reexportacin) por carriers especficos a nivel de membrana. (c) Ingreso por pared (apoplasto) y membrana (simplasto) con posible formacin de radicales libres en citosol. (d) Ingreso y fijacin de metales pesados a fitoquelatinas (FQ) en el citosol formando compuestos quelados inocuos / fijacin a polisacridos y glicoproteinas en citosol / ingreso a vacuola. (e) Conversin Ingreso de compuestos complejados FQ a AO (malato, succinato, citrato, etc.) y compartimentacin en vacuola. (f) Fijacin de metales pesados a glicoproteinas y polisacridos en el citosol / ingreso a vacuola. (g) Fijacin de metales pesados a cidos carboxilicos/orgnicos (AO) directamente en el citosol; ingreso a vacuola. (h) Accin de sistemas de defensa antioxidante en pared/membrana (OX=oxigenasa); citosol (PER=peroxidasas) y en cloroplastidios (FTR=ferredoxin thioredoxin reductasa).

Los diferentes posibles daos que ocurren al no funcionar los mecanismos protectivos pueden ser: destruccin de ADN, de proteinas, membranas, reduccin de glutationa, degradacin de tilacoildes en cloroplastos, inhibicin de enzimas del ciclo de Calvin y daos al sistema pigmentario II (PSII) y clulas vecinas. Otra estrategia visible en algunas especies frente a la salinidad es la conversin paulatina de plantas C3 al metabolismo propio de las CAM ( ej. Cactus) implicando la sntesis denovo de la enzima PEPcarboxilasa al cabo de unos 45 das de sometimiento a este tipo de estrs. La estrategia consiste en que a travs de la presencia de la PEPcarboxilasa se permite la fijacin de CO2 de noche, periodo en que los estomas de las plantas CAM se encuentran abiertos. Dichos mecanismos estn referidos a reducir la prdida de agua por transpiracin, aumentando la tolerancia a sales y sequa frente a estas condiciones. TOLERANCIA A LA SEQUIA Y ESTRES HIDRICO; EFECTOS DE TEMPERATURA VS ECONOMIA DEL AGUA EN ZONAS DESERTICAS. AGUA. Tolerancia y adaptacin tambin se aplica a aspectos de sequa en las plantas efecto que puede ser agravado al potenciar otros daos causados por altas temperaturas del ambiente. El concepto de sequa e implicancias sobre la marchitez, no debe vincularse slo respecto a un contenido definido de agua en un suelo sino ms bien a la disponibilidad de agua existente en el sustrato que la planta puede efectivamente usar .El agua ingresa a la clula vegetal en trminos fsicos de "energa libre". Ello implica difusin desde ambientes con mayor cantidad de molculas de agua hacia donde se encuentra menos agua disponible. El rango de disponibilidad del agua que existe en el suelo (y el agua que puede difundir a las races) va desde niveles de aprox. 0.3 Atm. a 15 Atm. El agua retenida por el suelo a tensiones mayores no es transportada a las races y no puede ser usada por las plantas. Ambos rangos lmites, que definen el agua disponible y la vida de la planta, corresponden a "Capacidad de Campo y Punto de Marchitez Permanente", respectivamente. A tensin de 15 Atm. la planta se marchita irreversiblemente aunque se someta inmediatamente a ofertas de agua ptimas para su recuperacin. El problema del constante suministro del agua de las plantas a la atmsfera denominado transpiracin.

TEMPERATURA. Las altas temperaturas a las cuales estn expuestas las plantas son una limitante para que las hojas y tallos puedan mantener la estructuracin de sus protenas y enzimas requeridas para mantener el crecimiento. La necesidad de realizar reacciones qumicas, metabolismo y construccin de estructuras celulares, implica estabilidad de mecanismos bioqumicos por lo cual deben ser impedidos registros de temperatura en hojas y tallos superiores a 55C. Condiciones como las anteriores por periodos mayores a 15 min. implican la muerte de las plantas. La gran estrategia evolutiva comn de funcionamiento en plantas terrestres corresponde a desarrollar una mayor tasa transpiratoria cuando el agua no es limitante. La transpiracin implica prdida a la atmsfera de agua lquida en forma de vapor; el calor de evaporacin cedido por las hojas reduce permanentemente su temperatura. Junto con la liberacin de calor, existen otros procesos acompaantes y de apoyo para la adaptacin al problema de economa del agua, que se citan ms abajo: Las plantas conforman productos que implican apoyo osmtico. Se ha visto que la porcin 8

apical y regiones de las hojas ms expuestas a la luz y temperatura, sintetizan compuestos que estabilizan su condicin y favorecen especialmente la retencin de agua como defensa a la marchitez por sequa. Las plantas pueden regular mecanismos temporales de cierre estomatal; producir cambios de posicin y expresar cada anticipada de hojas. A travs de la apertura estomtica se regula simultneamente la salida de agua y el ingreso de CO2 para el proceso de fotosntesis. La gran mayora de las plantas abren sus estomas de da y los cierran de. De acuerdo a la estrategia adaptativa, tal como ocurre en varias especies insertas en el grupo CAM, stas por contrario abren sus estomas de noche, cerrndolos de da. La respuesta adaptativa de plantas CAM para fijar CO2 es activar otra enzima capaz de tomar el CO2 del ambiente. Mediante la accin de la PEPcarboxilasa presente en estas especies es posible fijar el CO2 en forma de malato (molcula de 4 carbonos) y confinar estos carbohidratos en la vacuola de las clulas. El malato formado de noche se transforma durante el da en piruvato (molcula de 3 carbonos) y CO2 el cual es captado por la enzima Rubisco que da inicio al ciclo de Calvin a estoma cerrado. La importancia adaptativa de este mecanismo de las plantas CAM reside en el hecho que stas proceden de noche con mxima economa de agua. La economa hdrica en estas plantas implica tambin variaciones drsticas de su morfologa. Por otro lado, junto a un escaso nmero de estomas, la falta de hojas reduce la superficie transpiratoria y la posicin vertical favorece una menor incidencia de luz. La regulacin de la temperatura interna se realiza por difusin continuada del agua en su proyeccin horizontal. Durante el da se calienta ms el agua celular de las clulas ms externas, el agua caliente difunde hacia al interior, y sta de menor temperatura se mueve hacia la periferia, enfriando. Durante la noche se produce el fenmeno inverso. Tambin las espinas, se consideran morfolgicamente relevantes en la economa hdrica. En muchas zonas desrticas, en localizaciones ms cercanas a la costa y con alta humedad ambiental proveniente del mar, las espinas favorecen la condensacin de la humedad durante la noche. Las gotas fluyen por gravedad por el tallo a la superficie arenosa del suelo donde pueden ser captadas por las races superficiales favoreciendo la economa del agua. Otra estrategia es tener hoja ancha y no suculentas, consiste en acelerar la senescencia de sus hojas, y a travs de su eliminacin, evitar la transpiracin y prdida de agua. La seal de sequa aumenta la cantidad endgena de algunas fitohormonas como son el cido Abscisico y/o el Etileno, ambas determinantes de efectos que aceleran la senectud de las hojas y promueven su cada ms temprana. Las plantas perciben el verano, o la cercana del periodo estacional de sequa. La seal de inicio de la floracin no estara slo dada por el fotoperiodo sino por la percepcin de incremento de temperaturas y de agua disponible, que asegure completar la fase de desarrollo reproductivo. La fenologa de las flores y su longevidad depende de la temperatura y disponibilidad de agua; con lo cual en aos secos se muestra una reduccin del crecimiento vegetativo (tallos ms cortos) aunque la floracin, que implica reproduccin a travs de semillas, puede verse menos afectada. Existen otras estrategias que igualmente permiten la vida de plantas en ambientes de sequa extremos. Por ejemplo, el tamarugo (Prosopis tamarugo) que crece en la porcin desrtica de la "Pampa del Tamarugal". Se trata de una planta leguminosa que a primera vista no posee ninguna estrategia adaptativa y es del tipo de fijacin de carbono C3. La estrategia de supervivencia del tamarugo es tener races pivotantes muy largas que dan cuenta del mayor volumen en cuanto al suministro de agua profunda, y otras ms superficiales captan el agua generada por condensacin durante la noche. El intenso crecimiento de la raz pivotante es de origen gentico. Se trata sin embargo de estrategias de alto riesgo, por lo extremo de las condiciones existentes que impiden la existencia de otras especies vegetales. Otras estrategias inherentes a su adaptacin desrtica vinculadas a aspectos nutricionales y 9

que tambin han logrado subsanar. La falta de agua superficial, especialmente de lluvias y baja humedad relativa, no es posible la degradacin de biomasa area por microorganismos, limitando el reciclaje orgnico y acceso de nutrientes hacia las races, especialmente de nitrgeno; limita la disponibilidad de iones por parte de las races. La solucin del problema es variada; la falta de nitrgeno en las capas profundas se suple por fijacin del N2 del aire, gracias a la asociacin de las races de estas leguminosas con Rhizobium, bacteria que vive en forma simbitica y que aporta este elemento en forma de amina evitando las deficiencias nutricionales previstas. Tamarugos cuentan adems con un sistema superficial de races el cual alterna flujos hdricos que permite disolver y captar nutrientes superficiales. Bosque de Tamarugo. Las plantas manejan mecanismos fisiolgicos especficos de proteccin. Algunas plantas sometidas a estrs hdrico y/o alta radiacin (exceso de fotones) pueden contar con mayor resistencia y/o proteccin mediante una adecuada neutralizacin de las formas reactivas del O2, referidas a "especies reactivas del oxgeno (ROS)". La reactividad del ozono (O3) con O2 produce las ROS en trminos de H2O2, cada uno de los cuales pueden producir dao por oxidacin en genes alterando la configuracin aminoacdica de protenas. El O3 es altamente reactivo y puede producir oxidacin de cidos grasos a perxidos lipdicos alterando la fluidez de las membranas; afectar las membranas tilacoidales de los sistemas pigmentarios de la fotosntesis, daar la enzima Rubisco, descontrolar los mecanismos de apertura y cierre de los estomas, entre otros efectos. En plantas en que concurre este ciclo protector stas se encontrarn ms protegidas en ambientes donde exista gran polucin, especialmente en zonas urbanas e industriales con incrementos notorios de niveles de ozono (O3) en la atmsfera. Junto a una alta radiacin, se ha visto que en condiciones ambientales de continuas altas temperaturas, se induce la sntesis de "Protenas de Shock Trmico" (HSPs) en muchas especies. Estas protenas no slo conceden una proteccin inmediata a altas temperaturas sino simultneamente apoyan otros tipos de estrs. En general, las plantas que deben someterse a muy bajas temperaturas y estn ambientadas a inviernos largos y fros cuentan con estrategias diversas; entre ellas una proporcin mayor de cidos grasos insaturados vs. saturados en membranas de mitocondrias y membranas celulares; y acumulacin de solutos en invierno para impedir la cristalizacin del agua a nivel tisular. TOLERANCIA A LA INUNDACION Y O CONJUNTAMENTE A AGUAS SALINAS La concentracin de NaCI en el agua de mar, y su ion Na, implica altamente toxicidad para las clulas radicales alterando la estructura y funcionamiento de las membranas plasmticas, lo que afecta su permeabilidad y capacidad de regulacin. Existen varios mecanismos alternos, complementarios. Primeramente, en el caso de manglares, las plantas no son de gran altura y presentan un crecimiento lento. La mayora de sus races estn sumergidas en el agua crecen en contra de la gravedad y emergen por sobre el agua como zancos. La emergencia de las races es a consecuencia de la necesidad de absorber O2 para usar este gas en la combustin aerbica en mitocondrias para la produccin de ATP. El ATP es requerido para regular el ingreso excesivo de sales; regulndose as calidad y cantidad de sales que ingresan. El mecanismo constituye trabajo de bombas de cationes para facilitar el movimiento de iones hacia fuera de la clula en contra del gradiente externo ms concentrado del ambiente, en este caso el agua de mar. En resumen, para que el agua fluya desde el suelo a la atmsfera, atravesando haces vasculares, debe existir un gradiente de "potencial de agua"; mayor en el suelo y en la zona radical y menor en la porcin foliar, donde se evapora. Para mantener dicho gradiente, las sales son filtradas no ingresando a la corriente transpiratoria; en otros casos, parte de las sales son excretadas por los tallos u hojas (glndulas de sal) y as eliminadas del sistema.

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Existen otros aspectos metablicos necesarios para mantener el equilibrio de plantas adaptadas a ambientes inundados, como por ejemplo una enzimtica especial en las races. Uno de los mecanismos consiste en la actividad de la PEPcarboxilasa, slo presente o activa en las races de plantas tolerantes a la inundacin, capta el CO2 del sistema respiratorio y lo transforma en cido mlico estable, molcula usada posteriormente en sntesis de aminocidos. TOLERANCIA A VARIOS GASES Las plantas mantienen un intenso metabolismo gaseoso debiendo regular concentraciones de gases producidos en respuesta a procesos endgenos o de origen externo. Los gases son los elementos ms difundibles en los tejidos, penetrando membranas con gran facilidad y velocidad. Cutina, corteza y peridermis son respuestas anatmicas adaptativas previstas para regular niveles de gases (y agua) en hojas, tallos y races respectivamente. Gases vinculados a fotosntesis. La toxicidad para las plantas puede ocurrir cuando existen cambios internos bruscos de niveles de ambos gases. A veces puede existir una deficiencia de CO2 que provocara la muerte por "desnutricin" de carbohidratos. Algunas especies de gefitas (entre ellas Stylites, que vive enterrada en el suelo), no cuentan con estomas en sus hojas. Dado a su hbito subsuperficial, la naturaleza le ha dado la adaptacin consistente en que el suministro de CO2 sea incorporado por la raz y se conduzca de all al follaje para su fijacin fotosinttica. Gases involucrados en regulacin del desarrollo. En el caso particular de muchas plantas que viven en ambientes de suelos de humedad normal y que temporalmente deben soportar inundaciones naturales, ya sea por desborde de ros, precipitaciones intensas o regados no controlados, stas reaccionan produciendo el gas etileno en sus hojas. Por causa de inundacin y anaerobiosis (y otros factores de estrs), se sintetiza en las races el precursor de etileno ACC a partir del aminocido metionina, el cual se moviliza por el xilema a las hojas transformndose ah en gas "etileno". Su acumulacin provoca la cada total de hojas de la planta. El etileno no slo se produce por causa de inundacin sino que es una hormona natural endgena reguladora de la maduracin en muchas especies. Aplicaciones al follaje deben ser por tanto cuidadosas para evitar una posible cada total de frutas con prdida absoluta de cosechas y considerables daos en la vegetacin que se encuentra aledaa. Gases de naturaleza ajena a las plantas y su tolerancia. Otra situacin particular referida a "gases" son posibles daos generados por estos contaminantes derivados del proceso industrial en reas industriales. Otro ejemplo, seran los pesticidas, ya que suponen para el vegetal un estrs qumico importante y este se prepara para degradarlos gracias a las protenas antiestrs, o echarlos fuera mediante la rotura de las vacuolas. TOLERANCIA A LA RADIACIN Cuando la intensidad de fotones que llega a la superficie de la hoja es muy alta y se produce un exceso de fotones no utilizables en la fotosntesis. Debe recordarse adems que en trminos evolutivos, la captacin de fotones est ajustada. Plantas de sombra y de sol en su hbitat tienen diferente nmero de cloroplastos en sus clulas lo que permite regular la radiacin con eficiencia; cambios de su orientacin facilitan adems ajustes rpidos segn la radiacin imperante del momento. Tambin las hojas enfrentan la radiacin con ajustes de posicin, los movimientos pueden corresponder a respuestas de irritabilidad diurnas reversibles o bien a una adaptacin continua de posicin. A nivel celular, parte de los fotones en exceso se eliminan como calor sin mayor problema; sin embargo, a nivel de la membrana, el exceso de fotones provoca dao de estructura el cual debe ser reparado. Como se indic antes, a pesar que existen sistemas de proteccin, existen daos debido a la produccin de diferentes formas txicas de oxgeno. Existe adicionalmente otro tipo de proteccin a nivel de los sistemas pigmentarios. Ac las formas txicas del oxgeno y compuestos derivados pueden ser reducidas o eliminadas por efecto de carotenoides y enzimas, pero en caso extremo, la 11

protena D1 del fotosistema pigmentario II debe aceptar dichos productos a costa de su propia destruccin. Aunque las protenas D1 son fcilmente recuperables las etapas posteriores de dao ocurren igual dada la formacin de molculas oxidadas, con resultante de fotoinhibicin. 4. Aprovechamiento: aplicacin mdica y agrcola Aprovechamiento agrcola El trmino biocontrol en agricultura puede definirse como: el uso de organismos, o de sustancias producidas durante su crecimiento, para reducir o eliminar plagas que afecten a los cultivos. Uno de los mecanismos ms novedosos para realizar biocontrol, y con mayor proyeccin de futuro, consiste en la utilizacin de determinadas molculas para estimular la resistencia de la planta frente a fitopatgenos . La aplicacin del ASM (bajas dosis de aspirina) a cultivos de inters agrcola est bien establecida, produciendo una activacin de la SAR(resistencia sistmica inducida) de larga duracin y protegiendo a los cultivos contra agentes patgenos con un espectro especfico a cada cultivo. Tambin se ha demostrado la operatividad del empleo mixto de ASM con bajas dosis de fungicidas o bactericidas convencionales. Este tipo de tratamientos, conlleva una activacin de los mecanismos de defensa de la planta as como una accin directa de los fungicidas contra los patgenos, lo que redunda en una disminucin de las dosis requeridas de fungicidas o bactericidas, y unas prcticas agrcolas ms sostenibles. Hasta el momento, hemos descrito como todas las plantas responden al ataque de patgenos mediante diversas estrategias coordinadas de resistencia mediadas por diferentes rutas de sealizacin bioqumica. La rapidez y la extensin de la respuesta a stas seales intracelulares, en la interaccin plantapatgeno, determina finalmente, el que la planta pueda superar satisfactoriamente la infeccin del patgeno. En este sentido, la idea de acelerar la respuesta de la planta mediante la aplicacin de inductores de resistencia sistmica (biticos o abiticos, respetuosos con el medio ambiente) es del todo atractiva y supondra, al mismo tiempo, una alternativa biolgica, ambiental y comercialmente viable, a los mtodos actuales de control de patgenos mediante el uso tradicional de pesticidas qumicos. La demanda social de elicitores de respuestas de defensa de las plantas y compatibles con el medio ambiente, es cada vez mayor. En este sentido, compuestos abiticos como el ASM y Probenazol(fungicida sistmico de accin indirecta), o biticos, considerados como compuestos compatibles con el medioambiente y se comercializan como compuestos que mejoran la resistencia/tolerancia de las plantas a enfermedades producidas por patgenos. Recientemente, se ha desarrollado un producto compuesto fundamentalmente por perxido de hidrgeno OxycomTM , que al aplicarse sobre los cultivos en experimentos de campo y en el laboratorio, ha demostrado que induce la expresin de genes relacionados con las respuestas sistmicas de defensa a un buen nivel. Una estrategia agrcola sostenible o ecolgica, basada en la utilizacin de compuestos elicitores de mecanismos de defensa y que tenga como objetivo final la consecucin de una inmunidad fisiolgica en la planta, necesita para su aplicacin el disponer en el mercado de una amplia gama de dichos productos. Por ello, una de las prioridades actuales de las empresas relacionadas con la fabricacin de compuestos fitosanitarios, es la obtencin de molculas elicitoras de las respuestas sistmicas de defensa de las plantas que sean susceptibles de ser utilizadas en una agricultura ms respetuosa con el medio ambiente. Entre los factores positivos relacionados con el empleo de este tipo de compuestos, se podran destacar los siguientes : 1) Evitan los problemas relacionados con la aparicin de resistencias en los patgenos a los pesticidas 12

clsicos. 2) Pueden sustituir a los numerosos pesticidas que actualmente son de retirada obligatoria, al no ser compatibles medioambientalmente. 3) Reducen los riesgos asociados a la salud que pueden presentar los pesticidas qumicos. 4) Pueden ser efectivos contra enfermedades producidas por virus y patgenos de suelo, frente a los cuales los tratamientos qumicos no son eficaces. 5) No hay necesidad de introducir genes forneos en las plantas, y por tanto se evita el problemadilema de los transgnicos. 6) Presenta un efecto de larga duracin y de amplio espectro. 7) Se activan defensas naturales de la planta mediante la induccin de resistencia, evitando se generen resistencias indeseadas en los patgenos. Sin embargo, este tipo de estrategia tambin tiene sus inconvenientes. Entre los inconvenientes a considerar se podran citar : 1) Al contrario de los pesticidas clsicos que actan destruyendo o inhibiendo el crecimiento de los patgenos, la resistencia sistmica inducida depende de la expresin de genes en la planta, su efectividad estando sujeta a influencias fisiolgicas y medioambientales. 2) Las compaas slo comercializaran elicitores patentables. 3) La aprehensin de los productores y consumidores por las nuevas tecnologas. Uno de los principales problemas con los que nos enfrentamos a la hora de producir o generar nuevos compuestos elicitores, es el de contar con tcnicas que permitan detectar su efecto en la planta de una forma rpida y fiable. Los ensayos que se realizan con este fin, en la actualidad, se basan en pruebas de campo (alto consumo de tiempo) y/o en la deteccin de productos resultantes de la induccin de los mecanismos de defensa de la planta (alto consumo de tiempo y pueden ser inespecficos). En ambos ensayos es muy complicado determinar el tipo e intensidad de respuesta de la planta. Por lo tanto, para poder realizar una bsqueda sistemtica de nuevos compuestos elicitores, es imprescindible contar con tcnicas que permitan de forma fiable y rpida, constatar y cuantificar la respuesta de la planta frente a los mismos. La novedad de utilizar fermentaciones microbianas a la hora de generar nuevos elicitores se basa, en primer lugar, en que los microorganismos a emplear se caracterizan por una gran capacidad metablica y de secrecin de enzimas extracelulares, lo cual nos asegura que durante su crecimiento e hidrlisis de los sustratos de fermentacin, se van a liberar y/o generar una amplia gama de sustancias a los medios de cultivo. Por otro lado, los subproductos y residuos que se emplean como sustratos de fermentacin, han sido escogidos por ser fuentes de macromolculas, que una vez hidrolizadas, podran dar lugar a compuestos elicitores, como por ejemplo: quitina, glucanos, xilanos, pectinas, protenas, lignina, etc. A lo anteriormente mencionado, habra que aadir que los sustratos son de fcil disponibilidad y bajo costo. La combinacin de ambos procesos, produccin y escrutinio o screening de compuestos elicitores mediante la tecnologa molecular antes descrita, pese a su reciente puesta a punto, nos est permitiendo alcanzar resultados muy prometedores, obtenindose productos de superior actividad elicitora que los compuestos actualmente comercializados. Aplicaciones mdicas. En los procesos biolgicos las proteasas ocupan un lugar altamente relevante, ya que son ellas las encargadas de procesar las pro enzimas (zimgenos) , digerir los receptores para evitar su reconocimiento, controlar la duracin de pptidos bioactivos, controlar la existencia de protenas defectuosas, digerir las protenas de los alimentos, entre otras muchas funciones. En las clulas 13

patolgicas como es el caso de las cancergenas las proteasas juegan un papel determinante, tanto en el crecimiento de tumores, como en su vascularizacin (angiognesis) y al mismo tiempo son un requisito indispensable para poder realizar el fenmeno de metstasis. De hecho, son ellas las que permiten liberar ala ulula de su entorno, para poder ingresar al torrente circulatorio e iniciar el cncer. Este fenmeno esta regido por un fino balance entre las proteasas existentes en la clula, las proteasas que excreta al medio y sus respectivos inhibidores naturales que las mismas clulas producen. Cuando este balance se altera (estado patolgico) y las proteasas actan sobre las protenas de la matriz extracelular, se inicia el proceso de liberacin de clulas malignas, inicindose as el cncer. Es aqu donde los inhibidores de proteasas extrados de las plantas , pueden jugar un papel teraputico, al inhibir la actividad de esas proteasas, impidiendo as su liberacin y por tanto la metstasis. Probando los distintos inhibidores que hemos aislado de las distintas plantas, encontramos que tanto el inhibidor de chan como el del frjol tpari disminuan el avance de las clulas malignas, principalmente el inhibidor del frjol tpari, el cual mostr un importante efecto sobre algunos cultivos de lneas celulares cancergenas, impidiendo la liberacin de las clulas. Este efecto fue selectivo y dependiente de la concentracin, detectndose a dosis muy bajas de este compuesto. Actualmente se est determinando sobre que espectro de lneas celulares acta, as como sobre cules son las proteasas blanco sobre las que ejerce su efecto, a fin de entender su mecanismo molecular reaccin en ese importante proceso patolgico. Finalmente se ha trabajado con otras protenas tambin relacionados con los mecanismos de defensa de las plantas, como son las lectinas de las cuales hemos detectado que tambin tienen una actividad sobre clulas cancergenas, en este caso disminuyendo la proliferacin celular. Esta molcula tambin participa en la defensa de la planta, a travs de los mecanismos de oxidacin, propiciando la formacin de especies reactivas al oxgeno. 5. Comportamiento de plantas transgnicas de tabaco contra patgenos e insectos Las plantas para sobrevivir han tenido que desarrollar la capacidad de adaptarse a un medio hostil, mediante la expresin de una gran diversidad de respuestas, que les permiten hacer frente a algn agresor en situaciones de agobio ambiental. Estos sistemas de defensa incluyen protenas, molculas de seal y metabolitos secundarios involucrados no slo en defensa, sino en repelencia, tolerancia y dems. Cuando ocurre un dao mecnico o herida en la planta, se desencadenan una serie de eventos bioqumicos y moleculares idnticos a los que ocurren como consecuencia del ataque de insectos. La respuesta de un gen a una herida, por tanto es una indicacin de la respuesta de defensa al ataque por insectos. Los peroxisomas estn relacionados con la produccin y degradacin del perxido de hidrgeno, pero tambin son los organelos encargados de degradar cidos grasos y dependiendo de su localizacin pueden ser separados en glioxisomas, peroxisomas de hojas y no especializados. Los glioxisomas juegan un papel importante en la conversin de lpidos a carbohidratos en la beta oxidacin, misma ruta que es inducida por una serie de factores de transcripcin conocidos como receptores activados de proliferadores peroxisomales (PPAR), y que inducen la expresin de genes implicados en la beta oxidacin. Se trabaj con lneas transgnicas de tabaco, T2 y T5, en las que se insert el gen que codifica para los genes receptores activadores de la proliferacin de peroxisomas (PPAR), para determinar posibles similaridades en los mecanismos de regulacin en la proliferacin peroxisomal de plantas y animales. Dichas plantas transgnicas tuvieron cambios morfolgicos en las hojas y hubo una gran variacin en el contenido de cidos grasos de las transgnicas con respecto al tipo silvestre, donde en general los 14

cidos grasos saturados fueron ms abundantes en los transgnicos y los insaturados ms deficientes, y muchos cidos grasos no fueron detectados. La lnea T2 fue la que present los mayores cambios en el tamao de la hoja, siendo ms grande y mucho ms corrugada con respecto al tipo silvestre que las otras lneas, adems de presentar floracin mucho antes que los otros fenotipos. Pero entonces, para qu determinar similaridades entre los mecanismos de regulacin en la proliferacin peroxisomal entre plantas y animales, pues porque hay publicaciones de artculos que demuestran que existe una interrelacin entre las diferentes rutas de defensa de las plantas y los cidos grasos, ya que estos son precursores de importantes molculas de seal. Y en este caso resalta el cido linolnico (18:3) como precursor de las mismas, divido a la gran variacin que muestra en las lneas transgnicas. Entonces, bajo este contexto, se plante el propsito de ver cmo responden stas lneas transgnicas, con el metabolismo de los cidos grasos alterados, a la agresin contra bacterias patgenas e insectos. Para ver si exista una respuesta diferencial al ataque contra bacterias patgenas se dise un experimento con distintos organismos que se sabe atacan al tabaco, y lo que se hizo fue infiltrar en la 4 hoja de las plantas de tabaco una solucin de un buffer de NaPO4 y bacterias de aproximadamente 0.3 unidades de absorbancia para cada bacteria y un tercer grupo de plantas como control con puro buffer. Para el ensayo de resistencia contra insectos, se diseo un experimento con mosquita blanca, en el que se aislaban en jaulas una planta de cada lnea y el control. A cada planta previamente se le pusieron 25 mosquitas adultas con una clip cage para que ovipositaran en una sola hoja y se dejaron 36 horas a 27 C, luego se retiraron las mosquitas adultas y las plantas se mantuvieron aisladas por 17 das, mientras el 70 % eclosionaban con el propsito de ver s hay alguna diferencia en el nmero de mosquitas eclosionadas o sin eclosionar en cada hoja infestada. Resultados del ensayo con bacterias. Las plantas de tabaco inoculadas con P. s. helianthis se necrosaron completamente 3 das despus de la infiltracin y no dio tiempo de medir ninguna reaccin diferencial entre las lneas. Por otro lado, las bacterias infiltradas con P. s. Tagetis presentaron una reaccin hipersensible que es una reaccin de respuesta rpida en la que la planta mata todas las clulas de alrededor de la lesin o infeccin evitando que el patgeno se disemine. En las plantas infectadas con P. s. Tagetis se midi el rea de la lesin en las lneas transgnicas y el control y se compar contra las mismas lneas inoculadas con el buffer y se encontr que el rea de lesin entre el control y T5 infectados con Tagetis no tuvieron diferencia entre s, pero s la hubo contra T2. Y entre las tres lneas inoculadas con buffer no hubo diferencias significativas, sin embargo s presentaron un rea de lesin mucho menor con respecto a las que fueron infectadas. Resultados del ensayo con mosquita blanca. En este ensayo, se contaron el nmero de mosquitas eclosionadas contra el nmero de mosquitas no eclosionadas, y se encontr que entre las plantas control y T2 no hubo diferencia significativa, sin embargo s la hubo con respecto al nmero de mosquitas eclosionadas en T5 que fue mucho menor. Una vez obtenidos los resultados del ensayo de las plantas inoculadas con P. s. tagetis y con el buffer de NaPO4, se pulveriz el tejido infectado en nitrgeno lquido y se extrajo el RNA para hacer un northern, tcnica de electroforesis que consiste en la separacin de las diferentes secuencias de ARN por su peso molecular o tamao. Se corri un gel de agarosa desnaturalizante con el RNA para separarlo y se transfiri a una membrana de nitrocelulosa a la que se agrega una sonda radiactiva. La sonda elegida fue la ACCO, ya que es un metabolito secundario en la ruta de defensa de las plantas y su presencia indicara que las lneas transgnicas presentan una reaccin ante al ataque por patgenos. 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 15

Tc T2 T5 % Eclosionadas X % No eclosionadas X 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Tagetis Buffer REAS Tc T2 T5 Esta placa muestra que hay expresin del gen de la ACCO en todas las plantas, pero es mucho menor en la lnea T2. A partir de los resultados obtenidos en los anteriores ensayos, pude concluir que s hay una respuesta diferencial en las diferentes lneas transgnicas de Tabaco, debido a la alteracin de su metabolismo de los cidos grasos. 6. Investigaciones: 6.1. Coevolucin plantasanimales Las mariposasHeliconius se alimentan casi en forma exclusiva de polen y nctar de las flores de Passiflora (gnero de plantas a las que pertenece por ejemplo nuestra enredadera Mburucuy o Pasionaria). Estas plantas producen sustancias de las que deriva el cianuro para protegerse de los insectos herbvoros. Pero las Heliconius lo pueden procesar. Sus orugas lo ingieren al comer las hojas y sintetizan su propio veneno, mientras que las mariposas adultas lo obtendran a partir del polen. El predador desprevenido con capacidad de aprendizaje (como las aves) que capture una de estas mariposas sabr que no debe intentarlo nuevamente. Recordar los colores de las Heliconius que actan como una gran seal luminosa advirtiendo: "no intenten comerme, soy txica". Otros gneros de mariposa simplemente "copian" los colores, favorecindose de esta caracterstica. En el sector Cataratas del Parque Nacional Iguaz el Ambay (Cecropia pachistachya) es uno de los 16

rboles ms frecuentes. Tienen el tronco recto con compartimentos huecos separados por tabiques donde viven hormigas del gnero Azteca. Las agresivas hormigas protegen su territorio, en este caso el rbol, contra diversos herbvoros como las hormigas podadoras. A cambio obtienen refugio y alimento de estructuras especiales llamadas cuerpo de Mullerian, que son paquetes de hidratos de carbono situados en la axila de las hojas. Muchas especies utilizan las hormigas para defensa atrayndolas con estructuras glandulares llamadas nectarios extraflorales. Se ubican en cualquier parte de la planta que no sean las flores, de all su nombre. La produccin de nctar, lquido azucarado, atrae a las hormigas, las que protegen a la planta (su alimento) de otros predadores. (Foto: nectarios extraflorales en hoja de Turnera ulmifolia) Muchas especies aprovechan la visita de las hormigas para la dispersin de las semillas. Para ello las semillas presentan estructuras atrayentes como carnculas y arilos. La carncula de la semilla del Ricino es una excrescencia del tegumento externo de la semilla rico en aceites (elaiosomas). El arilo est presente en numerosos gneros (Lychnis), tienen abundantes aceites y almidones y se forma a partir de diferentes partes de la semilla.

6.2. Cientficos descubren un gen que inmuniza a las plantas contra los hongos El grupo cientfico que dirige el profesor del departamento de Biotecnologa de la Universidad Politcnica de Madrid (UPM), Antonio Molina, junto con investigadores alemanes y estadounidenses, ha identificado un componente bsico de inmunidad de las plantas a los hongos patgenos, hasta ahora desconocido. El descubrimiento de este gen de resistencia, al que los investigadores han denominado PEN2 (penetracin), supone "un gran paso dentro del conocimiento del mecanismo de defensa de las plantas", explic Molina. Este gen resistente fue identificado en la planta Arabidopsis thaliana, una especie modelo en la que el grupo de investigacin del Departamento de Biotecnologa de la UPM ha centrado sus investigaciones, publicadas en el ltimo nmero de la revista Science. Segn explic, las plantas se exponen a gran cantidad de patgenos de los que slo un reducido nmero es capaz de infectar una especie vegetal, y ello significa que la planta presenta una resistencia de "no husped" cuando el patgeno es incapaz de infectarla. Hasta el momento se crea que esta resistencia de una planta a los patgenos dependa de mecanismos pasivos como la estructura de la pared celular o la existencia de sustancias antimicrobianas en su superficie, pero se ha demostrado que contribuye una respuesta inmune activa. "Hasta este momento se pensaba que era el patgeno el que no era eficiente cuando no consegua infectar a una planta", explic Molina. Ahora se sabe que "las plantas tienen un mecanismo de defensa basal", adems de "varias etapas de defensa con barreras consecutivas", que el patgeno debe superar y que determinan si la planta es susceptible o resistente. Segn los investigadores, la prdida de funcin de PEN2 hace que las plantas sean ms susceptibles a enfermedades causantes de graves en cosechas, como el mildiu de la patata, o determinados hongos necrotrofos, y de ello se deduce que es un componente bsico del sistema de inmunidad innata de las plantas.

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Entre las aplicaciones de este descubrimiento destaca la posibilidad de la utilizacin de estos componentes en el desarrollo de fungicidas naturales o "verdes", con un amplio espectro de accin frente a diferentes enfermedades. GLOSARIO: Plantas C3: son las plantas cuyo sistema fotosinttico de fijacin de CO2 se produce exclusivamente con la enzima Rubisco que toma el CO2 y lo liga a una pentosa, siendo el primer producto de fotosntesis una triosa, es decir un azcar de 3 carbonos (3fosfoglicerato); en consecuencia C3. Plantas CAM o MAC: son aquellas que poseen adems de la Rubisco la enzima PEPcarboxilasa. La PEPcarboxilasa capta en la noche, a estoma abierto, el CO2 y lo fija a malato. El malato se acumula en altas concentraciones en la vacuola como cido mlico bajando el pH (acidificando el jugo vacuolar, de all metabolismo cido.) Durante el da, a estoma cerrado, el acido mlico se decarboxila (se hace menos cido) y el CO2 antes fijado se une ahora por la Rubisco a una pentosa en el estroma del cloroplasto formando el glicerato caracterstico resultante de la reaccin. Rubisco: enzima 1,5difosfatocarboxilasa/oxidasa. Corresponde ms o menos al 50% de las proteinas presentes de una hoja. La enzima capta el CO2 disponible en el Ciclo de Calvin formando 3fosfoglicerato. Sin embargo, es capaz de aceptar tambin O2 y lo realiza en un ciclo llamado "fotorespiracin" por el cual la eficiencia de fijacin del CO2 en las plantas C3 puede ser relativamente baja a alta irradiacin. Especies reactivas de oxgeno (ROS): se refiere a los distintos cambios electrnicos y de carga que puede tomar el oxgeno; formas todas reactivas y que daan la estabilidad celular. Ocurre cuando hay exceso de electrones que pueden ser donados al O2 a nivel de la cadena de transporte de electrones en mitocondrias y cloroplastos. Protena D1 del Sistema Pigmentario II: protena de 32 kDa perteneciente a dicho sistema pigmentario envuelta en el transporte inicial de electrones derivado de la fotolisis del agua y en la produccin de O2 como consecuencia de lo anterior. Nematodos: flum de gusanos unisexuales, de cuerpo cilndrico y delgado, sin segmentar, y cubierto por una cutcula; existen formas libres y parsitas. Micoplasma: microorganismo unicelular de accin patgena, de pared celular poco diferenciada y con gran variedad de formas. Fungicida: agente que destruye los hongos. Patognesis: origen y desarrollo de las enfermedades. Lisozima: es una enzima muy ampliamente distribuida entre los seres vivos, desde virus a eucariota. Tubrculo: es un tallo subterrneo modificado y engrosado donde se acumulan los nutrientes de reserva para la planta. Cistena: es uno de los veintids aminocidos que utilizan las clulas para sintetizar protenas. Est codificada en el ARN mensajero como UGU o UGC. Quitosana: derivados de quitina.

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PEN: enzima localizada en la membrana de los peroxisomas. Protenas PR: protenas implicadas en la patognesis, que limitan la accin del patgeno de la planta. PGIP: es una protena secretada y localizada en la matriz extracelular. BIBLIOGRAFA: www.3w.agroinformacion.com www.bios.biologia.umich.mx www.ira.investav.mx www.biologia.edu.ar/plantas www.axxon.com www.ibmb.csic.es www.cienciahoy.retina.ar www.solociencia.com/biologia www.dinpo.ugto.mx Revista Creces. Julio 2001. Universidad Diego Portales Portal web: www.creces.cl Biologa. Sanz Esteban M; Serrano Barrero S; Torralba Redondo B. Ed. Oxford. Proyecto EXEDRA. 21

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