ARPAT

Agenzia Regionale Protezione Ambiente

Dipartimento di Grosseto
Via Fiume 37, 58100 Gr

SPECIAZIONE

Relatori Ettore Lorenzoni, Chiara Martini e Roberto Netti



Livorno 08/11/2006






1- Introduzione
La determinazione dellarsenico nella matrice acquosa viene effettuata, nel Dipartimento ARPAT di
Grosseto, mediante spettrofotometria di emissione atomica con sorgente al plasma ad
accoppiamento induttivo ICP-OES con il metodo Sviluppo di Idruri. Tale metodo sfrutta la
caratteristica del composto Arsina AsH
3,
dellarsenico trivalente, che si decompone facilmente ad
arsenico gi alla temperatura di 250C. La riduzione avviene in due tempi: in un primo momento vi
una riduzione di tutto larsenico presente in soluzione ad arsenico trivalente, poi in un secondo
momento a mezzo del sodio boro idruro NaBH4 vi la formazione dellAsH3 che immediatamente
si trasforma in arsenico metallico. Questultimo viene cos analizzato. La concentrazione viene
determinata per confronto con una curva di calibrazione. Il limite di rivelabilit del metodo di
1g/L.
In questo momento il Laboratorio del Dipartimento ARPAT di Grosseto sta mettendo in conformit
un metodo di determinazione dellarsenico nella matrice acquosa mediante spettrometria di massa
con sorgente di ioni al plasma accoppiato induttivamente ICP-MS; il metodo UNI EN ISO 1749-2
DEL 2005. Tale metodo si basa sulla formazione di ioni, appunto, nel plasma e sulla loro
determinazione in funzione del loro rapporto massa/carica. Larsenico viene determinato alla massa
75 e dato che questo metodo molto pi sensibile del precedente il limite di rivelabilit calcolato
0.2g/L.
Nella routine la determinazione dellarsenico avviene non solo nella matrice acquosa ma anche
nelle matrici solide quali suoli, vegetali, fanghi, piante acquatiche, pesci, etc.
Il dipartimento di Grosseto, unico in ARPAT, inoltre attrezzato per eseguire la Speciazione di
metalli grazie allaccoppiamento strumentale HPLC-ICP-MS, cio cromatografia liquida ad elevate
prestazioni e spettrometria di massa con sorgente ionica al plasma. Questo accoppiamento permette,
a mezzo di una colonna cromatografica opportuna, di separare le specie a diverso stato di
ossidazione, e poi a mezzo dellICP-MS rivelarne la presenza e la quantit. Sono gi stati messi a
punto i metodi per la speciazione del Cromo e dellArsenico; e per quanto riguarda il cromo sono
gi state effettuate molte determinazioni sulle acque provenienti dalla zona costiera di Livorno.


2- Speciazione
Per speciazione si intende la distribuzione di un metallo, presente in un determinato campione, tra
diverse forme o specie. E utile distinguere la speciazione in Speciazione Fisica del metallo, intesa
come la sua distribuzione tra forme solubili, colloidali o sottoforma di particolato, e Speciazione
Chimica, intesa come la sua distribuzione tra varie distinte specie chimiche in soluzione,
comprendendo sia la distinzione tra metallo complessato e metallo libero, sia la distinzione tra i
diversi stati di ossidazione. Ovviamente, se viene effettuata unanalisi quantitativa, la somma delle
concentrazioni delle varie forme deve essere uguale alla concentrazione totale.
Lanalisi di speciazione viene effettuata in quanto la concentrazione totale di un certo elemento in
una data matrice (acqua, terreno, alimenti, etc.) non permette di trarre conclusioni significative sul
destino dellelemento in termini di mobilit, biodisponibilit e tossicit.
Un esempio dovuto allarsenico, che in forma inorganica estremamente tossico, mentre in forma
organica (arsenobetaina) relativamente innocuo, ma non solo, larsenico trivalente inorganico
molto pi tossico del pentavalente. Al contrario, i composti inorganici del mercurio, dello stagno e
del piombo sono generalmente molto meno tossici dei relativi composti organometallici quali Sn-
dibutile, Sn-trifenile, Pb-tetraetile, Hg-dimetile, etc. La forma Metilmercurio molto pi tossica
delle altre forme di mercurio, tanto di quello in forma ionica che di quello elementare sottoforma di
vapore. La sua tossicit dovuta al fatto che riesce ad attraversare facilmente lo strato lipidico delle
membrane cellulari. I composti inorganici del cromo, invece, sono molto pi tossici di quelli
organici ed il cromo esavalente molto pi tossico del trivalente.
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Un altro esempio importante si ha con il selenio: la sua concentrazione totale in un alimento pu
essere dovuta alla presenza di Selenio(VI), altamente tossico per luomo, oppure alla presenza di
Selenio(IV), usato come additivo negli alimenti per prevenire la deficienza dellelemento
nellorganismo. Nelle acque naturali e nei suoli il selenio si trova prevalentemente nella forma
inorganica come Se(IV) e Se(VI). Nei campioni biologici, animali, piante e microorganismi, il
selenio si trova sottoforma di specie organiche quali composti metilati, seleno-amminoacidi e
seleno-proteine. I composti seleno-organici sono meno tossici di quelli inorganici; inoltre, quelli
organici meno tossici sono anche i pi volatili e sono i metilati, ad esempio DMSe
(dimetilseleniuri) e DMDSe (dimetil diseleniuri). Proprio per questa differenza di comportamento
delle forme organiche ed inorganiche dei metalli e dei non metalli che, molto importante
conoscere non solo il contenuto totale del metallo stesso in una determinata matrice, ma essenziale
conoscere la sua distribuzione nelle varie forme chimiche.

3- Cromo
Il Cromo uno dei metalli pi interessanti sotto il profilo alimentare, ambientale e tossicologico; in
natura presente principalmente in due stati dossidazione: Cr(III) e Cr(VI). Queste due specie si
comportano in maniera completamente diversa tanto da giustificare quello che noto come il
paradosso del cromo. Infatti, il Cr(III) un micronutriente per i mammiferi e per luomo in quanto
un costituente essenziale di un fattore di tolleranza del glucosio. Daltro canto, per il Cr(VI)
esistono solo informazioni drasticamente differenti: non ha un ruolo biologico ed ha unelevatissima
tossicit ( sicuramente cancerogeno per inalazione). E dimostrato che in certe determinate
condizioni di Temperatura, Umidit, pH della soluzione e composizione chimica della matrice,
lequilibrio:

Cr(III)Cr(VI)

pu spostarsi a destra. Integrando i dati di letteratura con ci che stato sperimentato nel
laboratorio di Grosseto, possibile dire:
- a temperatura maggiore di 500C il Cr(III) si trasforma in Cr(VI);
- in ambiente acido in soluzione c solamente Cr(III);
- in ambiente basico si ha una fotografia dellequilibrio Cr(III)Cr(VI);
- il Cromo(III) insolubile in soluzione acquosa;
- il Cromo(VI) la forma che ha maggiore mobilit ambientale;
- in una matrice ricca di composti riducenti (quali i solfuri) lequilibrio Cr(III)Cr(VI) spostato
a sinistra.
Le fonti di inquinamento da Cromo sono numerose; infatti, esso utilizzato nellindustria
siderurgica, nella produzione di pitture, pigmenti, mordenti per tintorie, ceramiche, vetro,
nellindustria galvanica e conciaria. Queste attivit producono accumulo di residui di lavorazione di
composizione varia ma comunque contenenti elevate concentrazioni di Cromo. Tali residui vengono
sottoposti a processi di rimozione o recupero delle varie specie del cromo, ma spesso vengono
smaltiti mediante fertilizzazione dei suoli agricoli. Questa pratica viene giustificata dallevidenza
che il cromo presente prevalentemente come Cr(III) e che quindi sufficientemente insolubile per
non danneggiare lambiente. Daltro canto, per, una pi o meno piccola percentuale di Cr(VI)
presente ed questa che provoca danni ambientali in quanto la forma pi mobile.
Per ci che concerne la legislazione italiana in materia di acque i limiti previsti per il cromo, in
concentrazione totale e concentrazione nelle due specie, sono:

il Decreto Legislativo 152/1999, in materia di tutela delle acque dallinquinamento fissa, per le
acque sotterranee, 50g/L per Cr(III)+Cr(VI) e 5g/L per il Cr(VI); mentre per le acque superficiali
destinate alla potabilizzazione 50g/L per Cr(III)+Cr(VI); per le acque idonee alla vita dei
salmonidi un range che va da 5 a 50g/L per Cr(III)+Cr(VI), in funzione della durezza;
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il Decreto Legislativo 31/2001, in materia di qualit delle acque destinate al consumo umano,
fissa una concentrazione massima ammissibile di 50g/L per Cr(III)+Cr(VI).
Il decreto Legislativo 367/2003 in materia di sostanze pericolose pone come limite del cromo
totale, per il 200, 4g/L nelle acque dolci.


3.1- Speciazione del cromo
La speciazione del cromo viene effettuata utilizzando la combinazione di due tecniche analitiche
Cromatografia Ionica (HPLC) e ICP-MS. Il laboratorio di Grosseto dotato dellaccoppiamento
strumentale HPLC-ICP-MS DRC, in cui la separazione delle due specie Cr(III)/Cr(VI) viene
effettuata con Cromatografo Ionico DIONEX a gradiente, dotato di autocampionatore e la loro
determinazione viene eseguita con rivelatore ICP-MS DRC con acquisizione sulla massa 52.
La scelta dellutilizzo del Cromatografo Ionico DIONEX stata fatta in quanto non avendo parti
in acciaio ed usando come eluente acido nitrico, durante la speciazione, non c il rischio di
eventuali cessioni di cromo da parte della strumentazione. Il rivelatore, come sopradetto, lICP-
MS Elan DRC II PerkinElmer che, dotato di un software aggiuntivo CHROMERA, riesce a
gestire lanalisi di speciazione. Grosseto stato il primo laboratorio in Italia a cui Perkin Elmer ha
installato il software Chromera.
Il cromatografo ionico ed il rivelatore ICP-MS comunicano a mezzo di una valvola particolare
(switching-valve), gestita dal software Chromera, che permette automaticamente lingresso
allICP-MS delle due forme del Cromo, a fine separazione cromatografica, e lingresso della
soluzione di lavaggio, quando non c campione, commutando leluente sulla linea dello scarico.
La gestione del campionamento (quindi dello start dellanalisi) e della separazione
cromatografica effettuata completamente dalla pompa del Cromatografo Ionico; per cui per far
comunicare lentrata del campione nellICP-MS necessaria una perfetta sincronia dei tempi di
analisi dei due strumenti.
Per quanto riguarda sia i campioni di acqua che i campioni di suolo (opportunamente trattati), le
condizioni strumentali sono le seguenti:
- colonna di separazione: utilizzata solamente una precolonna (Pax-100)
- leluente acido nitrico 0.1 M
- loop da 100 L
- flusso 1 mL /minuto
- tempo di durata della corsa analitica: due minuti
- standard del Cromo(VI): potassio Bicromato
- standard del Cromo(III): standard di Cromo a 1000mg/L.
Per ci che concerne il rivelatore ICP-MS, durante lanalisi viene attivata la cella di reazione
dinamica con gas di reazione Metano che elimina le eventuali interferenze isobariche poliatomiche
date da Ar-C
+
. Ovviamente, le due specie Cr(III) e Cr(VI) vengono analizzate entrambe come
Cromo.
Infine, stato determinato il limite di rivelabilit del Cromo eseguendo 10 repliche del bianco e tre
repliche per ogni livello della curva di taratura e ponendo tutti i dati ottenuti nel modulo 39 fornito
dal sistema qualit. Il limite ottenuto 0.5g/L.









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SPECIAZIONE DEL Cr(III) E Cr(VI) IN CAMPIONI DI ACQUA

Riferimento campionamento e stabilizzazione METODO APAT IRSA-CNR

La determinazione dei campioni di acqua effettuata iniettando 100 L di campione, tal quale
non acidificato e conservato refrigerato a 4C, nel comatografo ionico ed eluendo con acido nitrico
1M.
La curva di taratura utilizzata costruita sui seguenti quattro punti:

Cr(III) Cr(VI)
1-BIANCO

2-STD 1 2.5 ppb 3.2 ppb

3-STD 2 5 ppb 6.4 ppb

4-STD 3 25 ppb 32 ppb



DETERMINAZIONE DEL Cr(VI) IN CAMPIONI DI SUOLO

METODO EPA-3060A


Reagenti:

- Soluzione estraente (5.7)
Dissolvere 10g di NaOH e 15g di Na
2
CO
3
in 500 mL di acqua dist.

- Soluzione Tampone Fosfato (5.5.3)
Dissolvere 8.7g di K
2
HPO
4
e 6.8g di KH
2
PO
4
in 100 mL di acqua dist.

- MgCl
2
*6H
2
O



A) METODO MICRO-ONDE
In un vial per microonde (Ethos) pesare 1g di campione tal quale (refrigerato), aggiungere 10 mL
di soluzione estraente (5.7), 0.1 mL della soluzione tampone (5.5.3) e 650 mg (circa) di
MgCl
2
*6H
2
O.
Agitare bene e chiudere i vials con inserto il controllo di temperatura, quindi effettuare
lestrazione in Forno a microonde utilizzando il Programma Cromo speciaz (90C per 60
minuti).
Dopo raffreddamento , trasferire quantitativamente in Vial tarato da 50 mL con acqua (MQ).
Diluire 1 a 10 e filtrare su filtro monouso a 0.45 m .


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B) METODO SU PIASTRA RISCALDANTE
In un Beaker in vetro da 100mL pesare 2.5g di campione tal quale (refrigerato) aggiungere 50mL
di soluzione estraente (5.7), 0.5 mL della soluzione tampone (5.5.3) e 3.3 g (circa) di
MgCl
2
*6H
2
O.
Il Beaker, viene posto su piastra riscaldante sotto costante agitazione alla temperatura di 90C per
60 minuti coperto con vetro ad orologio.
(Sulla piastra riscaldante AP-09-0296 impostare 200 C)
Dopo raffreddamento, trasferire quantitativamente in Matraccio tarato da 100 mL classe (A) con
acqua (MQ).
Diluire 1 a 10 e filtrare su filtro monouso a 0.45 m.
Gli estratti cos ottenuti vengono direttamente iniettati nel sistema combinato Cromatografo
Ionico/ICP-MS (Metodo predisposto per la speciazione del Cromo).


4- Arsenico
Larsenico uno degli elementi chimici che ha caratteristiche chimiche e fisiche comprese tra
quelle dei metalli e dei non metalli: un metalloide.
Nellambiente naturale i composti dellarsenico sono ubiquitari e sono rappresentati principalmente
da arseniuri ed arsenopiriti ed uno degli elementi pi mobili sia nellidrosfera che nellatmosfera.
Larsenico esiste sia allo stato trivalente che pentavalente ed i suoi composti possono essere sia
inorganici che organici. Le quattro specie di maggior importanza sono quelle inorganiche larsenite
(AsIII) e larseniato (AsV) e quelle organiche lacido metilarsonico (MMAA) e lacido
dimetilarsinico (DMAA). I composti inorganici trivalenti sono molto pi tossici di quelli
pentavalenti sia per i mammiferi che per le specie acquatiche. Le specie inorganiche sono molto pi
tossiche di quelle organiche alla luce del fatto che quelle organiche possono essere trasformate nelle
pi tossiche forme inorganiche a seconda delle condizioni ambientali, che sono funzione del pH e
dellEh.
Fig. 1

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I pi comuni composti inorganici sono: lossido di arsenico trivalente As
2
O
3
e lossido
pentavalente As
2
O
5
. In acqua tali ossidi danno gli acidi corrispondenti: acido arsenioso H
3
AsO
3
e
acido arsenico H
3
AsO
4
.
Molti suoli contengono vari mg/L di arsenico, le acque di mare ne contengono alcuni g/L, la
concentrazione di arsenico nelle acque superficiali varia notevolmente in relazione al tipo di
sorgente presente in quellarea, anche nellaria c presenza del metallo come materiale particolato.
Larsenico rappresenta un raro esempio di sostanza tossica la cui presenza nellatmosfera
diminuita negli ultimi anni. Questa situazione stata determinata, oltre che dalla adozione di sistemi
di abbattimento dellarsenico negli scarichi, anche dalla sostituzione dei pesticidi arsenicali con altri
composti. I pesticidi a base di arsenico utilizzati in passato erano:
Pb
3
(AsO
3
)
2
Arseniato di piombo Insetticida
Ca
3
(AsO
3
)
2
Arseniato di calcio Erbicida
Na
3
AsO
3
Arsenito di sodio Erbicida
Cu
3
(AsO
3
)
2
Verde di Parigi Erbicida
Larsenico cancerogeno per luomo per inalazione e probabilmente anche per ingestione.
Larsenico(III) risulta pi tossico dellarsenico(V), sebbene il secondo venga ridotto ad arsenico
(III) allinterno dellorganismo umano. Si pensa che la notevole tossicit dellAs(III) sia dovuta al
fatto che questo viene trattenuto dal corpo pi a lungo dato il suo legame con i gruppi solfidrilici di
proteine, enzimi, coenzima A e glutatione ridotto.
I composti di arsenico organico sono generalmente considerati assorbibili in bassa misura dai
mammiferi e vengono rapidamente eliminati con le urine.
Larsenico pentavalente, leggermente meno tossico della forma trivalente, inibisce i sistemi
enzimatici. La tossicit dellarsenato stata spiegata in termini di imitazione molecolare, in
quanto larsenato imita il fosfato e viene perci trasportato attraverso le membrane cellulari su
trasportatori di fosforo.
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Le pi comuni forme organiche dellarsenico non sono semplici derivati metilici ma acidi
idrosolubili che possono essere escreti, risultando quindi meno tossici di alcune forme inorganiche.
In particolare nellacqua larsenico si trova spesso come H
3
AsO
4
(AsV) o come una delle forme
metilate di questo. Il processo biologico di metilazione che avviene nellambiente grazie alla
metilcobalammina interessa in un primo momento la sostituzione di uno o pi gruppi ossidrili (OH)
da parte di gruppi CH
3
; la monometilazione che avviene nel fegato e nei reni dell'uomo converte la
maggior parte (ma non tutto) dellarsenico inorganico ingerito in (CH
3
)(OH)AsO che viene escreto.
Le forme di arsenico riscontrabili nei molluschi sono: (CH
3
)As
+
, Arsenobetaina, Arsenocolina. Al
contrario le forme neutre dellAs(III) sono quelle pi tossiche: AsH
3
, (CH
3
)
3
As. Curiosamente il
composto trimetilico viene prodotto in condizioni di umidit dalle muffe presenti nella colla da
parati sui pigmenti di tale carta contenenti arsenico.
LAs
2
O
3
viene assorbito attraverso i polmoni e lintestino. Dal punto di vista biochimico larsenico
si lega alle proteine coagulate e forma complessi con i coenzimi ed inibisce la produzione dellATP
nei processi metabolici essenziali.
Nel D.Lgs. 31/2003 il limite 10g/L per le acque potabili.
Il 152/1999 in materia di tutela delle acque dallinquinamento prevede criteri di qualit diversificati
in funzione degli usi: 10g/L per le acque sotterranee; 10-100g/L, in funzione dei trattamenti
chimico-fisici previsti, per le acque superficiali destinate alla potabilizzazione; 50g/L per le acque
idonee alla vita dei pesci.
Larsenico inoltre contemplato come sostanza pericolosa nel D.Lgs. 367/2003 dove il suo limite
nelle acque dolci dovr scendere a 5g/L entro il 2008.
Comunque i valori citati dalle varie leggi sono sempre riferiti alla concentrazione di Arsenico totale
nelle acque.


4.1- Speciazione dellarsenico
La speciazione dellArsenico viene effettuata utilizzando la combinazione di due tecniche analitiche
Cromatografia Ionica (HPLC) e ICP-MS. Il laboratorio di Grosseto dotato dellaccoppiamento
strumentale HPLC-ICP-MS DRC, in cui la separazione delle due specie As(III)/As(V) viene
effettuata con Cromatografo Ionico DIONEX a gradiente, dotato di autocampionatore e la loro
determinazione viene eseguita con rivelatore ICP-MS DRC con acquisizione sulla massa 75.
La scelta dellutilizzo del Cromatografo Ionico DIONEX stata fatta in quanto non avendo parti
in acciaio ed usando come eluente acido nitrico, durante la speciazione del Cromo non c il rischio
di eventuali cessioni di cromo da parte della strumentazione. Il rivelatore, come sopradetto,
lICP-MS Elan DRC II PerkinElmer che, dotato di un software aggiuntivo CHROMERA,
riesce a gestire lanalisi di speciazione. Grosseto stato il primo laboratorio in Italia a cui Perkin
Elmer ha installato il software Chromera.
Il cromatografo ionico ed il rivelatore ICP-MS comunicano a mezzo di una valvola particolare
(swiching-valve), gestita dal software Chromera, che permette automaticamente lingresso
allICP-MS delle due forme dellArsenico, a fine separazione cromatografica, e lingresso della
soluzione di lavaggio, quando non c campione, commutando leluente sulla linea dello scarico.
La gestione del campionamento (quindi dello start dellanalisi) e della separazione
cromatografica effettuata completamente dalla pompa del Cromatografo Ionico; per cui per far
comunicare lentrata del campione nellICP-MS necessaria una perfetta sincronia dei tempi di
analisi dei due strumenti.
Le condizioni strumentali sono le seguenti:
- colonna di separazione: utilizzata solamente una colonna (Rp-8 (3 m) da 25 cm)
- La fase mobile (eluente ) Tetrabutil ammonio idrossido (TBAH) 1 mM + Acido Etile Diammino
Tetraacetico (sale di potassio) 0.5 mM + 5% di Metanolo portati a pH =2 utilizzando acido nitrico o
Idrossido di Ammonio.
- loop da 100 L
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- flusso 1.5 mL /minuto
- tempo di durata della corsa analitica: sette minuti
- standard dellAs(III): Arsenico Ossido (As
2
O
3
)-( 99.99% Sigma-Aldrich) Cod.25548-3
- standard dellAs(V): Arseniato di Sodio Bibasico eptaidrato (Na
2
HasO
4
.7H
2
O)(99.998% Sigma
Aldrich) Cod.455877
Per ci che concerne il rivelatore ICP-MS, durante lanalisi viene attivata la cella di reazione
dinamica con gas di reazione Metano che elimina le eventuali interferenze isobariche poliatomiche
date da Ar-Cl
+
. Le due specie As(III) e As(V) vengono analizzate entrambe come Arsenico.



SPECIAZIONE DELLAs(III) E As(V) IN CAMPIONI DI ACQUA

La determinazione dei campioni di acqua effettuata iniettando 100 L di campione, tal quale
non acidificato e conservato refrigerato a 4C, nel cromatografo ionico ed eluendo con la fase
mobile sopra indicata.
La curva di taratura utilizzata costruita sui seguenti quattro punti:

As(III) As(V)

1-BIANCO

2-STD 1 3.15 ppb 3.08 ppb

3-STD 2 6.3 ppb 6.16 ppb

4-STD 3 31.5 ppb 30.8 ppb


A seguire, le curve di taratura delle due specie del cromo e dellArsenico e i relativi
cromatogrammi.


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