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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO CENTRO BIOMDICO FACULDADE DE CINCIAS MDICAS PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM MICROBIOLOGIA

PROJETO

INFLUNCIA DE ONS METLICOS NA FORMAO DE BIOFILMES POR CEPAS DE ESCHERICHIA COLI ENTEROAGREGATIVAS (EAEC)

Aluna: Ana Carolina da Cruz Campos

2013

2 1 RESUMO
A sndrome diarrica permanece como um importante problema de sade pblica em todo o mundo, sendo considerada uma das maiores causas de morbidade e mortalidade infantil, principalmente nos pases em desenvolvimento. A Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) freqentemente relatada como causa de diarria aguda ou persistente. A EAEC foi reconhecida pela capacidade de produzir um padro de aderncia agregativa (AA) em linhagens celulares epiteliais humanas cultivadas in vitro, caracterizado por bactrias aderidas umas as outras e lmina de vidro com aspecto de tijolos empilhados. O padro de aderncia foi associado presena de um plasmdeo de 60 MDa que carreia genes importantes de virulncia. No presente estudo, sero analisadas cepas de EAEC isoladas de crianas com diarria aguda. Essas cepas possuem sorotipos e perfis de marcadores de virulncia diferenciados. As EAEC tm como importante etapa do processo de patognese a formao de biofilme, um processo complexo afetado por uma combinao de mecanismos influenciados pela superfcie celular, o substrato e o meio adjacente. A bactria no biofilme comporta-se diferentemente de quando est na forma planctnica o que torna essa estrutura um mecanismo de defesa contra condies deletrias presentes no meio ambiente. Vrios trabalhos tem mostrado a influncia de ons metlicos na formao de biofilmes. Uma vez que ons metlicos so essenciais para a sobrevivncia dos microorganismos, e que as concentraes destes nutrientes no ambiente afetam a virulncia de patgenos, neste estudo, verificaremos a influncia de ons metlicos como o ferro, cobre e zinco na formao de biofilmes por Escherichia coli enteroagregativas (EAEC). Como metas pretendemos avaliar os biofilmes de cepas EAEC crescidas na presena de quelantes de ferro e cobre em condies de aerobiose e anaerobiose; avaliar os biofilmes de cepas na presena ferro, cobre e zinco; verificar a viabilidade de biofilmes formados por cepas de EAEC crescidas na presena de quelantes de ferro e cobre, atravs de microscopia de fluorescncia; estudar os efeitos do ferro na formao da matriz polimrica de biofilmes formados por cepas EAEC; avaliar a expresso de fmbrias de adeso em cepas EAEC crescidas na presena de quelante de ferro; avaliar os efeitos do ferro, cobre e zinco sobre a hidrofobicidade das cepas EAEC. Palavras-chave: Escherichia coli entreoagregativa; biofilme; quelantes de metais; cobre; ferro; zinco.

3 2-INTRODUO Aspectos clnicos

A sndrome diarrica permanece como um importante problema de sade pblica em todo o mundo, sendo considerada uma das maiores causas de morbidade e mortalidade infantil, principalmente nos pases em desenvolvimento. A Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) freqentemente relatada como causa de diarria aguda ou persistente. A EAEC foi reconhecida pela capacidade de produzir um padro de aderncia agregativa (AA) em linhagens celulares epiteliais humanas cultivadas in vitro, caracterizado por bactrias aderidas umas as outras e lmina de vidro com aspecto de tijolos empilhados. O padro de aderncia foi associado presena de um plasmdeo de 60 MDa que carreia genes importantes de virulncia. No presente estudo, sero analisadas cepas de EAEC isoladas de crianas com diarria aguda. Essas cepas possuem sorotipos e perfis de marcadores de virulncia diferenciados. EAEC tem sido apontada como a causa de diarria em vrias partes do mundo, tanto nos pases em desenvolvimento quanto nos pases desenvolvidos. A maioria dos estudos epidemiolgicos tem demonstrado que a infeco por esses microorganismos est associada diarria, principalmente nos pases em desenvolvimento. Nos pases desenvolvidos EAEC tem sido apontada como a principalmente causa de surtos espordicos. As EAEC tambm tm sido implicadas como causa de diarria prolongada em pacientes infectados com o vrus da imunodeficincia adquirida (HIV) e como causa da diarria dos viajantes (Okeke & Nataro, 2001). Clinicamente, a doena causada pelas EAEC caracterizada como uma diarria secretria aquosa, com proeminente quantidade de muco e, em alguns casos, acompanhada de vestgios de sangue. O perodo de incubao da doena, estabelecido em estudos com voluntrios, varia entre 7 a 22 horas (Nataro et al., 1987). Uma caracterstica comum a evoluo para um quadro que persiste por mais de 14 dias caracterizando a diarria como crnica ou persistente.

4 Adesinas em EAEC

Em 1988, Vial et al. relataram que uma cepa prottipo isolada de criana com diarria no Chile (EAEC 17-2, sorotipo O3:H2) apresentava um plasmdio de alto peso molecular (pAA) e sugeriram que o mesmo estaria envolvido na expresso das propriedades de virulncia de EAEC. Uma sonda de 1kb foi construda e utilizada para a deteco do plasmdio pAA. Posteriormente, Nataro et al. (1987) mostraram evidncias de que um dos fatores associado ao plasmdio era de natureza fimbrial, denominando-o AAF/I (fmbria de aderncia agregativa/I). AAF/I, uma estrutura fimbrial flexvel de 2 a 3 nm de dimetro organizada em forma de feixes, era responsvel pela aderncia agregativa, hemaglutinao de eritrcitos humanos e auto-aglutinao em meio lquido. Uma segunda fmbria designada AAF/II foi descrita por Czeczulin et al. (1999). AAF/II se apresentava como uma estrutura fimbrial rgida de 5nm de dimetro sendo geneticamente e morfologicamente distinta da fmbria AAF/I. Utilizando sondas para AAF/I e AAF/II, os autores relataram que as mesmas estavam presentes em uma minoria de cepas de EAEC (31% e 12%, respectivamente), levando sugesto de que a colonizao intestinal poderia ser mediada por outros antgenos de superfcie fimbriais e/ou afimbriais ainda no caracterizados. Em 2002 Bernier et al descreveram uma nova fmbria de aderncia agregativa denominando-a AAF/III. Essa fmbria foi encontrada em 12% das EAEC testadas. Alm das fmbrias AAF/I, AAF/II e AAF/III, outros fatores implicados no processo de aderncia de EAEC tm sido descritos. Protenas de membrana externa (OMPs) de 18 kDa, 30 kDa e 38 kDa tm sido associadas com o fentipo AA.

A patognese em EAEC

Um modelo de trs estgios foi proposto para a patognese de EAEC, com as etapas ocorrendo na seguinte sequncia: (i) aderncia mucosa intestinal, (ii) aumento da produo de muco com formao de biofilme. Acredita-

5 se que a produo excessiva de muco nas infeces por EAEC contribua para uma persistncia deste microorganismo no hospedeiro, e (iii) inflamao com liberao de citocinas (Huang et al., 2004). Apesar desse modelo de trs estgios ressaltar fentipos chave associados com a patognese de EAEC, mecanismos previstos de virulncia ainda necessitam ser determinados (Joo et al., 2007). Clinicamente, as infeces causadas por EAEC apresentam diarria aquosa, ocasionalmente com muco e sangue, alm de inflamao intestinal leve (Steiner et al., 1998). A resposta inflamatria promovida pela EAEC est ligada induo da liberao de IL-8, sendo esta citocina responsvel por estimular a transmigrao de neutrfilos atravs do epitlio (Kaper et al., 2004). Diversos estudos tm sido feitos sobre biofilme em EAEC. Sheik et al. (2001) determinaram que o biofilme neste patotipo possui aspectos nicos.

Dentre estes, ressaltam a importncia de duas protenas: Fis e YafK. Esses autores sugerem que a expresso da fmbria AAF necessria para a formao de biofilme na cepa prottipo EAEC 042 e que certas protenas denominadas Fis e YafK contribuem para a formao desta estrutura, via biognese da fmbria AAF/II. Aps a passagem pelo estmago, EAEC experimentaria mudanas abruptas nas condies ambientais favorveis sua proliferao, como pH adequado, alta disponibilidade de acar e osmolaridade apropriada. Sob essas condies, a bactria entraria em fase crescimento exponencial, o que induz a expresso do gene fis. A protena Fis, produto do gene fis, atuaria como um intensificador da expresso de aggR e, consequentemente, de AAF/II,

favorecendo a formao de biofilme. Alm da capacidade de aderir mucosa intestinal, pesquisadores tm sugerido que EAEC possa ser um patgeno invasivo, ou pelo menos, que um conjunto de cepas deste patotipo possa apresentar capacidade de invadir clulas do hospedeiro durante a infeco (Benjamim et al., 1995).

6 Influncia da limitao de ferro na virulncia bacteriana

concentrao

total

de

ferro

alta

no

corpo

humano

correspondendo a aproximadamente 4,5g em um indivduo adulto, entretanto, raramente so encontrados ons frricos ou ferrosos livres. Em hospedeiros mamferos, o ferro encontra-se indisponvel para os microorganismos, estando em grande parte, sob a forma de grupo heme, na hemoglobina dos eritrcitos ou ligado a protenas como transferrina, lactoferrina e ferritina (Bullen et al, 2006). Durante a infeco, a restrio de ferro ainda maior porque a resposta do hospedeiro inclui hipoferremia (Hirata Jr et al., 2004). A hipoferremia um mecanismo de defesa que faz parte do sistema imune inato e consiste em diminuio da disponibilidade de ferro livre nos fluidos corporais atravs da ligao do mesmo s protenas transferrina e lactoferrina no fgado (Carniel, 2001). Existem muitos dados mostrando que a disponibilidade de ferro exerce um papel crtico em diferentes infeces. Isto sugere uma necessidade de mudana na medicina para investigar o papel da disponibilidade de ferro no organismo humano com maior intensidade e interesse, bem como pesquisar possveis mtodos para intensificar a imunidade natural. Essa necessidade ainda maior se considerarmos o grande ndice de resistncia a antibiticos apresentado por diversas espcies bacterianas (Bullen et al., 2006). A capacidade de captao de nutrientes vitais, incluindo

oligoelementos tais como o ferro inico, etapa indispensvel para o estabelecimento e progresso dos processos infecciosos, assim como a habilidade de colonizar e proliferar nas superfcies cutneo-mucosas (Bullen, 1985; Schmitt et al., 1995). Uma ampla variedade de bactrias sintetiza molculas

especializadas, de baixo peso molecular, denominadas siderforos, para sobreviver no hospedeiro. Essas molculas so capazes de seqestrar ons ferro do meio ou remov-los das protenas ligantes como transferrinas e lactoferrinas (Bullen, 1985). A habilidade de produo destes siderforos frequentemente est relacionada com a virulncia bacteriana (Gueirinot, 1994). Em Escherichia coli h

7 pelo menos nove sistemas conhecidos de transporte de ferro, incluindo, enterobactina (fep), aerobactina (iuc) e yersiniabactina (fyuA). A maioria das cepas patognicas de EAEC apresenta mltiplos sistemas de captao de ferro. Acredita-se que esta redundncia possa compensar a perda ou a inativao de um ou mais sistemas durante o processo infeccioso (Negre et al., 2004). Os sistemas regulatrios ferro-dependente mais conhecidos so o regulon fur (ferric uptake repressor protein) em bactrias Gram-negativas e o regulon DtxR/IdeR em bactrias Gram-positivas. Ambos so constitudos de protenas que se ligam ao DNA de maneira ferro-dependente. No sistema Fur, os genes participantes da captao de ferro, como genes para siderforos e para os seus receptores, tm suas expresses reprimidas pela protena Fur. Esta, quando ligada ao ferro, reconhece a regio promotora de diversos genes e inibe a transcrio dos mesmos. Na presena de baixa concentrao de ferro, a protena Fur desligada do ferro e da regio promotora dos genes, que so desreprimidos e a captao deste elemento aumenta. Aps a concentrao de ferro atingir um nvel crtico, o sistema Fur novamente ativado e os genes voltam a ser reprimidos pela protena Fur.

O papel dos metais de transio na gerao de espcies reativas de oxignio (ERO)

Apesar dos ons frricos serem indispensveis vida, os mesmos catalisam a formao do radical hidroxil, atravs da reao de Fenton (Kehrer & Paraidathathu, 1992) (Fig. 1). Esse radical tem sido apontado como a principal ERO lesiva s clulas, pois seu carter eletroflico o capacita a reagir com alvos importantes, como enzimas, lipdeos e o genoma celular (Asad & Leito, 1991). Por esta razo, uma das formas de se suprimir a produo de ERO em diversos sistemas celulares a utilizao de captadores de ons ferro com dipiridil e desferral. Alm dos ons frricos, o cobre (Cu+) pode participar da reao de

8 Fenton, gerando o radical hidroxil. Clulas de E. coli possuem no espao periplasmtico uma enzima, cuja a atividade garante a homeostase de ions cobre, protegendo as clulas contra o estresse oxidativo (Tree et al., 2008). Fe+3 + O2- Fe+2 + O2 2O2- + 2H+ O2+ H2O2 Fe+2 + H2O2 Fe+3 + OH- + OH

Figura 1. Reao de Fenton, que faz parte do ciclo de Haber-Weiss.

Papel dos biofilmes na resistncia agentes lesivos Biofilme uma populao de clulas ligadas fortemente em vrias superfcies biticas e abiticas, e envolve a matriz hidratada de substncias hexopolimricas, protenas, polissacardeos e cidos nuclicos. (Costerton et al, 1999; Mohamed et al., 2007). Diversos estudos tm sido feitos sobre biofilme em EAEC. Sheik et al (2001) determinaram que o biofilme neste patotipo possui aspectos nicos. Dentre estes, ressaltam a importncia de duas protenas: Fis e YafK. Esses autores sugerem que a expresso da fmbria AAF necessria para a formao de biofilme na cepa prottipo EAEC 042 e que certas protenas denominadas Fis e YafK contribuem para a formao desta estrutura, via biognese da fmbria AAF/II. Aps a passagem pelo estmago, EAEC experimentaria mudanas abruptas nas condies ambientais favorveis sua proliferao, como pH adequado, alta disponibilidade de acar e osmolaridade apropriada. Sob essas condies, a bactria entraria em fase crescimento exponencial, o que induz a expresso do gene fis. A protena Fis, produto do gene fis, atuaria como um intensificador da expresso de aggR e, consequentemente, de AAF/II,

favorecendo a formao de biofilme. A formao do biofilme um processo complexo e afetado por uma combinao de mecanismos que influenciada pela superfcie celular, o substrato

9 e o meio adjacente. (Reisner et al., 2006). A bactria no biofilme comporta-se diferentemente de quando est na forma planctnica o que torna essa estrutura um mecanismo de defesa contra condies deletrias presentes no meio ambiente. Um biofilme maduro pode tolerar concentraes de antibitico 10-1000 vezes maior que o requerido para matar a bactria na vida planctnica. Alm disto, bactrias em biofilmes so resistentes fagocitose, fazendo com que o biofilme seja extremamente difcil de ser erradicado das superfcies do hospedeiro e, portanto, so fontes de muitas infeces crnicas (Reisner et al., 2006). Dados na literatura tem mostrado que microorganismos em biofilmes so mais resistentes ao de antibiticos e as ERO do que as suas respectivas formas planctnicas (Khardori et al., 1995; Ceri et al., 1999; Bonifait et al., 2008). Trs razes so apontadas para explicar esta maior resistncia: i- Bactrias em biofilmes so cercadas por uma matriz extracelular que pode restringir a penetrao e a difuso destes agentes; - Esta matriz exopolimrica por ser aninica pode ser passvel de reagir com diferentes substncias podendo absorv-las; iii- Respostas a diversos estresses induzidas dentro dos biofilmes podem promover a resistncia observada para diferentes agentes lesivos (Beloin et al., 2004).

A influncia de ons metlicos na formao de biofilmes pelas clulas bacterianas Vrios trabalhos tem mostrado a influncia de ons metlicos na formao de biofilmes. Por exemplo, cepas de E. coli uropatognicas (UPEC) tem sua capacidade de formar biofilmes diminuida quando crescidas na presena de quelantes de ferro e aumentada quando este metal adicionado ao meio de cultura (Hancock et al., 2008). Alves et al (2010) mostraram que a cepa EAEC 042 quando crescida em meio de cultura acrescido de dipiridil (um quelante de Fe+2) teve sua capacidade de formar biofilme diminuida. Contudo, neste mesmo trabalho, os autores mostraram uma resposta distinta com as cepas EAEC H9/3,

10 H92/3 e I49/3, que tiveram suas capacidades de formar biofilme aumentadas quando cultivadas na presena de quelante de ferro. No so s os ons frricos que influenciam na formao de biofilmes. Metais, como o zinco, por exemplo, quando adicionados aos meios de cultura podem inibir a capacidade de formar biofilmes, tanto por UPEC (Hancock et al., 2010) como por EAEC (Pereira et al., 2010) . O zinco, assim como o ferro, so cofatores de enzimas importantes para o metabolismo celular (Rowe et al., 2010). Os ons metlicos podem interferir na formao da matriz polimrica de biofilmes. A celulose pode ser um dos componentes desta matriz polimrica em algumas espcies bacterianas. No caso de Pseudomonas aeruginosa, altos nveis de ferro (50 M) promovem um aumento da celulose, fortalecendo a matriz polimrica. J no caso de UPEC quando o ferro quelado ocorre o aumento da sntese de celulose, favorecendo a formao da matriz (Rowe et al., 2010). Alm disto, o ferro, atravs da ativao de Fur, regula a expresso da fmbria do tipo 1 em E.coli, o que interfere na aderncia das bactrias na formao dos biofilmes (Wu & Outten, 2009).

3- JUSTIFICATIVA DO PROJETO

A aderncia bacteriana aos tecidos hospedeiros e a formao de biofilmes so processos importantes para a colonizao do hospedeiro pelos microrganismos. sabido que estes processos contam com a participao no s de adesinas como de diferentes fatores que podem interferir na formao dessas estruturas. O biofilme pode ser definido como uma comunidade de clulas associadas a uma superfcie, embebidas em uma matriz extracelular. Sua formao um processo complexo envolvendo ligao e imobilizao na superfcie, interao clula-clula, formao de microcolnias e desenvolvimento de uma estrutura tridimensional (O Toole et al., 2000). Hoje, reconhece-se que a formao do biofilme um aspecto muito relevante na maioria das doenas bacterianas. Alm disso, clulas organizadas em biofilmes so capazes de tolerar agentes antimicrobianos em concentraes

11 de 10 a 1000 vezes maiores do que as necessrias para inibir a viabilidade das mesmas cepas em sua forma planctnica. Essa estrutura tambm exibe uma resistncia extraordinria fagocitose, tornando extremamente difcil a erradicao dos biofilmes em seus hospedeiros. Numerosas bactrias formam, sob determinadas condies, essas comunidades ssseis e bem estruturadas, que permitem um modo protegido de crescimento, contribuindo para a sobrevivncia em ambientes hostis (O Toole et al., 2000). Como as ERO e ons metlicos interferem em inmeros sistemas de grande relevncia o estudo de como esses agentes podem afetar formao de biofilmes, tanto em bactrias comensais como em patognicas. Na respirao dos organismos aerbicos cerca de 5% do oxignio consumido geram ERO, como o radical anion superxido e o perxido de hidrognio (Halliwell & Gutteridge, 1999). Alm disto, as ERO so produzidas pelos hospedeiros como uma defesa contra os microorganismos invasores. Em um organismo como E. coli a produo de ERO pode ser minimizada pelo cultivo das culturas em ambiente anaerbico ou na presena de quelantes de metais, como o 2,2-dipiridil dil e desferral que captam o ferro e neocuprona que capta ons cobre. Ento, a participao de ERO e de ons metlicos em processos como resistncia formao de biofilmes pode ser avaliada atravs de estudos comparativos entre as diversas situaes de cultivo, aerobiose e anaerobiose ou na presena e ausncia de quelantes de ons metlicos. Este estudo tem sua relevncia ressaltada pela preocupao crecente de se connhecer como as condies ambientais afetam a formao de biofilmes, uma vez que a difcil a erradicao de bactrias nestas estriuras tem se tornado um dos grandes dilemas para a rea mdica e odontolgica.

12 4- OBJETIVOS: OBJETIVO GERAL

Uma vez que ons metlicos so essenciais para a sobrevivncia dos microorganismos, e que as concentraes destes nutrientes no ambiente afetam a virulncia de patgenos, neste estudo, verificaremos a influncia de ons metlicos como o ferro, cobre e zinco na formao de biofilmes por Escherichia coli enteroagregativas (EAEC).

OBJETIVOS ESPECFICOS

1. Estudos qualitativos e quantitativos de biofilmes de cepas EAEC crescidas na presena de quelantes de ferro e cobre em condies de aerobiose e anaerobiose; 2. Estudos qualitativos e quantitativos de biofilmes de cepas EAEC na presena ferro, cobre e zinco; 3. Verificao da viabilidade de biofilmes formados por cepas de EAEC crescidas na presena de quelantes de ferro e cobre, atravs de microscopia de fluorescncia; 4. Estudo sobre os efeitos do ferro na formao da matriz polimrica de biofilmes formados por cepas EAEC; 5. Avaliao da expresso de fmbrias de adeso em cepas EAEC crescidas na presena de quelante de ferro; 6. Avaliao dos efeitos do ferro, cobre e zinco sobre a hidrofobicidade das cepas EAEC;

13 5- MATERIAIS E MTODOS

Cepas bacterianas utilizadas no estudo e a conservao dos estoques bacterianos As cepas de EAEC foram isoladas de fezes de crianas com diarria aguda menores de 2 anos de idade e esto relacionadas na TABELA 1. As cepas foram procedentes de crianas atendidas no servio de Pediatria do Hospital Universitrio Pedro Ernesto da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (HUPEUERJ), tendo sido previamente caracterizadas quanto ao padro de aderncia clulas HEp-2, onde apresentaram o padro de aderncia agregativa aps 6 horas de incubao. A sorotipagem das cepas estudadas foi realizada pela Dra. Kinue Irino da Seo de Bacteriologia, do Instituto Adolpho Lutz, So Paulo, segundo as recomendaes adotadas por Edwards & Ewing (1972). As cepas tambm foram caracterizadas quanto a presena do plasmdeo pAA e dos genes aggA (AAF/I), aafA (AAF/II), agg3A (AAF/III), pet (plasmid enconded toxin), pic (protena envolvida na colonizao), astA (EAST1 enterotoxina termoestvel de EAEC), aap (dispersina, antiga aspU), aggR (regulador transcricional) e fyuA e irp2 (genes envolvidos na captura de ferro) (Rosa et al., 1998). As cepas controle a serem empregadas no presente estudo sero a EAEC 042 (controle positivo), EPEC E2348/69, E. coli DH5 e E. coli HB101. As cepas sero estocadas em tubos de plstico com rosca contendo 1 mL de meio GC com glicerol 20% (v/v) e mantidas em temperatura de -20C e -70oC. Alquotas dos tubos do estoque mantido temperatura de -20C sero utilizadas para a realizao dos testes e os tubos mantidos a -70C constituiro o estoque permanente.

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TABELA 1 Cepas de Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) isoladas de crianas com diarria aguda menores que 2 anos de idade a serem utilizadas no estudo

Cepa H9/3 I49/3 H92/3 H 1/4

a

Sorotipo O113: H12 O117: H27 O86: H18 ONT: H17

Padro de Adernciaa AA AA AA AD

Marcadores pAA, pet, aap, aggR, fyuA, irp2 pAA, pet, pic, agg3A, astA, aap, aggR, irp2 pAA, pic, aggA, aap, aggR,fyuA,irp2 pAA, aggA, aggR,aap, fyuA, irp2, pet, pic

Padro definido em testes de aderncia com clulas Hep-2, aps 6 horas de infeco

AA, aderncia agregativa;AD, aderncia difusa; pAA, plasmdeo de aderncia agregativa; aap, dispersina (antiga aspU); aggR, regulador transcricional; pet, plasmid encoded toxin; pic, protein involved in colonization; agg3A, fmbria de aderncia agregativa III; astA, protena termo-estvel; aafI, fmbria de aderncia agregativa I; fyuA e irp2, genes envolvidos na captura de ferro encontrado em Yersinia spp.

Teste de biofilme qualitativo de cepas EAEC crescidas na presena de quelantes de ferro e cobre em condies de aerobiose e anaerobiose

As cepas sero inoculadas em 2mL de Caldo Trypticase Soja (TSB, Merck, S. A) contendo o quelante de ferro 2,2-dipiridil (Sigma) ou o quelante de cobre neocuproina (Sigma) na concentrao de 500 M e incubadas em estufa a 37C por um perodo de 18 horas sob condies aerbicas e anaerbicas. Alquotas de 10L de cada cultura sero transferidas para 1 mL de meio D-MEM (Dulbeccos Minimal Essential medium, Gibco-BRL distribudos em cada orifcio de uma placa de 24 orifcios (TPK) contendo lamnulas de vidro de 13 mm de dimetro, previamente esterilizadas. A placa ser incubada por 18 horas a 37 C em

15 aerobiose e anaerobiose. Aps o perodo de incubao, as lamnulas sero lavadas 3 vezes com PBS-D e, em seguida, fixados com metanol por 15 minutos. Para colorao das lamnulas ser utilizado o corante cristal violeta (Laplast Labor) 0,5% por 5 minutos. As lamnulas sero lavadas com gua destilada, secas, dispostas sobre lmina de vidro com meio de incluso rpida para microscopia (Entellan, Merck S.A., Rio de Janeiro) e em seguida sero observadas em microscpio ptico (Nikon) (Sheikh et al., 2001).

Teste de biofilme quantitativo de cepas EAEC crescidas na presena de quelantes de ferro e cobre em condies de aerobiose e anaerobiose

A viabilidade de biofilmes formados por culturas crescidas na presena de dipiridil ou neocuproina, tanto em aerobiose como em anaerobiose, ser avaliada atravs da contagem de clulas aderidas ao biofilme. Para tal, os poos sero lavados trs vezes com a mesma soluo salina e adicionados de Triton X100 (Bio-Rad, EUA) 0,1% para a remoo das bactrias aderidas na superfcie. Uma alquota desta suspenso ser, ento, retirada, diluda em PBS e plaqueada em TSA. Aps 18h, ser realizada a contagem das unidades formadoras de colnia (UFC).

Teste de biofilme quantitativo de cepas EAEC crescidas na presena de quelantes de ferro e cobre em condies de aerobiose e anaerobiose

O nmero de unidades formadoras de colnia (UFC) nos biofilmes formados pelas cepas EAEC ser realialida atavs da contagem do nmero de unidades formadoras de colnias (UFC) nos biofilmes formados na presena de dipiridil ou neocuproina e tambm em aerobiose ou anaerobiose ser avaliada atravs aps 18 de incubao..

16 Para tal, os poos sero lavados trs vezes com a mesma soluo salina e adicionados de Triton X100 (Bio-Rad, EUA) 0,1% para a remoo das bactrias aderidas na superfcie. Uma alquota desta suspenso ser, ento, retirada, diluda em PBS e plaqueada em TSA.

A viabilidade das bactrias nos biofilmes de cepas EAEC crescidas o Kti FilmTracer LIVE/DEAD Biofilm Viability (invitrogem)

A viabilidade bacteriana nos biofilmes formados na presena de quelantes de ferro e cobre e tambm em condies de aerobiose e anaerobiose presena de dipiridil ou neocuproina e tambm em aerobiose e anaerobiose ser determinada atravs do Kti FilmTracer LIVE/DEAD Biofilm Viability (invitrogem) aps 18 de incubao. lavadas com gua destilada estril, dispostas sobre lmina de vidro e em seguida sero observadas em microscpio de fluorescncia.

Aderncia ao n-hexadecano de cepas crescidas na presena de ferro, cobre e zinco As culturas de EAEC crescidas na presena de 10 M de ferro (FeCl3), 10 M de cobre (CuCl2) ou 500 M de zinco (ZnSO4) sero lavados trs vezes com PBS (0,01M, pH 7.2) e ressuspensos neste mesmo tampo em absorbncia (DO) de 0.5 (=570nm), aferidos em espectrofotmetro B295II (Micronal, Rio de Janeiro, RJ, Brasil). Em seguida, 2 mL das suspenses bacterianas sero adicionadas de 400l de n-hexadecano (Sigma), agitadas por um minuto e incubadas por quinze minutos de modo a ocorrer a partio de fases da mistura. O percentual de micoorganismos aderidos ao hidrocarboneto ser determinado a partir da DO do inculo bacteriano inicial da seguinte forma: [suspenso bacteriana inicial (DO 570nm) fase aquosa aps 15 minutos (DO 570nm)] / suspenso bacteriana inicial (DO 570nm)] x 100 (Mattos-Guaraldi et al, 1999). Os ensaios sero realizados em triplicata.

17 Preparao e anlise de proteinas de membrana externa das cepas EAEC crescidas na presena de dipiridil Para o fracionamento do envoltrio externo utilizaremos 35 mL de cultura crescida em caldo LB por 18 horas na ausncia ou presena de 500 M de dipiridil. A cultura ser centrifugada a 8000 rpm, 4 C, durante 15 min e o precipitado ser ressuspenso em 5 mL de tampo fosfato. As clulas sero rompidas por pulsos de ultra-som e centrifugadas a 5000 rpm, 4 C, durante 15 min. O sobrenadante ser recolhido e centrifugado em centrfuga eppendorf refrigerada por 45 min a 13000 rpm. Posteriormente, o precipitado ser ressuspenso em 50 L de PBS e sero adicionados 100 L de sarkosyl 3% e a soluo ser incubada por 20 min em temperatura ambiente. Aps a incubao a soluo ser centrifugada por 20 min a 13000 rpm e o precipitado ressuspenso em tampo fosfato. As protenas de membrana externa sero analisadas em gel SDSPage (8%) contendo 6 M de uria, para melhorar a resoluo das porinas (Miller et al., 2004). O gel ser corado com Coomassie brilliant blue.

6 - PLANO DE TRABALHO:
1o semestre: avaliar os biofilmes de cepas EAEC crescidas na presena de quelantes de ferro e cobre em condies de aerobiose e anaerobiose; avaliar os biofilmes de cepas na presena ferro, cobre e zinco. 2o semestre: verificar a viabilidade de biofilmes formados por cepas de EAEC crescidas na presena de quelantes de ferro e cobre atravs de microscopia de fluorescncia; estudar os efeitos do ferro na formao da matriz polimrica de biofilmes formados por cepas EAEC 3o semestre: avaliar a expresso de fmbrias de adeso em cepas EAEC crescidas na presena de quelantes de ferro; avaliar os efeitos do ferro, cobre e zinco sobre a hidrofobicidade das cepas EAEC. Avaliao de resultados. 4o semestre: Avaliao de resultados; defesa da dissertao.

18 7 - REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS:

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