Fundacin H. A.

Barcel-Facultad de Medicina Gua de Trabajos Prcticos: Enzimas: regulacin por pH, temperatura y concentracin de sustratos

FUNDACIN BARCELO INSTITUTO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS DE LA SALUD FACULTAD DE MEDICINA

BIOQUMICA, INMUNOLOGA Y NUTRICION NORMAL 3 AO

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS ENZIMAS: REGULACIN POR pH, TEMPERATURA Y CONCENTRACIN DE SUSTRATOS

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ENZIMAS Aspectos generales: Las enzimas son en su mayora protenas que catalizan reacciones qumicas en los seres vivos. Las enzimas son catalizadores biolgicos, sustancias que sin consumirse en una reaccin, aumentan notablemente su velocidad. No hacen factibles las reacciones imposibles, sino que solamente aceleran aquellas reacciones que se producen espontneamente. Las enzimas hacen posible la existencia de seres vivos, ya que permiten que se produzcan aquellas reacciones qumicas que, sin catalizador, requeriran de tiempos y condiciones de presin, temperatura y pH incompatibles con la vida. Prcticamente todas las reacciones quimicas que tienen lugar en los seres vivos estn catalizadas por enzimas. Las enzimas son catalizadores especficos: cada enzima cataliza un solo tipo de reaccin, y casi siempre actan sobre un nico sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos. El sustrato se une a una regin concreta de la enzima, llamada centro activo. El centro activo comprende un sitio de unin formado por los aminocidos que estn en contacto directo con el sustrato y un sitio cataltico formado por los aminocidos directamente implicados en el mecanismo de la reaccin. Una vez formados los productos, la enzima puede comenzar un nuevo ciclo de reaccin. Propiedades de las enzimas: Las propiedades de las enzimas se encuentran ntimamente relacionadas con su estructura. Dada la alta complejidad estructural que presentan es que pueden llevar a cabo procesos catalticos complejos. Por consiguiente cualquier modificacin en la estructura nativa de la misma suele ir asociado a cambios en la actividad cataltica. Los factores que influyen de manera ms directa sobre la actividad de una enzima son: Cambios de pH Cambios de Temperatura Presencia de Cofactores La concentracin de sustrato y producto La fuerza inica de la solucin

Efecto del pH sobre la actividad enzimtica : las enzimas poseen grupos qumicos ionizables (carboxilos COOH, aminos NH 2, tiol SH, imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminocidos. Segn el pH del medio, estos
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grupos pueden tener carga elctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformacin de las protenas depende, en parte, de sus cargas elctricas, habr un pH en el cual la conformacin ser la ms adecuada para la actividad cataltica. ste es el llamado pH ptimo. La mayora de las enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas dcimas por encima o por debajo del pH ptimo pueden afectar drsticamente su actividad. As, la pepsina gstrica tiene un pH ptimo de 2, la ureasa tiene un pH ptimo de 7 y la arginasa tiene un pH ptimo de 10. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica: en general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones qumicas: por cada 10C de incremento, la velocidad de reaccin se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, debido a su estructura biolgica, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la actividad cataltica es mxima se llama temperatura ptima. Por encima de esta temperatura el aumento de la velocidad de la reaccin debido a la temperatura es contrarrestado por la prdida de actividad cataltica debida a la desnaturalizacin trmica, y la actividad enzimtica decrece rpidamente hasta anularse. Efecto de las concentraciones de sustrato sobre la actividad enzimtica: La velocidad de una reaccin enzimtica depende de la concentracin del sustrato mientras la enzima no se encuentre saturada. TRABAJO PRCTICO OBJETIVOS Determinar la variacin de la actividad de una enzima frente a variaciones en el pH del medio de reaccin. Determinar la variacin de la actividad de una enzima ante cambios de temperatura en la reaccin qumica. Observar el incremento de la actividad enzimtica frente a concentraciones crecientes de sustrato. La determinacin de la actividad de una enzima se realiza por mtodos colorimtricos que requieren de la utilizacin del ESPECTROFOTOMETRO, que permite medir la cantidad de luz absorbida de una sustancia, preferentemente coloreada. La determinacin de la concentracin se realiza al pasar un fino haz de luz a travs de la solucin. La porcin de luz que pasa a travs de la solucin colorida es la trasmitancia porcentual, la luz que no pasa es absorbida por la solucin y es medida como unidades de absorvancia. Las soluciones concentradas dejan pasar menos luz que las diluidas. As podemos decir que cuanto mayor es la concentracin de una solucin mayor es su absorvancia y menor su trasmitancia. Tanto la
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absorvancia como espectrofotmetros.

la

trasmitancia

pueden

ser

ledas

en

los

El fundamento del mtodo colorimtrico consiste en realizar una reaccin que nos de cmo producto un compuesto coloreado, el cual va a ser valorado a travs de la absorvancia que presente la solucin. ENZIMA SUSTRATO PRODUCTO (coloreado) El espectrofotmetro tiene la capacidad de medir la cantidad de luz que absorbe el producto coloreado en base a la siguiente relacin: ABSORBANCIA = a l c Donde a: es una constante propia de la sustancia coloreada, l: es el dimetro del tubo que contiene la sustancia coloreada, c: es la concentracin La absorbancia es directamente proporcional a la concentracin de una solucin dentro de un rango, a altas concentraciones se pierde la relacin lineal. A mayor concentracin de producto mayor concentracin de sustrato reaccin en presencia de la enzima. ACTIVIDADES DE LABORATORIO Para el desarrollo de los objetivos del TP se utilizar un sistema constituido por una enzima que cataliza la transformacin de un sustrato en un producto coloreado. Efecto del pH: Reactivos y materiales Buffer de reaccin pH cercano a 7 (A) Buffer de reaccin pH cido (B) Buffer de reaccin pH alcalino (C) Sustrato Enzima Bao termostatizado a 37 C Procedimiento experimental En tres tubos de ensayo se colocarn respectivamente: Tubo 1: pH ptimo Buffer A Buffer B Buffer C Enzima 1 ml 1 ml
..

Tubo 2: pH cido

Tubo 3: pH alcalino 1 ml ..l

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Sustrato (1 10 l 10 l 10 l g/l) Incubar los tres tubos en bao de agua a 37C, durante 10 minutos Observar el color obtenido en cada tubo, leer la absorbancia a 505 nm frente a blanco de reactivo y relacionar con la actividad enzimtica Efecto de la temperatura: Reactivos y materiales Buffer de reaccin pH cercano a 7 (A) Sustrato Enzima Bao termostatizado a 37 C Hielo Agua hirviendo Procedimiento experimental En tres tubos de ensayo se colocar respectivamente: Buffer A Enzima Sustrato (1 g/l) Tubo 1: 0C 1 ml ..l 10 l Tubo 2: 37C 1 ml ..l 10 l Tubo 3: 100C 1 ml ..l 10 l

Incubar 10 min en Incubar 10 min Incubar 10 min a bao de hielo (0 C) a 37C 100C Observar el color obtenido en cada tubo, leer la absorbancia a 505 nm frente a blanco de reactivo y relacionar con la actividad enzimtica Efecto de la concentracin de sustrato: Reactivos y materiales Buffer de reaccin pH cercano a 7 (A) Sustrato Enzima Bao termostatizado a 37 C Procedimiento experimental En dos tubos de ensayo se colocar respectivamente: Buffer A Sustrato (1 g/l) Enzima Tubo 1 1 ml 10 l .l Tubo 2 1 ml 30 l .l
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Incubar los tubos en bao de agua a 37C, durante 10 minutos Observar el color obtenido en cada tubo, leer la absorbancia a 505 nm frente a blanco de reactivo y relacionar con la actividad enzimtica

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CUESTIONARIO: 1- Grafique los resultados obtenidos en las experiencias de actividad enzimtica en funcin de la variacin del pH y temperatura. Compare con los grficos tericos. Qu conclusiones obtiene? 2- Teniendo en cuenta la experiencia de efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad enzimtica, discuta: a) En que tubo se observa mayor cantidad de producto y por qu? b) Dnde se observa mayor actividad enzimtica y de que dependi la misma? c) En este sistema el aumento de actividad enzimtica, dependi de la cantidad de enzima? 3- El sabor dulce del maz recin cosechado es debido a la gran cantidad de azcar de los granos. Varios das despus de la cosecha el maz no es tan dulce debido a que el 50% del azcar libre se convierte en almidn durante el primer da posterior a la cosecha. Para mantener el sabor dulce del maz recin cosechado se sumergen las espigas en agua hirviendo durante unos minutos, enfrindolo despus con agua fra. El maz procesado de este modo mantiene su dulzor perfectamente. Utilizando lo estudiado sobre enzimas, trate de explicar esta situacin. 4-Cmo se valora a travs de un mtodo colorimtrico la aparicin de producto de una reaccin enzimtica y qu relacin tiene con la actividad enzimtica?