Gua Gentica Variacin gentica molecular

CBI514
Instituto de Ciencias Naturales Facultad de Medicina Veterinaria y Agronoma.

Dr. Mauricio Reyes C.

INTRODUCCION Debido a que la gentica es el estudio de las diferencias heredadas, el anlisis gentico no sera posible sin variantes. En la unidad anterior hemos analizado diversas variantes, en esta unidad consideraremos su origen. Cmo surgen las variantes genticas? Dos son los principales procesos responsables de la variacin gentica: la mutacin y la recombinacin. La mutacin es la fuente de la variacin gentica y, por lo tanto, del cambio evolutivo. Aparecen nuevo alelos debido a mutaciones espontaneas y causadas por la radiacin o sustancias qumicas del ambiente. Los nuevos alelos ahora estn sujetos a la segunda fuente de variacin: la recombinacin. Esta es el resultado de la agrupacin de genes en nuevas combinaciones. El termino mutacin se refiere a diversos cambios que sufre el material gentico, que puede ser de simples cambios de unos pocos nucletidos hasta la desaparicin de un cromosoma completo. Las mutaciones que ocurren en genes individuales se les denomina mutaciones gnicas, mientras que aquellas que afectan la estructura o numero de los cromosomas se conocen como mutaciones cromosmicas.

MUTACIONES GENICAS El material gentico puede ser alterado por agentes ambientales, y tambin en forma espontnea por procesos que normalmente afectan al ADN. Ud. ya conoci las aberraciones cromosmicas que se producen cuando el dao en el material gentico es de tal magnitud que puede romper cromosomas y alterar el cariotipo. Sin embargo, generalmente el dao en el ADN no afecta grandes extensiones cromosmicas, sino que, afecta uno o unos pocos nucletidos. Este tipo de mutaciones se denomina mutaciones gnicas o mutaciones puntuales. Una mutacin es todo cambio permanente en la secuencia del ADN de un organismo, esta debe ocurrir en la lnea germinal. Las mutaciones gnicas ms comunes consisten en la sustitucin de un nucletido por otro, en la delecin o prdida de unos pocos nucletidos, o en la insercin o intercalacin de uno o varios nucletidos en la molcula de ADN. Todas mutaciones gnicas generan cambios en la informacin contenida en el gen afectado e implican la produccin de una protena distinta de la esperada, o incluso la no produccin de la protena. El cambio de un nucletido en la secuencia de un gen da lugar a un codn diferente y, en consecuencia, a la presencia en la protena de un aminocido que no corresponde (excepto cuando el nuevo codn originado por la mutacin es sinnimo, es decir, codifica para el mismo aminocido original). Muchas veces el cambio en un slo aminocido en una molcula proteica altera totalmente la funcin de la protena, ya que el modificarse la estructura primaria, tambin se alteran las estructuras secundarias y terciarias. La delecin o la intercalacin de un nucletido en un gen modifican el marco de lectura desde el sitio de la mutacin hasta el codn de trmino. Esto suele traducirse en la produccin de una protena aberrante o ms frecuentemente en la interrupcin de la sntesis de la protena al aparecer un codn de terminacin antes del lugar que corresponde. En un organismo los blancos para las mutaciones pueden ser las clulas somticas o las clulas germinales. En el primer caso, si bien afectan al fenotipo de los individuos no pasan a la descendencia. Cuando la mutacin afecta las clulas germinales suelen transmitirse a la descendencia. Cuando el gen que codifica una protena involucrada en la morfognesis ha mutado, la consecuencia de la mutacin puede traducirse en malformaciones congnitas. En otros casos las protenas alteradas dan lugar a alteraciones funcionales, como ocurre con la hemoglobina S en la anemia de clulas falciformes al cambiar un slo aminocido (valina en lugar de cido glutmico) en la estructura primaria de la protena. Tambin, pueden producirse trastornos metablicos, cuando se alteran enzimas de las distintas vas metablicas, los llamados errores congnitos del metabolismo. Finalmente, las mutaciones tambin pueden afectar genes imprescindibles para la supervivencia del organismo, llegando a ser letales; o afectar genes que involucrados en la proliferacin celular terminando en procesos cancerosos. En general las mutaciones son perjudiciales para el organismo portador, por lo tanto es importante tomar los resguardos correspondientes al trabajar con sustancias mutagnicas como los agroqumicos (malatin, paratin, etc.), no exponerse a ambientes con elevados niveles de radiaciones ionizantes (luz ultravioleta, rayos X o gamma) y no desarrollar hbitos riesgosos, por ejemplo, los hidrocarburos policclicos provenientes de la combustin del tabaco son altamente mutagnicos y por ende cancergenos.

Desde el punto de vista de su origen las mutaciones se pueden clasificar en espontneas o inducidas por un mutgeno (agente fsico o qumico que aumenta la frecuencia de mutaciones en el ADN). Cuando una purina es reemplazada por una purina o una pirimidina reemplaza una pirimidina se habla de transicin. Por otra parte, cuando purina es reemplazada por pirimidina, o viceversa, se habla de transversin. SIEMPRE LA MUTACION OCURRE AL REPLICARSE EL ADN, POR LA INCORPORACION DE NUCLEOTIDOS ERRONEOS EN EL SITIO MUTADO. Desaminacin Despurinacin Tautomera Cambio marco lectura por errores de replicacin Anlogos de bases (5-Bu y 2-AP) Dao de las bases (Hidroxilamina y cido nitroso) Luz ultravioleta (Dmeros de pirimidinas )

espontneas Mutaciones gnicas Inducidas

MUTACIONES ESPONTANEAS. Desaminacin. La desaminacin es un proceso normal en el que las bases nitrogenadas citosina y adenina pierden sus grupos amino (-NH2). Esto cambia la estructura de los enlaces puente de hidrgeno que la base puede formar, si el dao no es reparado cuando ocurra la duplicacin de ADN se producir la mutacin por apareamiento de la base mutada con otra base que no corresponde. La citosina se desamina a uracilo (C -> U) que puede aparearse ahora con la adenina (Fig. 1A). Como este es un proceso natural en la clula existe un mecanismo de reparacin, mediado por la enzima uracil ADN-glicosilasa, que elimina del desoxiuracilo de la molcula de ADN. Muchas veces el ADN es modificado en la clula por metilacin (agregando grupos metilos -CH3), la desaminacin de la 5-metil-citosina produce timina (5mC -> T) (Fig. 1B), un componente normal del ADN que escapa a los mecanismos de reparacin produciendo una transicin desde GC a AT (GC --> AT) (Fig. 1C).

c)

Figura N1. Desaminacin de citosina. La adenina tambin sufre desaminacin a Hipoxantina (A -> H), molcula que puede formar pareja con citosina, produciendo una transicin AT-->GC (Fig. 2).

Figura 2. Desaminacin de Adenina. Despurinacin. La despurinacin ocurre cuando una purina se desprende de su desoxirribosa, de modo que el nucletido afectado pierde su base. Como consecuencia, queda en el gen un sitio apurnico, un nick, un sitio sin informacin a pesar de no haberse cortado el ADN (fig.3).

Figura 3. Despurinacin. Tautomera. Las bases nitrogenadas que conforman el ADN pueden existir en distintas formas qumicas denominadas tautmeros. Los tautmeros son ismeros que difieren en la posicin de sus tomos que forman los enlaces puente de hidrgeno. Los tautmeros de las bases nitrogenadas estn en equilibrio, el que se encuentra normalmente desplazado hacia las formas ceto (-C=O), sin embargo, en forma poco frecuente aparecen las formas imino (-C=N-H) o enol (-C-O-H). La forma imino de la citosina (denotada por C*) forma enlaces con la adenina, la forma enol de la timina (T*) forma enlaces con la guanina (Fig. 4b), la forma imino de la adenina (A*) forma enlaces con la citosina, y la forma enol de guanina forma enlaces con la timina.

Figura 4. Formas normales y tautomricas de las bases nitrogenadas. En a) se muestran las formas normales de las bases nitrogenadas y su apareamiento. En b) se muestran la forma enol e imino de la timina y citosina respectivamente y los apareamiento que producen. Las tautomeras producen mutaciones (transiciones) durante la replicacin del ADN, como se muestra en la figura 5.

Figura 5. Transicin producto de tautmeros despus de la replicacin. Cambio marco lectura por errores de replicacin. Normalmente los cambios en el marco de lectura ocurren en secuencias repetidas al producirse emparejamientos errneos desplazados de las bases. Este tipo de emparejamiento produce deleciones, por desplazamiento de la hebra molde; o adiciones por desplazamiento de la hebra sintetizada (Fig. 6).

Figura 6. Errores de la replicacin. Delecin y adicion. MUTACIONES INDUCIDAS. Anlogos de Bases. Los anlogos de base son compuestos qumicos de estructura muy similar a las bases nitrogenadas normales y que forman enlaces distintos a las bases que han sustituido. Existen muchas purinas y pirimidinas naturales o sintetizadas en laboratorios, pero slo 5 estn presentes en la estructura de los cidos nucleicos. Los anlogos de base inducen transiciones luego de ser incorporados al ADN, al producirse la replicacin de la molcula alterada. El 5-bromo-uracilo (5-BU) es un anlogo de la timina, pero cambia frecuentemente a la forma enol (se tautomeriza) y se empareja as con la guanina. Si durante la replicacin del ADN se incorpora 5-BU depender del estado de isomerizacin de este compuesto (ceto 5-BU o enol 5-BU*) que base se emparejar con l en la hebra sintetizada (fig. 7).

Figura 7. Br-uridina. Apareamiento de las forma cetnica y enlica de la Br-uridina.

La 2-amino-purina (2-AP) es otro anlogo de base es un anlogo de la adenina que puede emparejarse indistintamente con timina o citosina. Nuevamente si durante la replicacin del ADN la 2-AP inducir transiciones (Fig. 8).

Figura 8. Formas de apareamiento de la 2 Aminopurina. Dao de las bases. Muchos agentes mutagnicos producen daos en las bases nitrogenadas, modificando su estructura qumica. La hidroxilamina o HA (NH2-OH) es un mutgeno efectivo que altera la estructura de la citosina de modo que se empareja con la adenina. As, la HA es un inductor especfico de transiciones GC --> AT (Fig. 9b). Otro mutgeno que altera la estructura qumica de la adenina desaminandola a hipoxantina (H), es el cido nitroso o AN (HNO2). Como Ud. sabe la hipoxantina se emparejar con la citosina, induciendo transiciones AT --> GC (Fig. 9a).

Figura 9. Agentes mutagnicos. a) efecto del acido nitroso sobre las bases nitrogenadas y transiciones que produce. b) efecto de la hidroxilamina sobre la citosina y transicin que produce. Dmeros de pirimidina. La luz ultra violeta (uv) causa dimerizacin de pirimidinas adyacentes en el DNA al formarse entre ellas una unin covalente. Los dmeros timina-timina pueden considerarse como el principal producto de estas radiaciones (fig. 10). De manera ocasional, se pueden formar dmeros citosina-citosina o citosina-timina. Estas dimerizaciones interfieren con la replicacin normal del ADN, lo que conduce a mutaciones. Los dmeros de timina son normalmente removidos por un sistema especfico de enzimas existiendo dos mecanismos de reparacin. Reparacin directa por la enzima ADN fotoliasa que se une en la oscuridad a los dmeros de timina. En presencia de luz, la enzima rompe los enlaces del dmero utilizando energa lumnica, para luego liberarse del ADN. Reparacin por escisin o corte utilizando la escinucleasa ABC. Esta endonucleasa formada por subunidades codificadas por los genes uvrA, uvrB, uvrC; es capaz de detectar dmeros de timina realizando un corte en la cadena de ADN a ambos lados del dmero. El segmento que incluye al dmero es separado de la hebra normal del ADN por la ADN helicasa II (producto del gen uvrD). La reparacin se completa cuando la ADN polimerasa I y ADN ligasa se encargan de restaurar el trozo perdido colocando los nucletidos y uniendo los extremos de estos, respectivamente.

Figura10. Dmeros de timina.

CAMBIOS EN LA ESTRUCTURA CROMOSOMICA Los cromosomas poseen una organizacin definida, pero no son inmutables. Ocasionalmente pueden fracturase y alterar as su estructura normal, dando origen a las aberraciones o mutaciones cromosmicas. Agentes fsicos y qumicos pueden causar roturas en los cromosomas. La dotacin cromosmica particular de un individuo de una determinada especie se conoce como cariotipo. El cariotipo se define por el nmero y morfologa de los cromosomas. Normalmente las aberraciones cromosmicas se detectan al confeccionar el cariotipo del individuo sospechoso de portar una aberracin, y al visualizar diferencias en la morfologa de los cromosomas respecto al cariotipo normal. Las aberraciones cromosmicas pueden clasificarse en dos clases generales: a) las que afectan el nmero de genes en el cromosoma y b) las que afectan la disposicin de los genes en el cromosoma. Existiendo cuatro tipos: duplicacin, delecin, inversin y translocacin. Duplicacin. Delecin o deficiencia. Inversin. Translocacin.

a) Nmero Aberraciones Cromosmicas a) Disposicin

Duplicacin. La duplicacin ocurre cuando un segmento de un cromosoma se encuentra repetido. En la figura 11, se observa el apareamiento en paquiteno de un par cromosmico en un individuo que porta una duplicacin heterocigota. Las duplicaciones sirven para investigar los efectos de "dosis gnicas", debido a que gracias a ellas un alelo podra estar presente ms de dos veces en el genoma de un individuo.

Figura 11. Duplicacin. Cromosoma con duplicacin y su apareamiento en paquiteno. Delecin o deficiencia. La delecin se produce por la prdida de un segmento cromosmico. Cuando falta un segmento cromosmico, tambin faltan los genes situados en el segmento perdido. Las consecuencias genticas de este fenmeno pueden ser letales en estado homocigoto, dependiendo de la extensin de la delecin y la importancia de los genes faltantes. El apareamiento en paquiteno de un par de cromosomas en un individuo con una delecin heterocigota se muestra abajo en la figura.

Figura 12. Delecin. Cromosoma con delecin y su apareamiento en paquiteno. Las deleciones o deficiencias sirven para confeccionar mapas citolgicos (fsicos) de los cromosomas. Actualmente, este tipo de mapeo con deleciones se realiza con tcnicas moleculares de hibridacin in situ con fluorescencia (tcnica conocida como FISH). Inversin. Las inversiones ocurren cuando un cromosoma se fractura en dos puntos, y la regin cromosmica flanqueada por los puntos de quiebre rota en 180. Las inversiones no involucran cambios en la cantidad total de material gentico que porta el cromosoma afectado, sino que alteran la ordenacin de los genes en el cromosoma. Citolgicamente, en las inversiones heterocigotas (donde un individuo porta un cromosoma normal y el otro invertido), tambin se observa un bucle en el apareamiento en paquiteno de los cromosomas. Considerando la posicin del centrmero relativa al segmento invertido, ellas se pueden clasificar en inversiones pericntricas (que incluyen el centrmero) e inversiones paracntricas (que no incluyen el centrmero en el segmento invertido). Ambos tipos de inversiones presentan destinos diferentes durante la meiosis al ocurrir un crossing-over. Los productos de la meiosis en un individuo heterocigoto para una inversin paracntrica son: a) una cromtida sin centrmero (que no migra en la meiosis), b) una cromtida con dos centrmeros (que se rompe al ser traccionada a ambos polos) y c) dos cromtidas con informacin gentica completa. De este modo, debido a la inversin, la mitad de los gametos son inviables por portar cromtidas con segmentos deficientes y duplicados, siempre que haya ocurrido un crossing-over en la regin donde se forma el bucle.

Figura 13. Inversin paracntrica.

La meiosis en un individuo heterocigoto para una inversin pericntrica son a) dos cromtidas con informacin gentica deficiente y duplicada, y b) dos cromtidas con informacin gentica completa. As, nuevamente como resultado de una inversin la mitad de los gametos son inviables por portar cromtidas con segmentos cromosmicos faltantes.

Figura 14. Inversin pericntrica. Traslocaciones. Las traslocaciones ocurren cuando debido a fracturas cromosmicas, dos pares de cromosomas no homlogos intercambian segmentos. Las traslocaciones ms interesantes desde el punto de vista gentico son las traslocaciones reciprocas heterocigotas. Citolgicamente, los cromosomas portadores de una traslocacin de este tipo adoptan en paquiteno una tpica configuracin en forma de cruz, con el fin de lograr un ntimo apareamiento.

Figura 15. Translocacin. La consecuencia gentica de las translocaciones recprocas heterocigotas es la semi-esterilidad (inviabilidad de gametos). Como resultado de la meiosis, las cromtidas migran de a pares a los polos, por lo tanto 2/3 de los gametos generados portaran segmentos cromosmicos deficientes y duplicados (inviables), mientras que, slo 1/3 portara la dotacin gentica completa. CAMBIOS EN EL NMERO DE CROMOSOMAS Otro tipo de mutaciones cromosomales son los cambios en el nmero de cromosomas. Ocasionalmente el nmero de cromosomas vara espontneamente como consecuencia de accidentes de maquinaria celular. Estos son la base para muchos cambios evolutivos en el tamao del genoma. El nmero bsico de cromosomas de un individuo representativo de una especie se denomina como nmero (o complemento) haploide y se denota por n, hay que distinguir dos tipos de cambios que afectan el nmero de cromosomas entre: a) los que afectan el nmero complementos haploides "completos" o euploidas y b) los que afectan en nmero de cromosomas de un complemento haploide particular o aneuploidas. NOTACION diploide (2n) a) euploidas o poliploidias triploide (3n) tetraploide (4n), etc. Cambio en el nmero de Cromosomas trismico (2n + 1) a) aneuploidas monosmico (2n - 1) nulismico (2n -2), etc.

Euploidas o poliploidas. El nmero haploide (n) corresponde estrictamente al nmero de cromosomas que portan los gametos. Muchas veces puede ocurrir que, en forma espontnea (en la naturaleza) o inducida (por el hombre) se dupliquen los complementos haploide de un individuo, formndose as individuos que poseen en su genoma mltiplos del n. Estos fenmenos dan origen a organismos triploides (3n), tetraploides (4n), pentaploides (5n), hexaploides (6n), etc. Es importante distinguir de acuerdo a su origen, los autopoliplides de los alopoliploides. Producto de la presencia de a) autopoliploides mltiplos de n de la misma especie en el genoma de un individuo. euploidas o poliploidas Producto de la presencia de a) alopoliploides mltiplos de n provenientes de genomas de diferentes especies. En general las euploidas son de inters agronmico, pues han permitido la creacin de nuevas variedades vegetales poliploides (ms fuertes, ms resistentes o de mayor productividad), y adems la manipulacin cromosmica de especies animales y vegetales, como es la produccin de individuos triploides. Los triploides son usualmente autotriploides y se caracterizan por ser estriles debido a la imposibilidad de lograr correctos apareamientos de los cromosomas en la meiosis, en este categora se incluyen varios frutos sin semillas, como por ejemplo las naranjas. La principal ventaja de los poliploides en general es que, al poseer mayor cantidad de material gentico, se produce un aumento en el tamao de la clula y por lo tanto una mayor tamao del cuerpo, fruto, flor, tubrculo o semillas. En el caso particular de los tetraploides, los autotetraploides se originan en forma natural por la duplicacin espontnea de un genoma 2n a uno 4n, mientras que, alotetraploides son producto de hibridizacin natural entre especies evolutivamente emparentadas (ver el caso del trigo mas adelante) o creados experimentalmente por los investigadores agronmicos. En 1928 el investigador sovitico G. Karpechenko produjo el primer alotetraploide "sinttico". Los alotetraploides tambin son llamados amfidiploides. Evolutivamente hablando, las euploidas han sido el camino seguido por muchos animales (por ejemplo, los salmones) y plantas (por ejemplo el trigo, cuyo caso lo veremos con ms detalle). En el desarrollo del trigo han ocurrido al menos tres fenmenos de poliploidizacin (Figura 1). El primer trigo domesticado Triticum monococcum variedad monococcum fue un trigo diploide (genomas AA, 2n =14) seleccionado a partir de la especie silvestre Triticum monococcum variedad beoeticum. La variedad silvestre form espontneamente hbridos frtiles con otra especie de 7 pares de cromosomas, presuntamente Aegilops sp. (genomas BB, 2n =14), para dar origen al trigo alotetraploide silvestre Triticum turgidum variedad dicoccoides (genomas AABB, 2n = 4x = 28). A partir de esta ltima especie se domestic la variedad de trigo tetraploide cultivada, Triticum turgidum variedad dicocum (genomas AABB, 2n = 4x = 28). Posteriormente y de forma totalmente espontnea se origino el trigo alohexaploide actual, Triticum aestivum (genomas AABBDD, 2n = 6x = 42) por hibridizacin entre Triticum turgidum variedad dicocum cultivado y la especie silvestre diploide Triticum tauschii (genomas DD, 2n = 14). Otras especies vegetales poliploides de importancia econmica, es decir, cosechas comestibles cultivadas actualmente corresponden a: Soja (4x), Papa (2x, 4x, 6x), Avena (2x, 4x, 6x), Remolacha (2x, 3x, 4x), Centeno (2x, 4x), Colza (4x, 6x), Man (4x), Banana (3x), Naranja (2x, 3x), etc.

Figura 17. Generacin de trigos y triticales alopoliploides. Tomado de "La tercera revolucin verde" Francisco Garca Olmedo. 1998. Editorial Debate S.A, Madrid Espaa. 209pp. Aneuploidas. Las aneuploidas ocurren por la prdida o adicin de cromosomas al complemento haploide de un individuo. La causa de este tipo de mutacin normalmente es la no-disyuncin de los homlogos en la meiosis. Los principales ejemplos de aneuploidas provienen de la gentica humana y se asocian a sndromes como el de Down (trisoma 21). En los seres humanos, se ha demostrado que mientras mayor es la edad de la madre mayor es la tendencia a presentarse no disyunciones y posteriormente aneuploidas en el embrin. La notacin de las de las aneuploidas se rige por la siguiente regla: dado que la dotacin cromosmica de un individuo normal es 2n (diploide), la carencia o adicin de cromosomas se representa por la suma o resta de los cromosomas afectados. As, por ejemplo un individuo trismico (ejemplo; el sndrome de Klinefelter, hombre XXY) se representa por 2n + 1, un monosmico (ejemplo; el sndrome de Turner; mujer XO) como 2n - 1, un doble trismico (con cromosomas supernumerarios en dos pares) como 2n + 1+1, etc.

VARIACIN GENTICA MOLECULAR. TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE: ANLISIS Y APLICACIONES En la dcada de 1970, un gran nmero de descubrimientos y avances tecnolgicos condujeron a sorprendentes adelantos en la biologa molecular celular, basados en el anlisis y la manipulacin de macromolculas, en especial el DNA. No obstante, los genomas de los distintos organismos (an los ms simples) son demasiado grandes para efectuar un anlisis directo y detallado a nivel molecular. Por ello fue necesario desarrollar tcnicas que permitieran trabajar con fragmentos de tamao inferior provenientes de la molcula mayor. El descubrimiento de 2 tipos de enzimas dio un sustantivo impulso a estos desarrollos y permiti la tcnica de clonacin de DNA, que en la actualidad es de uso corriente en el laboratorio. El primer tipo de estas enzimas son las nucleasas o enzimas de restriccin que se caracterizan por cortar el DNA de cualquier organismo en secuencias especficas de unos pocos nucletidos, para generar un conjunto reproducible de fragmentos. El segundo tipo de enzima fueron las DNA ligasas, las cuales permiten insertar fragmentos de DNA de restriccin en vectores de DNA en proceso de replicacin para producir DNA recombinante. Posteriormente, las molculas de DNA recombinante pueden introducirse dentro de clulas hospedadoras, por lo general bacterianas, para obtener descendientes de una de estas clulas bacterianas aisladas la cual portarn la misma molcula de DNA recombinante. VECTORES DE CLONAMIENTO. Los plsmidos son molculas circulares de DNA bicatenario (dsDNA) separadas del DNA cromosmico de la clula. Estos DNA extracromosmicos, que se encuentran naturalmente en bacterias, levaduras y algunas clulas eucariontes superiores, existen en relacin parasitaria o simbitica con la clula husped. El tamao de los plasmidios vara desde unos pocos miles de pb hasta ms de 100 kilobases (kb). Al igual que el DNA cromosmico de la clula husped, el DNA plasmidial se duplica antes de cada divisin celular, as cada clula hija posee una copia de este DNA propagndose de generacin en generacin. Los vectores de DNA ms frecuentemente utilizados en la tcnica del DNA recombinante son los plsmidos o plasmidios y el bacteriofago de E.coli. Los plsmidos comnmente ms usados en tecnologa de DNA recombinante se replican en E.coli. De hecho, con el tiempo, ellos han sido manipulados de manera de optimizar su uso como vectores de clonacin de DNA. La mayora de estos vectores contienen prcticamente slo las secuencias de nucletidos esenciales para la clonacin de DNA: 1) un origen de replicacin, 2) un gen de resistencia a antibiotico y 3) una regin donde se pueden insertar fragmentos de DNA exgeno (sitio de multiple clonamiento o MCS). En general los plsmidos no permiten clonar grandes fragmentos de DNA (a lo ms aceptan 10 a 13 kilobases de DNA exgeno; 1kb = 1000 pb), pues la seleccin favorece los plsmidos pequeos. Esta es una limitacin, de modo que se han desarrollado otros vectores de clonacin que permiten clonar fragmentos de DNA de mayor tamao. Bacteriofagos. Algunos derivados del fago lambda permiten clonar glandes fragmentos de DNA. Debido a que la cpside del fago normalmente porta una molcula de DNA de aproximadamente 45Kb. Si se dejan en el DNA del fago slo los genes necesarios para su replicacin en E. coli de todas formas hay espacio suficiente para clonar fragmentos de 15 a 20 kilobases de tamao. Los vectores tipo bacteriofagos tambin deben cumplir los tres requisitos mencionados previamente para los vectores plsmidiales. Cosmidos. Existen vectores hbridos entre plsmidos y bacteriofagos que permiten clonar hasta 45 kb (45.000 pb). Estos vectores utilizan un sistema in vitro para empaquetar el DNA en las cpsides del bacteriofago, por lo que se requieren muy pocos genes del propios del fago en la molcula recombinante, liberandose as mucho espacio. Los csmidos se obtienen incorporando en un plsmido los sitios cos del fago lambda, los que son reconocidos por la maquinaria de empaquetamiento del fago. Estos vectores tienen le ventaja de que se pueden mantener in vivo como plsmidos y permiten la clonacin por empaquetamiento in vitro .del DNA dentro de una cpside. Vectores de expresin. Estos vectores permiten la expresin de las secuencias clonadas, al fusionar dichas secuencias con seales de inicio de transcripcin y traduccin. Esto hace el que el DNA forneo se transcriba y traduzca permitiendo la expresin gnica in vitro. LAS ENZIMAS DE RESTRICCIN Para clonar fragmentos especficos de DNA se deben producir estos y luego insertarlos en el DNA del vector. Para realizar el primer objetivo, se utilizan las enzimas de restriccin. Las enzimas de restriccin son protenas bacterianas que reconocen secuencias especficas de 4 a 8 pares de bases denominadas sitios de restriccin.

Dado que escinden el DNA al interior de la molcula, tambin son conocidas como endonucleasas de restriccin, para diferenciarlas de las exonucleasas que digieren los cidos nuclecos a partir de un extremo. Estas enzimas se encuentran en las bacterias y sirven para degradar DNA exgeno en un proceso llamado modificacin y restriccin. Las enzimas de restriccin reconocen secuencias de DNA palindrmicas especficas de unos pocos nucletidos y producen un corte generando extremos cohesivos, o bien extremos romos. En general, las enzimas que cortan el DNA generando extremos cohesivos son las ms adecuadas para recombinar molculas de DNA de distinto origen. Las enzimas de restriccin se denotan utilizando una abreviacin de tres letras (en cursiva) que identifican la bacteria en que se descubrieron y otras 3 que identifica la cepa de la que fueron aisladas, por ejemplo EcoRI, indica que la enzima fue aislada de Escherichia coli, cepa RI (Fig. 18).

Figura. N18. ENZIMAS DE RESTRICCIN. Se han purificado enzimas de restriccin de varios cientos de especies diferentes de bacterias, que permiten cortar las molculas de DNA en gran cantidad de secuencias distintas correspondientes a los sitios de reconocimiento de estas enzimas. Muchos sitios de restriccin, por ejemplo EcoRI, son secuencias cortas de repeticin invertida; esto es, la secuencia del sitio de restriccin es la misma sobre cada hebra de DNA cuando se lee en la direccin 5-3. Clonamiento: En los siguientes diagramas se describir brevemente una estrategia bsica de clonamiento. Se cortan el DNA (genmico o cDNA) y el plsmido vector con una enzima de restriccin que genere idealmente extremos cohesivos (FIG 19 A y B respectivamente)

FIG. N19A. DIGESTIN DEL DNA CON ENZIMAS DE RESTRICCIN.

Figura N19B. DIGESTIN DEL VECTORCON ENZIMAS DE RESTRICCION.

Figura 20. UNIN DEL VECTOR CON EL FRAGMENTO DE DNA. PRODUCCIN DE MOLCULA DE DNA RECOMBINANTE. Se junta el vector linealizado y el DNA blanco, se ligan los extremos cohesivos de ambas molculas con DNA ligasa, normalmente la del bacteriofago T4 (T4-DNA ligasa), para formar una molcula de DNA recombinante. Transformacin: El proceso de transformacin considera tres pasos principales. El primero de ellos implica permeabilizar la pared celular de manera de posibilitar el ingreso del vector plasmidial. La segunda etapa consiste a introducir el vector plasmidial mediante un shock trmico o bien en algunos casos utilizando un estmulo elctrico (electrotransformacin). Finalmente, la tercera etapa consiste en sumistrar al medio los nutrientes necesarios a las bacterias transformadas para crecer y expresar los genes adquiridos.

Fig.N21. Representacin esquemtica del proceso de transformacin en bacterias.

FIG. N22. . ETAPA DE PROPAGACIN DE LAS CLULAS TRANSFORMADAS.

FIG. N 23. . DETECCIN Y SELECCIN DE CLULAS TRANSFORMADAS.

REACCIN DE LA POLIMERASA EN CADENA En n 1983, Kary Mullis2 en la Corporacin Cetus desarroll la tcnica de biologa molecular que revolucion la investigacin gentica y con esto gan el premio Nobel en 1993. Esta tcnica, llamada reaccin de la polimerasa en cadena (PCR), transform la biologa biologa molecular en una herramienta de investigacin multidisciplinaria en un plazo de 5 aos a partir de su invencin. Muchas de las tcnicas de biologa molecular usadas antes de la PCR, eran laboriosas, consumidoras de tiempo y requeran un alto nivel de m maestra aestra tcnica. La tcnica de PCR ha tenido un alto impacto en cuatro reas principales: Mapeo gnico, clonacin, la secuenciacin del DNA y la deteccin de genes. La PCR ahora se utiliza como una herramienta de diagnstico mdico para detectar mutaciones especficas que pueden causar enfermedades genticas, se utiliza en investigaciones criminales e identificar sospechosos a un nivel molecular y ha sido una poderosa herramienta en la secuenciacin del genoma humano. Antes de la PCR el uso de las tcnicas de biologa molecular para el diagnstico teraputico,

forense, farmacutico o mdico no era prctico o rentable. El desarrollo de la tecnologa de PCR cambi estos aspectos de la biologa molecular de una ciencia difcil a una de las herramientas ms accesibles y ms usadas en la investigacin gentica y mdica. El objetivo de PCR es producir una cantidad relativamente grande de un fragmento especfico de DNA a partir de una cantidad muy pequea. Tcnicamente hablando, esto significa la amplificacin enzimtica controlada de una molcula de DNA que contiene una secuencia especfica de inters. El templado puede ser cualquier forma de DNA doble hebra como el DNA genmico. La amplificacin por PCR requiere la presencia de al menos de una molcula de DNA templado. En este trabajo prctico, DNA genmico humano se aislar de estudiantes a partir de clulas de la mucosa interna de la mejilla. Una de las razones principales que hacen de la PCR una herramienta de tan gran alcance es su simplicidad y especificidad. Todo lo que se requiere es tampn de reaccin, cuatro nucletidos (deoxynucletido trifosfatos de adenina, guanina, timina y citosina), una DNA polimerasa, dos partidores o sebadores y minsculas cantidades del templado que se desea amplificar. La especificidad viene de la capacidad de dirigir y amplificar un segmento especfico de DNA (o de un gen) a partir de un genoma completo. La tcnica de PCR hace uso de dos principios bsicos: 1.- La hibridacin por complementariedad del DNA. 2.- La sntesis de DNA por la DNA polimerasa. La hibridacin por complementariedad del DNA ocurre cuando dos diferentes oligonucleotidos (partidores) se unen a sus secuencias complementarias respectivas en el templado. Los dos partidores son diseados y sintetizados en el laboratorio con una secuencia nucleotdica especfica de manera tal que pueden unirse a los extremos de la secuencia de DNA doble hebra que se amplificar. Antes de que una regin de DNA pueda ser amplificada, uno debe identificar y determinar la secuencia de una regin ro arriba y otra ro abajo de la fragmento de inters. Estas regiones se utilizan entonces para disear los partidores que servirn como puntos de partida para amplificar el DNA. El DNA doble hebra del fragmento de inters es denaturado para separar ambas hebras antes de que la sntesis comience. La DNA polimerasa usada en PCR, debe ser una polimerasa termoestable debido a que para denaturar ambas hebras del DNA se utilizan altas temperaturas (94 C). La DNA polimerasa termoestable (Taq), que realiza la polimerizacin, fue aislada de una bacteria thermoflica (Thermus aquaticus), que vive a altas temperaturas naturalmente. Las dos hebras se crean a partir del templado original en cada ciclo completo de la reaccin. Esto crea una situacin del crecimiento exponencial. Una vez que el DNA de inters sea amplificado suficientemente, este puede ser visualizado en electroforesis en geles de agarosa. Esto permite determinar la presencia o la ausencia de los productos de PCR deseados y que eventualmente podran determinar las semejanzas y las diferencias entre individuos.

Figura 24. Representacin esquemtica de la tcnica de PCR

SECUENCIACIN DEL ADN. Llegar a conocer la secuencia completa de bases del genoma de un organismo es el objetivo de cualquier proyecto genoma. Desde el punto de vista gentico no slo se requiere la cartografa bsica de un genoma (secuencias de bases), sino que es necesario integrar ste mapa fsico con uno gentico, de modo que los genes y las caractersticas ms interesantes del genoma estudiado puedan ser localizados dentro de secuencia de DNA obtenida. Actualmente existen dos mtodos para secuenciar rpida y eficientemente el DNA, ambos mtodos fueron desarrollados en la dcada de los aos 70. El primer mtodo se llama de terminacin de la cadena, en el que la secuencia de una molcula de DNA de hebra simple es determinada por medio de la sntesis enzimtica de cadenas de nucletidos complementarias, las que son finalizadas en posiciones especficas. Este mtodo tambin es llamado didesoxi y fue publicado por Sanger, Nicken & Coulson en 1977. El segundo mtodo llamado de la degradacin qumica o de destruccin de bases, implica la degradacin de un DNA doble hebra por medio de tratamientos qumicos que cortan la molcula en posiciones nucleotdicas especficas. Este mtodo fue desarrollado por Maxam & Gilbert, tambin en 1977. Inicialmente ambos mtodos fueron muy populares, sin embargo actualmente el mtodo de terminacin de cadena ha ganado ms adeptos gracias a que utiliza reactivos no txicos, y a que ha sido automatizado utilizando dideoxi nucletidos fluorescentes.

MTODO DE TERMINACIN DE LA CADENA O DE SANGER El mtodo de la terminacin de la cadena se basa en el principio de que cualquier molcula de DNA de hebra simple puede ser separada de otras molculas sobre la base de su longitud al realizar una electroforesis en gel de poliacrilamida. Esta metodologa permite distinguir en un gel todas molculas de DNA de hebra simple que difieren en una sola base, y cuyo tamao se encuentre dentro del rango de longitud que va desde 10 a 1500 nucletidos. En resumen este mtodo involucra la sntesis de una nueva hebra de DNA, utilizando para este fin un partidor especfico para la regin que se desea secuenciar, y se utilizan los cuatro desoxiribonucleotidos trifosfato (dATP, dTTP, dCTP y dGTP), adems de pequeas fracciones de didesoxinucleotidos (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP, ver figura abajo).

FIGURA 25. DIDESOXINUCLEOTIDO.

La polimerasa que realiza la sntesis de la nueva hebra de DNA no discrimina entre los dNTPs y los ddNTPs, de modo que incorpora estos ltimos en forma aleatoria (los ddNTPs) bloqueando la elongacin de la hebra de DNA debido a la carencia del grupo hidroxilo 3 necesario para la unin de un nuevo nucletido. La reaccin de secuencia se realiza en cuatro tubos independientes, cada uno de los cuales tiene un didesoxinucletido distinto. En cada uno de ellos se obtendrn molculas de ADN de distintos tamao que en su extremo 3 tiene el ddNucletido correspondiente. Al separar estas molculas por electroforesis se obtendr un gel, el cual las bandas deben ser ledas de abajo hacia arriba (fragmentos de menor a mayor tamao), lo que finalmente no dir cual es la secuencia de la molcula de ADN utilizada como templado.

Figura 26A. METODO DE SANGER.

Figura 26B. METODO DE SANGER.

Marcadores Moleculares: Las metodologas moleculares han revolucionado el anlisis gentico. Polimorfismos basados en DNA se han usado para construccin de mapas de ligamiento, estrategias de seleccin asistida por marcadores, pruebas de parentesco, identificacin de especies y estudios de gentica de poblaciones. En las pginas subsiguientes brevemente revisaremos los tipos principales de marcadores moleculares, la mayora de ellos derivados de la aplicacin de la Reaccin en cadena de la polimerasa o PCR. Un marcador molecular o de ADN que pueda ser utilizado en gentica de presentar un patrn de herencia conocido y mostrar polimorfismo, es decir, deben existir distintas variables o alelos del marcador dentro de la poblacin bajo estudio. RFLP (Polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccin). Idealmente la deteccin de polimorfismos a nivel del DNA requiere determinar la secuencia exacta de nucletidos. Sin embargo, la secuenciacin de segmentos de DNA de varios kilobases es laboriosa y costosa. Un mtodo alternativo es usar clones de las regiones gnicas de inters como sondas para southern blot luego de digerir el DNA blanco con endonucleasas de restriccin. De modo que, el DNA genmico es aislado, cortado con enzimas de restriccin, los fragmentos separados por

tamao en una electroforesis, transferidos a una membrana e hibridados con sondas (normalmente radioactivas) de la regin genmica de inters (southern blot).

Figura 27. SOUTHERN BLOT Y TCNICAS RELACIONADAS. La mayora de los estudios de RFLP usan endonucleasas de restriccin que reconocen secuencias de seis nucletidos, estas enzimas cortan en promedio una vez cada vez 4096 pb, produciendo fragmentos de DNA que son fcilmente resueltos en electroforesis en gel de agarosa. Para revelar polimorfismos en una escala ms fina se debe cortar el DNA con enzimas de restriccin que reconocen secuencias de cuatro nucletidos.

Figura 28. TAMAO DE FRAGMENTOS Y FRECUENCIA DE CORTES POR ENZIMAS DE RESTRICCIN.

VNTRs (Nmero variable de repeticiones en tandem). Existen dos tipos de VNTRs los llamados Minisatelites y los microsatelites o SSR (Secuencias nicas repetidas). Estos marcadores difieren en el tamao del motivo que se repite (entre 15 y 100 pb en los minisatelites y entre 1 y 6 pb en los microsatelites). Los VNTRs se encuentran dispersos en el genoma de la mayora de los animales y plantas. Minisatlites. Estos marcadores fueron los primeros VNTR estudiados, en ellos el motivo repetido no siempre es idntico y su uso fue inicialmente para pruebas de paternidad por DNA fingerprint. Esta es una metodologa multilocus, es decir se detectan muchos loci que poseen el minisatelite a la vez, pero no se sabe en qu regin del genoma se encuentran. La muestra de DNA genmico de cada individuo es digerida con enzimas de restriccin, nuevamente los fragmentos son separados por tamao en una electroforesis, transferidos a una membrana e hibridados con sondas que en este caso corresponden al motivo del minisatelite (southern blot). El producto final del DNA fingerprint es un patrn de bandas que es especfico de un individuo (normalmente entre el 15 al 20% de las bandas son compartidas por dos individuos debido al azar). Las bandas reveladas por esta tcnica tienen un patrn de herencia mendeliana, pues en promedio la mitad de las bandas son derivadas de cada progenitor. Microsatelites. Este tipo de marcadores son ms polimrficos que los minisatelites y poseen la ventaja que pueden ser analizados por PCR. En la amplificacin por PCR de los microsatelites, los partidores utilizados se ubican en las regiones genmicas que rodean el microsatelite propiamente dicho. Por lo tanto, estos marcadores son especie especficos puesto que las secuencias flanqueantes varan de una especie a otra. La metodologa consiste en

utilizar partidores especficos (obtenidos de otros estudios o desarrollados por uno mismo) para amplificar el microsatlite por PCR, hacer electroforesis en geles de poliacrilamida de las muestras amplificadas y teir los fragmentos con una tcnica con plata. PCR-RFLP. Esta metodologa combina la amplificacin por PCR de una secuencia conocida de DNA (un locus) usando partidores especficos, seguido de la digestin del amplificado con enzimas de restriccin que permiten cortar el fragmento amplificado en algunos individuos y no en otros, detectando el polimorfismo. ste revelado en electroforesis en gel de agarosa al ser teido con bromuro de etidio. RAPD (Amplificacin aleatoria de fragmentos polimrficos de DNA). En un ensayo de RAPD se utiliza un slo partidor de secuencia arbitraria (tpicamente de 10 bases o 10-mer) para realizar un PCR (en un PCR ordinario se usan dos partidores). Los partidores son diseados para contener un porcentaje de G+C de 50 a 70%. Estos partidores se unen a sitios complementarios presentes en el DNA genmico bajo estudio, si dos partidores se unen en sitios presentes en hebras opuestas, dentro de una distancia amplificable (normalmente de 2500 bases) se amplifica un fragmento discreto. El nmero de fragmentos amplificados vara entre 1 y 10 por partidor, cada fragmento corresponde a un locus donde en algunos individuos hay amplificacin y en otros no la hay, no se puede distinguir el homocigoto del heterocigoto por lo tanto se detectan como marcadores dominantes. En la siguiente tabla se muestra un resumen de los principales marcadores polimrficos de DNA y sus caractersticas ms importantes. Tabla 1. PROPIEDADES DE LOS SISTEMAS PARA IDENTIFICAR MARCADORES MOLECULARES
Caractersticas RFLP Minisatelites Microsatelites RFLP-PCR Amplificacin por PCR de locus simple y digestin con Ez. de restriccin RAPD

Principio

Digestin con Ez. de restriccin, Southern blot e hibridacin

Digestin con Ez. de restriccin, Southern blot e hibridacin

Amplificacin por PCR de secuencias repetidas simples

PCR con partidores arbitrarios.

Tipo de polimorfismo

Cambios de bases en sitios de restriccin, inserciones y deleciones

Cambios de bases, inserciones y deleciones

Diferencias en longitud debido a nmero de unidades repetidas

Cambios de bases en sitios de restriccin, inserciones y deleciones

Cambios de bases en sitios de unin del partidor al templado inserciones y deleciones Moderado/Bajo 1 a 10 Dominante No

Polimorfismo N loci detectados Dominancia Conocimiento del genoma estudiado Dificultad tecnica Costo de desarrollo

Moderado 1a3 Codominante Ninguno

Bajo Muchos Dominante Ninguno

Alto 1 Codominante Si

Moderado 1 Codominate Si

Intermedia Intermedio

Intermedia Intermedio

Baja Alto

Baja Alto

Intermedia Bajo

La evidencia obtenida por la tcnica de DNA finger print se puede obtener a partir de cualquier material biolgico que contenga DNA: tejidos, fluidos corporales (sangre y semen), folculos del pelo, etc. El anlisis de DNA se puede incluso hacer con material seco, tal como manchas de sangre o tejidos momificados. Si una muestra de DNA es demasiado pequea, puede ser amplificada usando tcnicas de PCR. El DNA entonces se trata con enzimas de restriccin que cortan el DNA en fragmentos de diferentes longitudes.

GENETICA DE POBLACIONES
La gentica de poblaciones tiene como objetivo describir la composicin gentica de una poblacin, entender las fuerzas que cambian esta composicin con la finalidad de predecir el destino de los genes a travs de las generaciones. Se define como poblacin mendeliana a un grupo de individuos de la misma especie que coexisten espaciotemporalmente y comparten un acervo gentico comn. La poblacin mendeliana se caracteriza por presentar dos atributos; el pool gnico y la frecuencia gnica. El pool gnico es el conjunto de genes presentes en una poblacin, es decir, la suma total de genes presentes en los gametos reproductores de una poblacin, mientras que la frecuencia gnica es, la proporcin en la que se encuentran los diferentes alelos de un locus en una poblacin. Ud. debe tener claro que en los individuos el genotipo no cambia, sin embargo, en las poblaciones las frecuencias gnicas pueden cambiar de una generacin a la siguiente. En una poblacin tambin se pueden calcular las frecuencias genotpicas y las frecuencias fenotpicas, es decir, la proporcin en la que se encuentran los diferentes genotipos o fenotipos en la poblacin, respectivamente. PRINCIPIO O LEY DE HARDY-WEINBERG (H-W) En 1908, G.H. Hardy y W. Weinberg se dieron cuenta que, desde el punto de vista matemtico las frecuencias gnicas no cambian de una generacin a la siguiente. Esta es la ley ms importante de la gentica de poblaciones, y para cumplirse requiere ciertos supuestos biolgicos, a saber: a).b).c).d).e).f).g).El organismo debe ser diploide y con reproduccin sexual. Las generaciones no deben superponerse. El apareamiento es al azar (poblacin panmixtica). La poblacin debe ser muy grande (sin endogamia y deriva gentica). No debe haber migracin (poblacin cerrada). No debe haber mutacin. La seleccin natural no afecta el locus bajo estudio.

Tanto la seleccin, mutacin, migracin, endogamia (o consanguinidad) y deriva gentica se conocen como factores evolutivos, pues ellos producen cambios en las frecuencias de los genes en una poblacin y por consiguiente cambian la composicin gentica de las poblaciones a travs del tiempo. Consideremos un locus con dos alelos, donde p es la frecuencia del alelo dominante A, p = f(A); y q la frecuencia del alelo recesivo a, q = f(a), de modo que p + q = 1. Entonces, si en una poblacin los individuos se aparean al azar teniendo todos los machos la misma probabilidad de aparearse con todas las hembras y viceversa, las frecuencias genotpicas resultantes seran: gameto: A gameto: a frecuencia: p frecuencia: q gameto: A frecuencia: p gameto: a frecuencia: q Genotipo: AA Frecuencia: p2 genotipo: Aa frecuencia: pq genotipo: Aa frecuencia: pq genotipo: aa frecuencia: q2

La representacin de la tabla anterior, se puede escribir matemticamente como: (p + q)2 = p2 + 2pq + q2 Esta frmula significa que, bajo Equilibrio de Hardy-Weinberg las frecuencias genotpicas se corresponden con la expansin del cuadrado del binomio de las frecuencias gnicas: Antes de aparearse los individuos la frecuencia del alelo dominante (A) era p. Ahora, despus del apareamiento la frecuencia del alelo dominante ser: f(A) = AA + (2 Aa) Slo se cuentan la mitad de los heterocigotos, pues ellos portan un nico alelo dominante. = p2 + p q = p(p +q); como p + q = 1, entonces, =p Por lo tanto, la frecuencia de A, f(A) = p no cambi con el paso de una generacin a la siguiente. Lo mismo se puede hacer para el alelo recesivo (a), comprobando que su frecuencia tampoco cambia.

CLCULO DE FRECUENCIAS GNICAS, GENOTPICAS Y FENOTPICAS El clculo de las frecuencias de los distintos alelos de un gen (locus) en una poblacin depende de: el patrn de herencia del gen estudiado (dominante/recesivo o codominante), el nmero de alelos que presenta el locus (diallico o con alelos mltiples) o si la ubicacin del locus bajo estudio est en los autosomas o en los cromosomas sexuales. Locus autosmico codominante di-allico. Este es el clculo ms sencillo, pues aqu el individuo heterocigoto (A1A2) es fenotpicamente distinguible de ambos homocigotos (A1A1 y A2A2). Clculo de frecuencias gnicas. La frecuencia del alelo A1 ser: f(A1) = (N de individuos A1A1 + N de heterocigotos A1 A2)/ Total de individuos Como slo son dos los alelos en la poblacin, la frecuencia del alelo A2 ser: f(A2) = 1 - f(A1) Clculo de frecuencias genotpicas y fenotpicas. En este caso como se pueden distinguir los tres genotipos (a travs de su fenotipo) que componen la poblacin el valor de las frecuencias genotpicas y fenotpicas son las mismas y se calculan dividiendo el nmero de individuos con un determinado genotipo (o fenotipo) por el nmero total de individuos: Frec. genotipo A1A1 fenotipo A1 es f(A1A1) = N individuos A1A1 /N total individuos Frec. genotipo A2A2 fenotipo A2 es f(A2A2) = N individuos A2A2 /N total individuos Frecuencia del genotipo heterocigoto A1A2 fenotipo A1A2 es: f(A1A2) = N individuos A1A2/N total individuos Locus autosmico dominante/recesivo di-allico. En este caso no hay posibilidad de distinguir a los individuos homocigotos dominantes (AA) de los individuos heterocigotos (Aa), por consiguiente las frecuencias genotpicas son diferentes a las fenotpicas. Para calcular las frecuencias gnicas se debe asumir que la poblacin est en Equilibrio de H-W. Clculo de frecuencias gnicas. Asumiendo equilibrio de H-W, la frecuencia de homocigotos recesivos (aa) en la poblacin es q2, de modo que la frecuencia del alelo recesivo f(a) es q, por lo tanto, podemos calcular q a partir de la frecuencia de individuos recesivos usando la siguiente frmula: Frecuencia del alelo recesivo (a) ser: f(a) = q = (N individuos recesivos aa/ N total)1/2 Frecuencia del alelo dominante (A) ser: f(A) = q = 1-p Clculo de frecuencias genotpicas. En este caso el valor de las frecuencias genotpicas se calculan a partir del Equilibrio de Hardy-Weinberg, como se muestra: Frecuencia del genotipo homocigoto dominante, f(AA) = p2 Frecuencia del genotipo heterocigoto, f(Aa) = 2pq Frecuencia del genotipo homocigoto recesivo, f(aa) = q2 Clculo de frecuencias fenotpicas. En este caso slo hay dos fenotipos distinguibles en la poblacin y su frecuencia se calcula dividiendo el nmero de individuos de cada fenotipo por el nmero total de individuos: Frecuencia del fenotipo dominante, f(A_) = N individuos A_ /N total individuos. Frecuencia del fenotipo recesivo, f(aa) = N individuos aa /N total individuos. Locus autosmico dominante-recesivo con alelos mltiples. Consideremos un caso con cuatro alelos, como el del color del pelaje en los conejos, donde la relacin de dominancia es: Agut (C) > Chinchilla (cCh) > Himalaya (ch) > Albino (c).

Si llamamos p la frecuencia del alelo agut, f(C) = p; q a la frecuencia del alelo chinchilla, f(cCh) = q; r a la frecuencia del alelo himalaya, f(ch) = r; y s a la frecuencia del alelo albino, f(c) = s. En una poblacin puede haber cuatro alelos, cuatro fenotipos y diez genotipos, como se muestra en la tabla.

Fenotipo Agut

Chinchilla

Himalaya Albino

Genotipo CC CcCh Cch Cc cChcCh cChch cChc chch chc cc

Frecuencia esperada H-W p2 2pq 2pr 2ps q2 2qr 2qs r2 2rs s2

Clculo de frecuencias gnicas. Este clculo slo se puede hacer asumiendo equilibrio de Hardy-Weinberg, comenzando el clculo con la frecuencia del alelo ms recesivo (s) y completando cuadrados para poder estimar la frecuencia de los otros alelos, como se muestra a continuacin: La frecuencia del alelo recesivo c se calcula como: s = f(c) = (N albinos/Total)1/2 La frecuencia del alelo ch se calcula completando el cuadrado del binomio: r2 + 2rs + s2, que como se muestra en la tabla corresponde a los individuos de fenotipo albino e himalaya, de modo que se puede escribir la siguiente igualdad: r2 + 2rs + s2 (r + s)2 r +s r = = = = (N Albinos + N Himalaya)/Total (N Albinos + N Himalaya)/Total ( (N Albinos + N Himalaya)/Total) ( (N Albinos + N Himalaya)/Total) - s

Esto permite calcular r = f(ch), ya que s se calculo previamente. La frecuencia del alelo cCh se calcula completando el cuadrado del trinomio: q2 + 2qr + 2qs + r2 + 2rs + s2, que como Ud. observa en la tabla corresponde a los individuos de fenotipo albino, himalaya y chinchilla, de modo que aqu tambin se puede escribir la siguiente igualdad: q2 + 2qr + 2qs + r2 + 2rs + s2 (q + r + s)2 q+ r +s q = = = = (N Albinos + N Himalaya + N Chinchilla)/Total (N Albinos + N Himalaya + N Chinchilla)/Total ( (N Albinos + N Himalaya + N Chinchilla)/Total) ( (N Albinos + N Himalaya + N Chinchilla)/Total) - r - s

Esto permite calcular q = f(cCh), ya que r y s se calcularon previamente. Finalmente la frecuencia del alelo dominante C, se calcula como, p = f(C) = 1 - q - r - s. Clculo de frecuencias gentipicas. Conociendo las frecuencias gnicas el valor de las frecuencias gentipicas se calculan a partir del Equilibrio de H-W, tal como se muestra la tabla anterior en la columna correspondiente. Clculo de frecuencias fenotpicas. Como siempre para los fenotipos distinguibles en la poblacin y sus frecuencias se calculan dividiendo el nmero de individuos de cada fenotipo por el nmero total de individuos: Frecuencia fenotipo Agut (C_) es: f(C_) = N individuos agut /N total individuos Frecuencia fenotipo Chinchilla (cCh_) es: f(cCh_) = N individuos cCh_/N total individuos Frecuencia fenotipo Himalaya (ch_) es: f(ch_) = N individuos ch_/N total individuos Frecuencia fenotipo Albino (cc) es: f(cc) = N individuos cc/N total individuos Locus ligado al sexo codominante di-allico. En este caso consideremos que el sexo homogamtico es la hembra y el heterogamtico el macho, como ocurre con el sistema XY. Si el locus es codominante, en las hembras tenemos tres genotipos (y fenotipos) posibles, en cambio en los machos los individuos son hemicigotos con slo dos genotipos (fenotipos) en la poblacin.

Fenotipo A1 A1 A2 A2

Hembras Genotipo XA1 XA1 XA1 XA2 XA2 XA2

Fenotipo A1 No existe A2

Machos Genotipo XA1 Y No existe XA2 Y

Nota: Para genes ligados al sexo, el clculo de cualquier frecuencia debe hacerse para CADA SEXO POR SEPARADO. En las hembras el clculo de frecuencias gnicas, genotpicas y fenotpicas se realiza como sigue: Frecuencias gnicas: La frecuencia del alelo A1 ser: f(A1) = (N de hembras XA1 XA1 + N de hembras XA1 XA2)/ Total de hembras Como slo hay dos los alelos en la poblacin, la frecuencia del alelo A2 ser: f(A2) = 1 - f(A1) Clculo de frecuencias genotpicas y fenotpicas. En este caso como se pueden distinguir los tres genotipos de las hembras (a travs de su fenotipo) que componen la poblacin el valor de las frecuencias genotpicas y fenotpicas sern las mismas y se calculan dividiendo el nmero de hembras con un determinado genotipo (o fenotipo) por el nmero total de hembras: F. genotipo XA1 XA1 fenotipo A1 es f(XA1 XA1) = N hembras XA1 XA1/N total hembras F. genotipo XA2 XA2 fenotipo A2 es f(XA2 XA2) = N hembras XA2 XA2/N total hembras F. del genotipo heterocigoto XA1 XA2 fenotipo A1 A2 es: f(XA1 XA2) = N hembras XA1 XA2/N total hembras En los machos por poseer un slo alelo en cada locus (condicin hemicigota), las frecuencias gnicas, genotpicas y fenotpicas son iguales, y se calculan simplemente dividiendo en nmero de machos de un determinado genotipo (o fenotipo) por el total de machos de la poblacin. F. gnica f(XA1) = f. genotpica f(XA1 Y)= f. fenotpica = N machos XA1 Y/ N total machos F.gnica f(XA2)= f.genotpica f(XA2 XA2)= f.fenotpica =N machos XA2XA2/ N total machos

Locus ligado al sexo dominante/recesivo di-allico. Nuevamente consideremos que el sexo homogamtico es la hembra y el heterogamtico el macho (sistema XY). En este caso, el efecto de la dominancia slo se observa en las hembras, donde habr tres genotipos y slo dos fenotipos. En los machos los individuos son hemicigotos con slo dos genotipos (fenotipos) en la poblacin. Hembras Genotipo XA XA A A a XA Xa Xa Xa a No existe Xa Y A Machos Genotipo XA Y

Fenotipo

Fenotipo

Nota: Recuerde que las frecuencias deben calcularse para cada sexo POR SEPARADO. Hembras: Clculo de frecuencias gnicas. Este clculo es similar al de un locus autosmico, pero slo considerando las hembras. Frecuencia alelo recesivo, f(Xa) = qh = (N hembras recesivos Xa Xa/ N total hembras)1/2 Frecuencia alelo dominante, f(XA) = qh = 1- ph Clculo de frecuencias gentpicas. En este caso el valor de las frecuencias genotpicas se calculan a partir del Equilibrio de Hardy-Weinberg, Frecuencia del genotipo homocigoto dominante, f(XA XA) = ph2

Frecuencia del genotipo heterocigoto, f(XA Xa) = 2ph qh Frecuencia del genotipo homocigoto recesivo, f(Xa Xa) = qh2 Clculo de frecuencias fenotpicas. En este caso slo hay dos fenotipos distinguibles en la poblacin y su frecuencia se calcula dividiendo el nmero de individuos de cada fenotipo por el nmero total de individuos: Frecuencia del fenotipo dominante, f(XA_) = N hembras XA /N total hembras Frecuencia del fenotipo recesivo, f(Xa Xa) = N hembras Xa/N total hembras Machos: Los machos poseen slo un alelo por locus, as las frecuencias gnicas, genotpicas y fenotpicas nuevamente son iguales. F.gnica pm= f(XA)= f.genotpica f(XA Y)= f.fenotpica f(A) = N machos XAY/N total machos F.gnica qm= f(Xa)= f. genotpica f(Xa Y)= f. fenotpica f(A2) = N machos XA1Y/N total machos Para los loci ligados al sexo, sean estos codominantes o dominante/recesivo se pueden calcular FRECUENCIAS GNICAS POBLACIONALES, ponderando el valor de la frecuencia gnica de las hembras en 2/3 y el valor de la frecuencia gnica de los machos en 1/3. ppoblacional = 2/3 ph + 1/3 pm y qpoblacional = 1 - ppoblacional

PRUEBA DE HIPOTESIS PARA EQUILIBRIO DE HARDY-WEINBERG Como fue mencionado previamente el principio Hardy-Weinberg es la ley ms importante de la gentica de poblaciones, y existe un mtodo estadstico basado en la prueba de X2 para saber si una poblacin se encuentra en equilibrio. El procedimiento es el siguiente: i. ii. iii. iv. Calcular las frecuencias gnicas de la poblacin bajo estudio. Calcular las frecuencias genotpicas esperadas. Determinar el nmero de individuos esperados. Comparar los individuos observados y esperados con un chi-cuadrado.

Ejemplo: En una poblacin se hizo un muestreo 203 individuos y se encontr que 80 eran de genotipo A1A1, 3 eran de genotipo A1A2 y 120 de genotipo A2A2. Para determinar si la poblacin est o no en equilibrio de Hardy-Weinberg se debe realizar el siguiente procedimiento: i) La frecuencia del alelo A1 es p = f(A1) = (80 + 3)/203 = 0,4 y la frecuencia del alelo A2 es q = f(A2) = 1 - 0,4 = 0,6 ii) Entonces, las frecuencias genotpicas esperadas bajo equilibrio, sern: Frecuencia del homocigoto A1A1, p2 = (0,4)2 = 0,16 Frecuencia del heterocigoto A1A2, 2pq = 2*(0,4) (0,6) = 0,48 Frecuencia del genotipo homocigoto A2A2, q2 = (0,6)2 = 0,36 iii) El nmero de individuos esperados por genotipo ser: Homocigoto A1A1 = 0,16 * 203 = 32,5 individuos Heterocigoto A1A2 = 0,48 * 203 = 97,5 individuos Homocigoto A2A2 = 0,36 * 203 = 73,0 individuos iv) Prueba de chi-cuadrado: Ho : La poblacin est en equilibrio ((p + q)2 = p2 + 2pq + q2) H1 : La poblacin NO est en equilibrio ((p + q)2 p2 + 2pq + q2) X2 calculado = (80 - 32,5)2 /32,5 + (3 - 97,5)2 /97,5 + (120 - 73)2 /97,5 = 191,11 El valor de X2 calculado se compara con el X2 tabla, con n - 2 grados de libertad, se pierde un grado de libertad al estimar las frecuencias gnicas y otro al realizar el chi-cuadrado.

En este caso se rechaza la hiptesis nula, pues X2 calculado = 191,11 > X2 tabla 1gl = 3,841. Por tanto, se concluye que: la poblacin no est en equilibrio de Hardy-Weinberg para el locus estudiado.

FACTORES EVOLUTIVOS Como mencionamos previamente, los factores evolutivos son los que cambian las frecuencias gnicas de una generacin a la siguiente en la poblacin. Existen dos tipos, los sistemticos o direccionales y los dispersivos o estocsticos. Entre los primeros podemos mencionar la mutacin, migracin y seleccin, que se caracterizan por que se puede conocer la magnitud y direccin del cambio que producen en las frecuencias gnicas. Entre los factores dispersivos tenemos la deriva gentica y endogamia, sobre los cuales slo se puede predecir la magnitud del cambio, pero no su direccin. MUTACION. A escala poblacional la mutacin es un proceso lento, pues cambia la constitucin gentica de la poblacin en una tasa muy baja. Las mutaciones, se producen al azar pueden ser dominantes o recesivas, y en las poblaciones pueden ser reversibles. Considere una poblacin que en la generacin cero en el locus B, el alelo dominante tiene frecuencia po y el alelo recesivo frecuencia qo. Si el alelo B muta a b con una tasa de mutacin directa u.

Despus de una generacin de mutacin la frecuencia del alelo dominante p1 ser: p1 = po - u po = po (1 - u ) Generalizando la formula a t generaciones de mutacin directa, tenemos: pt = po (1 - u )t Ahora completemos el sistema, considerando que el alelo b puede retromutar a B en cada generacin con tasa v.

Con este modelo, despus de una generacin de mutacin la frecuencia del alelo dominante p1 ser: u po + v qo

p1 = po -

Finalmente, si la mutacin directa y reversa siguen afectando el mismo locus se lograr llegar a un equilibrio donde las frecuencias no cambian producto de la mutacin: u p = v q, como sabemos que p = 1 - q u (1 - q) = v q u-uq=vq u=vq + uq u=q(v+u) q^ = u/( v + u ) Esto mismo se puede realizar para calcular p^ = v/( v + u ), tanto p^ como q^ se conocen como frecuencias de equilibrio bajo un sistema de mutacin directa y reversa, y como se puede observar estas frecuencias de equilibrio slo dependen las tasas de mutacin directa (v) y reversa (u). MIGRACION. Este factor tambin se conoce como FLUJO GNICO e incluye la inmigracin y emigracin. El proceso ocurre cuando un grupo de individuos se trasladan de una poblacin a otra y se reproducen con los individuos nativos. La migracin cambia las frecuencias gnicas, y este cambio es de mayor magnitud si las poblaciones que se juntan han estado aisladas espaciotemporalmente y por varias generaciones. Consideremos dos poblaciones A y B con frecuencias gnicas qo y qm, respectivamente. Supongamos que m individuos de la poblacin B emigran a la poblacin A, m se conoce como la tasa de migracin y corresponde a la proporcin de individuos migrantes presentes en la poblacin mezclada (migrantes + nativos).

Luego de una generacin de migracin la nueva frecuencia gnica en la poblacin A ser: q1 = qo (1 - m) + qm m

SELECCION NATURAL. La seleccin natural produce cambio en las frecuencias gnicas pues influye la probabilidad de supervivencia y reproduccin de los distintos genotipos. Se llama s a la presin o coeficiente de seleccin sobre un determinado genotipo y est toma valores entre cero y uno. Sin seleccin s = 0, es decir, el genotipo sobrevive y se reproduce. Con seleccin total s = 1, es decir, el genotipo no sobrevive ni se reproduce. La contraparte del coeficiente de seleccin se conoce como valor adaptativo o adecuacin biolgica o eficacia biolgica o "fitness" (w). Se calcula como w = 1 - s. La seleccin puede definirse como la reproduccin diferencial de los genotipos, produce cambios de frecuencias gnicas que son adaptativos, es el nico factor evolutivo que produce adaptacin de los individuos al medio ambiente. La seleccin puede afectar a cualquier genotipo presente en la poblacin, es decir, puede haber seleccin contra el homocigoto recesivo, dominante o contra el heterocigoto, o contra todos a la vez. Con el modelo general de seleccin presentado abajo Ud. puede hacer fcilmente todos los clculos referentes a los problemas de seleccin sin aprenderse necesariamente las frmulas, como se le mostrar durante el desarrollo de los problemas en ayudanta. Modelo general de Seleccin. Genotipo AA Frecuencia p2 Coef. Seleccin s1 Adecuacin (1 - s1) Aplicacin de seleccin p2 (1 - s1) Ajuste del nuevo total a 1 p2 (1 - s1)/total Clculo de nuevas frecuencias Frecuencias genotpicas Generacin 1 p12 Aa 2pq s2 (1 - s2) 2pq (1 - s2) 2pq (1 - s2)/total Gnicas p1 y q1 aa q2 s3 (1 - s3) q2 (1 - s2) Total =1

total 1

q2 (1 - s2)/total = 1 luego de la seleccin

2 p1 q1

q12

=1

Ud. puede calcular las frecuencias gnicas en las siguientes generaciones aplicando el mismo mtodo las veces que sea necesario. DERIVA GENICA. Este factor estocstico se refiere a fluctuaciones aleatorias en las frecuencias gnicas debido a error de muestreo de los gametos de una generacin a la siguiente. Esto se debe a que slo una pequea fraccin de los gametos producidos en la poblacin dar origen a la prxima generacin. El efecto de la deriva es inversamente proporcional al tamao poblacional y ms especficamente al tamao efectivo de la poblacin (Ne), que representa el nmero de progenitores que efectivamente da origen a la nueva generacin. Ne = 4 (Nm * Nh)/ Nm + Nh, Donde Nm es el nmero de machos y Nh es el nmero de hembras de la poblacin. La deriva se mide en trminos de la desviacin estndar de las frecuencias gnicas Deriva = = (p q/ 2 Ne)1/2 ENDOGAMIA. La endogamia o consanguinidad se produce por el apareamiento en una poblacin de individuos emparentados y se mide por medio del coeficiente de endogamia (F) de cada individuo, que corresponde a la probabilidad de tener genes idnticos por descendencia. Cada hijo producto de un tipo de cruzamiento consanguneo tiene un valor de endogamia distinto, como se muestra en la tabla. Tipo de cruzamiento Autofecundacin Hermanos completos Padre-hijo To(a)-sobrino(a) Primos hermanos To(a)-sobrino(a) 2 grado F 1/8 1/8 1/32

A escala poblacional, la endogamia aumenta la frecuencia de genotipo homocigotos a expensas de los heterocigotos, de acuerdo al siguiente esquema:

Genotipo Frecuencia sin endogamia Frecuencia con endogamia

AA p2 p2 + pq F

Aa 2pq 2pq - 2pq F

aa q2 q2+ pq F

El coeficiente de endogamia poblacional se calcula promediando los coeficientes de endogamia de los individuos que la componen.

PARENTESCO Y ENDOGAMIA O CONSANGUINIDAD El parentesco (a) entre un individuo y su ancestro decrece en por cada generacin que los separa a ambos. Para dos parientes colaterales (individuos D y E, en el equema) el parentesco decrece en por cada generacin que los separa a ambos de su ancestro, la diferencia es que en este caso hay dos lneas de descendencia desde el ancestro comn a ambos individuos. Si n1 es el numero de generaciones que separan al ancestro comn del individuo D y n2 es el numero de generaciones que separan al ancestro comn del individuo E. De modo que, para una va (circuito que une a ambos individuos pasando por su ancestro comn) el parentesco entre ambos individuos es a = ( ) n1 + n2. Algunas veces hay ms de una va que une a ambos individuos (pasando por el ancestro comn). En estos casos el parentesco total es la suma del parentesco aportado por cada una cada vas. (Ojo, tambin puede haber varios ancestros comunes). a = ( ) n1 + n2 Sin embargo, el ancestro comn puede ser endogmico, por lo tanto a cada va hay que multiplicarla por (1 + FA), donde FA es el coeficiente de endogamia del ancestro comn. As tenemos que en este caso el parentesco ser: a = ( ) n1 + n2 (1 + FA) COEFICIENTE DE ENDOGAMIA. La reproduccin entre individuos emparentados se denomina consanguinidad o endogamia. La endogamia de un individuo puede medirse por medio del coeficiente de endogamia (F), ndice que mide la probabilidad de que un individuo presente genes idnticos por descendencia. El coeficiente de endogamia de cualquier individuo es la mitad del parentesco entre los progenitores del individuo en cuestin: F=a F = ( ) n1 + n2 (1 + FA ) F = ( ) n1 + n2 + 1 (1 + FA )

Pongamos un ejemplo con dos ancestros comunes (A y B) como se muestra en la figura de abajo y calculemos el coeficiente de endogamia para en individuo I. En este caso tenemos dos vas (GDACE y GDBCE) por lo tanto debemos sumar la contribucin de cada va al calcular el valor de F( I ), como se observa en la figura:

En la gua pasada examinamos la consecuencia de la endogamia a nivel poblacional es un aumento de la homocigosis en la poblacin a expensas de la disminucin de los heterocigotos. Sin embargo, a nivel individual la consecuencia ms llamativa de la endogamia es la aparicin de individuos homocigotos para genes recesivos (normalmente genes de efectos deletereos adversos), producto del aumento de individuos homocigotos. Algunos genes recesivos, incluso pueden afectar caractersticas productivas debido a efectos pleiotrpicos (busque definicin de pleiotrpico) sobre estas. Otro fenmeno asociado es la depresin endogmica, que es la reduccin del valor fenotpico promedio de la poblacin en rasgos de importancia econmica o relacionados con la adecuacin biolgica (sobrevivencia y fertilidad).

VIGOR HIBRIDO O HETEROSIS La heterosis es el fenmeno inverso a la depresin endogamia. Consiste en el aumento del valor fenotpico promedio, en la progenie (F1 ) derivada de un cruzamiento entre lneas parentales endogmicas (P1 y P2 ). HF1 = F! - (P1 + P2 )