Tesis 285

OBTENCIN DE UN SUSTRATO FERMENTABLE DE ORIGEN VEGETAL Y SU
EVALUACIN CON CLULAS LIBRES DE Saccharomyces cerevisiae.

JOHANNA CAROLINA BUITRAGO ESTRADA
DOLLY GISELLE TENJO CAMACHO

TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar el titulo de

Microbilogo Industrial

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Bogot, D.C.
Enero 2007

Articulo 23 de la Resolucin N13 de julio de 1946

La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velar porque no se publique nada
contrario al dogma y a la moral catlica y porque las tesis no contengan ataques
personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de
buscar la verdad y la justicia.



APROBADO

Balkys Quevedo Hidalgo
Ingeniera Quimica M.Sc.
Director

Ivonne Gutirrez
Bacteriloga M.Sc
Jurado

Adriana Matiz
Bacteriloga M.Sc
Codirector

Andrea Aguirre
Bacteriloga M.Sc
Jurado



APROBADO

___________________________
Angela Umaa Ph.D
Decana Acadmica
___________________________
David Gmez Mndez
Director de carrera

V

Agradecemos a nuestros padres y hermanos: Alba, Freddy, Jonathan, Blanca,
Gabriel, Angela y Delvin por su apoyo incondicional y por transmitirnos la fuerza
para seguir adelante. A los amigos y compaeros del laboratorio de
Biotecnologa Aplicada por la colaboracin y nimo que nos brindaron. A la
Ingenera Balkys Quevedo por su compromiso, dedicacin, conocimiento,
paciencia y amistad. A la Doctora Adriana Matiz por su paciencia, comprensin y
conocimiento transmitido. Y a todas aquellas personas que no mencionamos
gracias por ayudarnos a lograr esta meta.

VI
TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN
ABSTRACT
INTRODUCCIN
2. MARCO TERICO ___________________________________________________ 2
2.1 Uso de residuos vegetales ___________________________________________ 2
2.2 Cultivo de Crisantemo (Dendranthema grandiflora) ________________________ 2
2.3 Celulosa _________________________________________________________ 3
2.4 Pretratamientos de residuos vegetales__________________________________ 5
2.5 Obtencin de etanol ________________________________________________ 6
2.6 Microorganismos fermentativos _______________________________________ 7
2.7 Saccharomyces cerevisiae ___________________________________________ 7
2.7.1 Requerimientos nutricionales _______________________________________ 8
2.7.2 Metabolismo de Saccharomyces cerevisiae __________________________ 11
2.7.2. Tolerancia al etanol______________________________________________ 12
2.8. Determinacin de azcares reductores_________________________________ 13
3. JUSTIFICACIN____________________________________________________ 14
4. OBJETIVOS _______________________________________________________ 16
4.1. Objetivo general ___________________________________________________ 16
4.2. Objetivos especficos _______________________________________________ 16
5. MATERIALES Y MTODOS___________________________________________ 17
5.1. Ubicacin _______________________________________________________ 17
5.2. Obtencin del sustrato fermentable ___________________________________ 17
5.2.1. Microorganismos________________________________________________ 17
5.2.2. Residuo Vegetal ________________________________________________ 17
5.2.3. Pretratamiento del residuo vegetal __________________________________ 18
5.2.3.2. Pretratamiento qumico con perxido de hidrgeno (delignificacin oxidativa) 18
5.2.4. Pretratamiento biolgico __________________________________________ 19
5.2.4.1. Fermentacin discontinua del residuo vegetal por parte del consorcio celuloltico
19
5.2.4.1.1. Preparacin del inculo___________________________________________ 19
5.2.4.1.2. Fermentacin discontinua_________________________________________ 19
5.2.5. Determinacin de actividad celuloltica cuantitativa _____________________ 20
5.2.5.1. Actividad celuloltica a pH 7 _______________________________________ 20
5.2.5.2. Actividad celuloltica a pH 5 _______________________________________ 21
5.3. Evaluacin del Sustrato con Saccharomyces cerevisiae ___________________ 21
5.3.1. Fermentacin discontinua control ___________________________________ 21
5.3.1.1. Preparacin del inculo___________________________________________ 22
5.3.1.2. Fermentacin discontinua_________________________________________ 22

VII
5.3.2. Fermentacin discontinua con sustrato vegetal (SF) ____________________ 22
5.3.2.1. Preparacin del inculo___________________________________________ 22
5.3.2.2. Fermentacin discontinua_________________________________________ 23
5.3.3. Determinacin de azcares reductores por la tcnica del cido 3,5dinitrosaliclico
(DNS) ________________________________________________________ 23
5.3.4. Determinacin de biomasa por peso seco en funcin del tiempo___________ 24
5.3.5. Determinacin de etanol __________________________________________ 24
5.3.6. Determinacin de rendimientos ____________________________________ 25
5.3.7. Anlisis estadstico ______________________________________________ 25
6. RESULTADOS Y DISCUSION _________________________________________ 27
6.1 Pretratamiento del residuo vegetal ____________________________________ 27
6.2 Fermentacin discontinua del residuo vegetal con el consorcio celuloltico _____ 30
6.2.1 Residuo vegetal al 10% (p/v) ______________________________________ 30
6.2.2 Residuo vegetal al 12% (p/v) ______________________________________ 35
6.2.3 Residuo vegetal al 5% (p/v) _______________________________________ 36
6.3 Evaluacin del sustrato fermentable con Saccharomyces cerevisiae__________ 38
6.3.1 Fermentacin discontinua control ___________________________________ 38
6.3.1.1 Fermentacin control con 20 g/L de glucosa __________________________ 39
6.3.1.2 Fermentacin control con 2 g/L de glucosa ___________________________ 41
6.3.2 Fermentacin discontinua del sustrato fermentable con Saccharomyces
cerevisiae _____________________________________________________ 43
CONCLUSIONES_________________________________________________________ 49
RECOMENDACIONES_____________________________________________________ 51
BIBLIOGRAFA___________________________________________________________ 52
ANEXOS________________________________________________________________ 59

VIII
INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Azcares reductores liberados en funcin del Tiempo. Residuo tratado con
SDS y sin SDS. ____________________________________________________27
Figura 2. Fermentacin del residuo vegetal con el consorcio celuloltico.________30
Figura 3. Fermentacin del consorcio celuloltico en residuo vegetal fresco al 10%,
tratado con SDS y suplementado. Azcares reductores liberados y actividad
enzimatica pH 7 a 37C Y pH 5 a 50C en funcin del Tiempo. _______________31
Figura 4. Azcares reductores liberados y pH en funcin del Tiempo. Fermentacin
del consorcio celuloltico en residuo vegetal fresco al 10% (p/v) sin tratamiento,
con y sin suplemento.________________________________________________32
Figura 5. Actividad enzimtica pH 7 a 37C en funcin del Tiempo. Fermentacin
del consorcio celuloltico en residuo vegetal fresco al 10% (p/v) sin tratamiento, con
y sin suplemento. ___________________________________________________34
y sin suplemento. ___________________________________________________34
y sin suplemento. ___________________________________________________35
y sin suplemento. ___________________________________________________36
Figura 9. Actividad enzimtica pH 5 a 50C vs. Tiempo. Fermentacin del
consorcio celuloltico en residuo vegetal fresco al 12% (p/v) sin tratamiento, con y
sin suplemento. ____________________________________________________36
Figura 10. Fermentacin del consorcio celuloltico en residuo vegetal fresco al 5%
(p/v), tratado con SDS y suplementado. Azcares reductores liberados y actividad
enzimtica pH 7 a 37C en funcin del Tiempo. ___________________________37

IX
Figura 11. Concentracin de biomasa, azcares reductores y pH en funcin del
tiempo. Fermentacin control Saccharomyces cerevisiae en caldo YGC con 20 g/L
de glucosa. ________________________________________________________40
tiempo. Fermentacin control Saccharomyces cerevisiae en caldo YGC con 2 g/L de
glucosa. __________________________________________________________43
Figura 13. Fermentacin del sustrato fermentable con clulas libres de
Saccharomyces cerevisiae____________________________________________44
Figura 14. Concentracin de biomasa y azcares reductores en funcin del tiempo.
Fermentacin con Saccharomyces cerevisiae en caldo SF. __________________46

X
INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Fermentacin con el consorcio celuloltico en residuo vegetal al 10% sin
suplemento tratado con SDS y perxido de hidrgeno. (Temperatura 50C por 12
horas). ___________________________________________________________28
Tabla 2. Determinacin de etanol por HPLC fermentaciones control ___________41
Tabla 3. Determinacin de etanol fermentacin en SF ______________________47

XI
NDICE DE ANEXOS

ANEXO A Soluciones de trabajo
A.1 Buffer fosfato
A.2 Buffer cido ctrico
ANEXO B Curva patrn de cido 3,5-dinitrosaliclico DNS
Tabla 1. Curva patrn de glucosa.
Figura 1. Curva patrn de glucosa y ecuacin lineal.
ANEXO C Pretratamiento del residuo vegetal
Tabla 1. Fermentacin con el consorcio celuloltico en
residuo vegetal 10% con y sin tratamiento en SDS
ANEXO D Caracterizacin fsico-qumica del Residuo Vegetal de
Crisantemo Fermentacin discontinua del residuo vegetal
con el consorcio celuloltico
ANEXO E TABLA 1. Fermentacin con el consorcio celuloltico en
residuo vegetal 10% suplementado y tratado con SDS
TABLA 2. Fermentacin con el consorcio celuloltico en
residuo vegetal 10% suplementado y sin tratamiento
residuo vegetal 10% sin suplemento y sin tratamiento
residuo vegetal 12% suplementado y sin tratamiento
residuo vegetal 12% sin suplemento y sin tratamiento
residuo vegetal 5% (p/v), 10% (p/v) y 12% (p/v)
suplementado y sin tratamiento

ANEXO F Curva peso seco de Saccharomyces cerevisiae
Figura 1. Curva peso seco de Saccharomyces cerevisiae.
Absorbancia en funcin de la concentracin de biomasa

XII

ANEXO G. Evaluacin del sustrato fermentable con Saccharomyces
cerevisiae. Fermentacin discontinua control
TABLA 1. Fermentacin control con Saccharomyces
cerevisiae en caldo YGC 20 g/L de glucosa
TABLA 2. Fermentacin control con Saccharomyces
cerevisiae en caldo YGC 2 g/L de glucosa

ANEXO H. Fermentacin discontinua del sustrato fermentable con
Saccharomyces cerevisiae

TABLA 1. Fermentacin con Saccharomyces cerevisiae en
caldo SF

ANEXO I. Caracterizacin de composicin nutricional del sustrato
fermentable (SF)

ANEXO J. Cromatografa lquida HPLC
J1. Fermentacin control con S. cerevisiae en caldo YGC
con 20 g/L de glucosa
J2. Fermentacin control con S. cerevisiae en caldo YGC
con 2 g/L de glucosa
J3. Fermentacin con S. cerevisiae en SF
RESUMEN

La acumulacin de residuos slidos principalmente generados por el desarrollo de la
floricultura, ofrece una amenaza al ambiente y una oportunidad biotecnolgica al
aprovechar los tres componentes que conforman los residuos vegetales: celulosa,
hemicelulosa y lignina, como fuente de carbono para los microorganismos que
poseen el complejo enzimtico para metabolizar estos polmeros y liberar azcares
simples que puden quedar a disposicin de otros microorganismos fermentativos.

En este trabajo se plantea una alternativa de manejo de residuos vegetales de
Crisantemo (Dendranthema grandiflora), al realizar la conversin de este material
celulsico a azcares fermentables por pretratamiento biolgico con un consorcio
celuloltico en cultivo discontinuo, y de esta manera obtener un sustrato fermentable
(SF) rico en nutrientes y azcares reductores que permitan el crecimiento de
Saccharomyces cerevisiae y la produccin de etanol.

Se evaluaron varias variables para obtener el mejor sustrato fermentable con el
consorcio celuloltico: la concentracin del residuo vegetal al 5% (p/v), 10% (p/v) y
12% (p/v), pretratamientos qumicos y suplemento con extracto de levadura y
peptona. Se determin que la actividad enzimtica fue mejor en la fermentacin con
el residuo al 10% sin tratamiento y sin suplemento al obtenerse un SF con 2.5 g/L
de azcares reductores.

El sustrato fermentable obtenido demostr ser un medio nutritivo y econmico que
favorece la produccin de biomasa de Saccharomyces cerevisiae, presentando el
mismo rendimiento (Y
x/s
) al compararlo con la fermentacin control de 2g/L de
glucosa en caldo YGC, pero se determin que no favorece la produccin de etanol
por la mnima concentracin de azcares presentes.
ABSTRACT

The accumulation of solid waste, mainly generated through the development of the
flower-growing, brings a treat to the environment and a biotechnological opportunity
taking advantage of the three components that constitute the vegetable waste:
cellulose, hemicellulose and lignin as a source of carbon to the microorganisms that
own the enzymatic complex in order to metabolize these polymers and release the
simple sugars that might be left available to the other fermentative microorganisms.

This work proposes a management alternative of the vegetable waste of
Chrysanthemum (Dendranthema grandiflora) that consists in the conversion of this
cellulosic substrate to fermentable sugars through the biological pretreatment with a
microbial consortium and thus obtains a fermentable substrate (SF) rich in nutrients
and reductor sugars that allow the growing of Saccharomyces cerevisiae and the
production of ethanol.

Many variables were examined to obtain the best fermentable substrate with the
microbial consortium: the concentration of the vegetable waste to 5% (w/v), 10%
(w/v) and 12% (w/v), chemical pretreatment and supplement with extract of yeast
and peptone. It was found a better enzimatic activity with the vegetable waste 10%
(w/v) without treatment and without supplement obtaining a fermentable substrate
with 2.5 g/L of reductor sugars.

The fermentable substrate proved to be a nutritious and economic environment that
favors the production of biomass of Saccharomyces cerevisiae showing the same
yield (Y
x/s
) that was obtained with the fermentation control of 2 g/L of glucose in
media YGC, but one determined that it does not favor the ethanol production by the
minimum concentration of sugar.
INTRODUCCIN

En los ltimos aos, se ha venido acentuando progresivamente el aumento de la
conciencia y preocupacin social por el ambiente y el desarrollo sostenible. Cerca
del 90% de residuos slidos convencionales generados por la floricultura
corresponde a desechos vegetales, esto hace que la acumulacin de residuos
orgnicos genere un desequilibrio en el ecosistema.

La actual administracin colombiana ha iniciado algunas acciones tendientes a
identificar y promover alternativas de produccin de biocombustibles como el etanol,
a partir de distintas fuentes, pues la actividad del sector agropecuario nacional es
generadora, actual o potencial de: jugo de caa de azcar, paja de cereales, maz,
papa, remolacha, melaza, yuca, residuos de la industria forestal y residuos
vegetales como los generados en los cultivos de flores, producto del manejo y ciclo
vital de las plantas que actualmente son aprovechados en compostaje y
reincorporados al proceso productivo como fuente de nutrientes y acondicionador de
suelos, adems pueden servir como fuente de carbono de los microorganismos en
el proceso de fermentacin de los azcares que los componen. Esto promete doble
beneficio para el ambiente: primero una alternativa de manejo de residuos vegetales
y agroindustriales y el aprovechamiento biotecnolgico de sus tres componentes:
celulosa, hemicelulosa y lignina, en la obtencin de biomasa y etanol u otros
combustibles.

Por tal razn, la obtencin de un sustrato fermentable a partir de la conversin del
residuo vegetal de Crisantemo (material celulsico), por pretratamiento biolgico con
microorganismos celulolticos representa una alternativa para la produccin de
etanol, al lograr obtener un sustrato rico en azcares fermentables u otros
nutrientes que permitan el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae en cultivo
discontinuo, contribuyendo con el desarrollo biotecnolgico a nivel industrial.

2
2. MARCO TERICO

2.1 Uso de residuos vegetales

El aumento de la produccin de etanol en el mundo ha estado ligado con el
desarrollo de nuevas tecnologas que permiten obtenerlo a partir de residuos de
madera, de desechos slidos y de todos los materiales que contengan celulosa y
hemicelulosa lo que permite revalorizar los desechos de varias industrias
convirtindolos en materia prima para la obtencin de etanol.

El inters por el uso de materiales lignocelulsicos como materia prima en procesos
de transformacin por microorganismos, es importante desde hace ya varias
dcadas. Entre las razones fundamentales para tal inters se encuentran: la materia
lignocelulsica es el subproducto agrcola de mayor abundancia y constituye la parte
estructural en el reino vegetal, por ello es una fuente de materia prima renovable.
Sus tres mayores constituyentes, celulosa, hemicelulosa y lignina, tienen
aplicaciones practicas apreciables, por ejemplo, la celulosa es el polmero en mayor
proporcin en los residuos vegetales provenientes de floricultura se utiliza para la
obtencin de etanol y biomasa, la hemicelulosa como fuente de etanol y/o biomasa
y la lignina como combustible y como fuente de adhesivos y de inmunoadyuvantes
(Romano, et al., 2005).

2.2 Cultivo de Crisantemo (Dendranthema grandiflora)

Colombia se ha convertido en el segundo exportador mundial (despus de Holanda)
de flores cortadas, con una participacin del 10% sobre el total de las exportaciones
mundiales. Ms de 50 tipos diferentes de flores, entre las cuales se destacan el
clavel, el pompon, la rosa y el crisantemo se cultivan principalmente en la sabana de
Bogot, el oriente antioqueo y el Valle del Cauca, siendo sus principales mercados
Estados Unidos (80%) y la Unin Europea (14%)
(http://www.unalmed.edu.co/~prensa/impro4.htm).

3
El Crisantemo (Dendranthema grandiflora) es un hibrido complejo perteneciente a la
familia Asteraceae y engloba flores de las ms antiguas cultivadas en Colombia.
Las hojas pueden ser lobuladas o dentadas, ligulosas o rugosas, de color variables
entre el verde claro y oscuro, recubiertas de un polvillo blanquecino que le da un
aspecto grisceo (Stace, 2003; Santana, 2002).

En cuanto a sus requerimientos nutricionales el Crisantemo es un cultivo exigente
en lo referido a las cantidades de nitrgeno, fsforo y potasio necesarias para la
obtencin de flores y plantas de ptima calidad. Cuando existen deficiencias,
aplicaciones moderadas no logran evitar los trastornos ocasionados, por lo cual,
luego de la siembra de los esquejes se recomienda utilizar fertilizantes con alto
contenido de nitrgeno, potasio y otros microelementos, manteniendo un pH entre
5.5 y 6,5 (Santana 2002).

2.3 Celulosa

La celulosa es un carbohidrato que constituye el 50% o ms del total de tomos de
carbono en las plantas. Casi la mitad de la madera es celulosa, y el algodn tiene al
menos 90% de celulosa. Las clulas vegetales estn rodeadas por paredes
celulares resistentes, formadas en su mayor parte de celulosa. Este carbohidrato es
el polmero ms abundante del mundo, constituye alrededor de 40% a 60% de las
paredes celulares vegetales en peso seco. Es un polmero de unidades de glucosa
unidas entre s por enlaces - 1,4. Cada molcula de celulosa consta de miles de
subunidades de glucosa unidas para formar una cadena plana parecida a un listn.
De 40 a 70 de estas cadenas yacen paralelas entre s y estn conectadas por
enlaces de hidrgeno para formar una microfibrilla de celulosa con regiones
cristalinas y amorfas (no cristalinas), stas ltimas contienen torceduras y espacios
lo cual permite la formacin de microporos y capilares lo suficientemente espaciosos
para permitir la penetracin de molculas relativamente grandes incluyendo, en
algunos casos enzimas celulasas (Solomon, et al., 2001; Howard, et al., 2003; Lynd,
et al., 2002).

4
2.3.1. Celulasas

Las enzimas implicadas en la degradacin de la celulosa son conocidas como
celulasas dentro de las cuales se encuentran: la endo -1,4 glucanasa (- 1,4
glucanohidrolasa), la exo - 1,4 celobiohidrolasa y la - 1,4 glucosidasa.

La endo -1,4 glucanasa acta sobre la regin amorfa de la celulosa cortando al
azar la regin interna de las cadenas del polisacrido generando as oligosacaridos
de varias longitudes. La exo - 1,4 celobiohidrolasa acta sobre los extremos no
reductores del sustrato generando unidades de celobiosa; y la - 1,4 glucosidasa
completa el proceso hidroltico convirtiendo los fragmentos de la celobiosa a glucosa
o removiendo glucosa desde los extremos no reductores de pequeos celo-
oligosacaridos (Howard, et al., 2003).

2.3.2. Microorganismos celulolticos

Muchos microorganismos no tienen la maquinara enzimtica para hidrolizar los
enlaces beta de la celulosa (Solomon, et al., 2001), por esto, los residuos vegetales
son de difcil manejo y presentan un impacto ambiental; ya que pueden generar
alteraciones en las propiedades de los suelos, atraer plagas de insectos y roedores,
producir olores, prdida del espacio fsico y un impacto paisajstico; adems al ser
incinerados como una alternativa para su manejo se produce un impacto a la
atmsfera al generar gases txicos (Corbitt, 2003). Por lo tanto, se ha centrado el
inters en los microorganismos celulolticos que participan en la descomposicin de
este polmero a glucosa, permitiendo que los microorganismos fermentativos utilicen
este azcar para la produccin de etanol; adems a nivel industrial se realiza un
pretratamiento al material celuloltico utilizando procedimientos como la hidrlisis
cida, la sacarificacin y la licuefaccin; debido a que los materiales lignocelulosicos
son, en general, de muy baja susceptibilidad a los ataques enzimticos y
microbianos, lo que se debe a factores derivados de su composicin y de su
estructura fsico-qumica: estrecha relacin existente entre celulosa, hemicelulosa y
lignina, las que forman una estructura que no es accesible a las enzimas y a otros
agentes qumicos y la cristalinidad de la celulosa (Yu y Zhang, 2004; Romano, et

5
al., 2005).

Diversos grupos de microorganismos son capaces de degradar total o parcialmente
la celulosa, entre las bacterias que se destacan estn algunas especies de los
genros Clostridium, Streptomyces, Thermomonospora, Bacillus sp, Bacillus subtilis,
en el caso de los clostridios, Clostridium cellulovorans hidroliza la celulosa en
condiciones de anaerobiosis, en tanto que especies celulolticas de Streptomyces la
degradan en ambiente aerbico (Ramrez y Coha 2003; Murashima, et al., 2002).

2.4 Pretratamientos de residuos vegetales

El propsito de los pretratamientos es aumentar la susceptibilidad del material, para
lo que es necesario remover la lignina y la hemicelulosa, reducir la cristalinidad de la
celulosa, e incrementar la porosidad de los materiales. La tecnologa ideal del
pretratamiento debe cumplir los siguientes requerimientos:

Aumentar la concentracin de azcares
Minimizar la degradacin o prdida de carbohidratos
Impedir la formacin de coproductos colaterales inhibitorios para los procesos de
hidrlisis y fermentacin subsecuentes.
Escasa o nula la formacin de residuos
Ser econmico

Con la aplicacin de los pretratamientos se consigue adems:
Remover total o parcialmente la lignina y la hemicelulosa
Disminuir la cristalinidad de la celulosa
Reducir el tamao de las partculas del material.

Los mtodos de pretratamiento se clasifican en:
Fsicos: Reduccin de tamao de partcula, radiacin de alta energa, pirolisis,
etc.
Fsico qumicos: explosin a vapor o con amonio, oxidacin hmeda, etc.

6
Qumicos: Ozonlisis, hidrlisis cida o alcalina, delignificacin oxidativa, etc.
Biolgicos: Hidrlisis enzimtica por bacterias y hongos de pudricin blanca,
marrn y blanda (Romano, et al., 2005).

2.5 Obtencin de etanol

El etanol es el producto metablico que puede ser obtenido por la hidrlisis de
diferentes sustratos ricos en carbohidratos como: caa de azcar, maz, arroz y
remolacha (Zaldivar, et al., 2005; Karimi, et al., 2006).

Tericamente se puede obtener a partir de 1 gramo de glucosa 0,511 g de etanol.
Cuando se fermentan sustratos puros el rendimiento es del 95% y se reduce al 91%
cuando se utilizan materias primas grado industrial. 100 gramos de glucosa pura
producirn 48,4 gramos de etanol, 46,6 gramos de CO
2,
3,3 gramos de glicerol y
1,2 gramos de biomasa (clulas de levadura). Las levaduras usualmente
demuestran un rendimiento de etanol de 0.42g/g bajo condiciones ideales a partir de
Xilosa (Karimi, et al, 2006).

La produccin de etanol se puede realizar por diferentes tipos de fermentaciones
como: batch o discontinua, continua y lote alimentado. La fermentacin batch opera
en un sistema cerrado, toda la materia (sustrato, cultivo de la levadura) se aade al
fermentador al principio del proceso; el sistema se cierra y los productos se recogen
nicamente cuando el proceso ha finalizado. Esta fermentacin es la ms utilizada
en la produccin industrial, debido a las ventajas como: menor costo de produccin,
y requiere menor control en comparacin con los otros procesos (Doran, 1995;
Caylak y Vardar, 1998)

En la fermentacin continua, el crecimiento del microorganismo es mantenido a una
tasa estable de crecimiento mediante el bombeo continuo de medio fresco y la
eliminacin del medio utilizado; de tal forma que, el volumen del sustrato se
mantiene constante durante el tiempo de fermentacin. Por esto, si las velocidades
de entrada y de salida de materia son iguales, el proceso puede operar
indefinidamente (Doran, 1995; Caylak y Vardar, 1998).

7

La fermentacin lote alimentado consiste en un proceso de alimentacin intermitente
ya que permite la entrada de materia (sustrato e inculo) al sistema, pero no la
salida (Doran, 1995).

Estos diferentes procesos deben ser monitoreados de acuerdo con el conocimiento
que se tenga sobre las variables fsicas, qumicas y biolgicas que afectan al
proceso; de acuerdo a esto es posible determinar parmetros como la concentracin
de biomasa, de producto y de sustrato. Para calcular el rendimiento de la reaccin,
es decir la cantidad de producto formado o acumulado por cantidad de reactante
suministrado o consumido durante la fermentacin.

El rendimiento (Y
x
/
s
) expresa la cantidad de biomasa producida a partir del sustrato
consumido. Este rendimiento se ve afectado por factores como la composicin del
medio, la naturaleza de las fuentes de carbono y nitrgeno, el pH, la temperatura, y
la concentracin de oxgeno. Adems, el rendimiento del producto a partir del
sustrato (Y
p
/
s
), es el factor ms importante en la produccin de etanol; ya que afecta
a la economa del proceso (Doran, 1995).

2.6 Microorganismos fermentativos

El principal microorganismo utilizado en la fermentacin es Saccharomyces
cerevisiae, que aunque es efectivo en la produccin de etanol est limitado en
cuanto a los sustratos que puede utilizar, al igual que otros microorganismos como:
Mucor indicus, Candida shehatae, Pichia stipitis, Zymomonas mobilis, Trichoderma
sp, algunos microorganismos como Escherichia coli y Klebsiella oxytoca han sido
modificados por ingeniera gentica para la produccin eficiente de etanol a partir de
hexosas y pentosas presentes en los polmeros de hemicelulosa (Zaldivar, et al.,
2005; Becker y Boles, 2003).

2.7 Saccharomyces cerevisiae

Reino: Fungi Mycetae

8
Divisin: Amastigomycota Eumycota
Subdivisin: Ascomycotina
Clase: Asmomycetes Hemiascomycete
Subclase: Hemiascomycetidae
Orden: Endomycetales - Saccharomycetales
Familia: Saccharomycetaceae - Endomycetaceae
Subfamilia: Saccharomycetoidea
Gnero: Saccharomyces
Especie: cerevisiae.

Saccharomyces cerevisiae es la especie de levaduras utilizada por excelencia para
la obtencin de etanol a nivel industrial debido a que es un microorganismo de fcil
manipulacin y recuperacin, no es exigente en cuanto a su cultivo, no presenta alto
costo, tolera altas concentraciones de etanol, en la fermentacin produce bajos
niveles de subproductos, es osmotolerante, capaz de utilizar altas concentraciones
de azcares, presenta alta viabilidad celular para el reciclado y caractersticas de
floculacin y sedimentacin para el procesamiento posterior (Carballo, 2000).

El etanol es el producto del metabolismo anaerbico de esta levadura y es parte de
su metabolismo energtico (Carballo, 2000). En los procesos de fermentacin los
valores de pH deben ser controlados entre 4 y 5 para reducir el riesgo de
contaminacin bacteriana, adems para la produccin de etanol la temperatura
puede estar en el rango de 30C 39C, sin embargo, cerca de 39C se presenta
perdida de viabilidad de las clulas; ya que la temperatura ptima de crecimiento de
Saccharomyces cerevisiae es entre 28C y 35C. Tericamente la temperatura
ptima para la produccin de etanol debe ser de 5C a 10C ms elevada que la
temperatura de crecimiento, esto para incrementar el rendimiento del proceso de
fermentacin (Tuite y Oliver, 1991).

2.7.1 Requerimientos nutricionales

Carbono:
Los compuestos carbonados son utilizados a la vez como fuente de energa y como

9
fuente de carbono por Saccharomyces cerevisiae ya que necesita D-azcares como
hexosas, glucosa, fructosa, manosa, etc., porque los L-azcares pueden ser
considerados no fermentables por esta levadura (Tuite y Oliver, 1991).

Nitrgeno:
Este elemento es un constituyente importante en los medios de cultivo para
promover el crecimiento; ya que representa alrededor del 10% de peso seco de las
levaduras, S. cerevisiae es capaz de utilizar el nitrgeno en forma de in amonio.
Los iones amonio pueden ser aportados en el medio por el cloruro de amonio, el
nitrato de amonio, fosfato de amonio y sobretodo el sulfato de amonio que provee
adems una fuente de azufre asimilable ((NH
4
)
2
SO
4
). Otra fuente de nitrgeno son
los aminocidos, los dipptidos, tripptidos, y la urea en asociacin con biotina y las
bases pricas y pirimdicas (Carballo, 2000).

Fsforo:
Es esencial para el crecimiento, regula la sntesis de los lpidos y los carbohidratos,
y mantiene la integridad de la pared celular. El fsforo es asimilado por la clula en
forma de iones ortofosfato (H
2
PO
-
4
). Las fuentes de fsforo en el medio de cultivo
estn constituidas por el dihidrogenofosfato (KH
2
PO
4
) o por el hidrogenofosfato
disdico (Na
2
HPO
4
) en una concentracin 0.6 mM/g de clulas para una
fermentacin ptima (Carballo, 2000).

Azufre:
Constituye el 0.4% del peso seco de las levaduras. La fuente de azufre ms
utilizada por Saccharomyces es el sulfato de amonio, el sulfito y el tiosulfato; la
metionina puede ser utilizada como fuente nica de azufre y permite un crecimiento
ms rpido que los iones sulfatos (Carballo, 2000).

Elementos traza:
Macronutrientes. K, Mg, Ca, Zn, Fe, Mn, Cl. Se requiere en concentraciones de 0.1
1 mM.

10
Potasio:
A pH cidos estimula la fermentacin y la respiracin, acta como efector de
numerosas enzimas: piruvato quinasas, aldolasa, aldehdo deshidrogenasa y
permeasa e interviene en la estructura de los ARN. Las fuentes de potasio son el
cloruro potsico y los fosfatos mono y dipotsico (Carballo, 2000).

Magnesio:
Es utilizado como activador de las enzimas glicolticas, estimula la sntesis de cidos
grasos, regulas las ATPasas de las membranas y participa con el potasio en la
penetracin del fosfato. El magnesio es aportado en los medio de cultivo en forma
de sulfato o de cloruro de magnesio (Carballo, 2000).

Microelementos: Co, B, Cd, Cr, Cu, I, Mo; Ni, Va. Se requieren concentraciones
0.1 - 100M.
Los inhibidores, los cuales pueden afectar el crecimiento de la levadura cuando se
encuentran en concentraciones superiores a 100M: Hg, Ag, Ar, Ba, Li, Ni, Os, Pb,
Se, Te (Tuite y Oliver, 1991).

Otros compuestos:
El inositol juega un papel importante en la sntesis de los lpidos de las membranas.
El pantotenato es un factor de crecimiento para Saccharomyces y debe presentarse
en el medio en forma de pantotenato de calcio a una concentracin de alrededor de
6.25mg/l.

La vitamina B6 o piridoxina es transformada en fosfato de piridoxal y en
piridoxamina, coenzimas implicadas en la desaminacin y descarboxilacin de los
aminocidos.

La tiamina (vitamina B1) tiene un papel en el metabolismo respiratorio, el
metabolismo de los lpidos, la gluclisis y la fermentacin alcohlica. Las
necesidades para S. cerevisiae son alrededor de 5 mg/l en tiamina-HCl.

11
La biotina es un factor de crecimiento para las levaduras. Est implicada en
numerosas reacciones anablicas: carboxilacin del piruvato, sntesis de las bases
pricas y pirimdicas, de los nucletidos y de los cidos nucleicos, sntesis de las
protenas, de los polisacridos y de los cidos grasos.

Las necesidades de biotina son del orden de 1mg/l para S. cerevisiae. Las otras
vitaminas, cido flico, cido p-amino benzoico y riboflavina son normalmente
sintetizadas por las levaduras (Carballo, 2000).

2.7.2 Metabolismo de Saccharomyces cerevisiae

Es un microorganismo que puede llevar a cabo un metabolismo respiratorio o
fermentativo de acuerdo con concentracin de oxgeno (Noor, et al., 2003). En
condiciones aerobias aumenta la biomasa y produce poco alcohol, pero en
anaerobiosis el crecimiento celular es lento y la produccin de etanol es alta. Por
esta razn, la oxidacin completa de la fuente de carbono a CO
2
y H
2
O presenta
una produccin celular ptima, donde el oxgeno es el aceptor final de electrones en
la fosforilacin oxidativa durante la respiracin. Es as, que en concentraciones altas
de oxgeno disuelto la fermentacin de azcar a etanol es inhibida. Esta situacin
fue observada por Pasteur en 1967, y se denomina el efecto Pasteur (Fiechter, et
al., 1981).

Saccharomyces cerevisiae convierte la glucosa a etanol a travs de la ruta de la
gliclisis. Esta es una va ubicua para el catabolismo de los monosacridos. Por
cada molcula de hexosa que se convierte a piruvato, hay una produccin neta de
dos molculas de ATP a partir de ADP + Pi y dos molculas de NAD
+
se reducen a
NADH. La gliclisis se puede dividir en dos etapas: una de hexosas, en la cual el
ATP es consumido, y una etapa de triosas, en la cual se obtiene una ganancia neta
de ATP (Nelson y Cox. 2000).

En la fermentacin alcohlica la produccin de etanol se presenta en dos pasos: el
piruvato es descarboxilado por la piruvato descarboxilasa hasta acetaldehdo; este
ltimo es reducido a etanol por la alcohol deshidrogenada, con liberacin de NAD
+

12
proveniente de la etapa de la gliclisis, que haba oxidado el 3-fosfogliceraldehido a
cido 3- fosfoglicerico. El etanol y CO
2
son productos finales de la fermentacin
alcohlica y su ecuacin general es la siguiente:

Glucosa + 2 ADP + 2 Pi 2 Etanol + 2 CO
2
+ 2 ATP + 2 H
2
O

La conversin de glucosa en etanol y CO
2
produce 2 moles de ATP por mol de
glucosa transformada (Nelson y Cox. 2000).

2.7.2. Tolerancia al etanol

No todas las levaduras presentan la misma sensibilidad al etanol. Las ms
resistentes son las especies de Saccharomyces sp. que se presentan en los
procesos de fermentacin alcohlica para la elaboracin de bebidas o la produccin
industrial de etanol. Segn las cepas y el estado fisiolgico del cultivo, el etanol es
txico en concentraciones del 8% (p/v) al 18% (p/v). La tolerancia al etanol depende
de la composicin en cidos grasos de las membranas citoplasmticas. Las clulas
cultivadas en presencia de cido linoleico (C18:2) toleran mejor el etanol aadido al
medio que las clulas en presencia de cido oleico (18:1). La viabilidad es mejor en
presencia de ergosterol que de camposterol (Carballo, 2000).

El etanol intracelular es ms txico para las clulas que el etanol extracelular. La
viabilidad de los cultivos puede incrementar por la eficiencia de la excrecin del
etanol, debido a esto, hay una influencia de la presin osmtica: cuando la presin
osmtica aumenta en el medio, la secrecin del etanol se disminuye
considerablemente. En un medio que contiene 30% (p/v) de sorbitol y 10% (p/v) de
sacarosa, no hay prcticamente ninguna secrecin del etanol durante 24 horas
mientras que en un medio con presin osmtica baja, el etanol difunde rpidamente.
Las medidas de etanol intracelular permiten situar el lumbral de toxicidad hacia 0.25
mg de etanol intracelular para 10
6
clulas viables. Es as que, la presin osmtica
elevada de los medios representa un problema importante en la fermentacin
alcohlica, que debe ser tenido en cuenta en el procedimiento (Carballo, 2000).

13
Por otra parte, para hacer frente a estas situaciones desfavorables, S. cerevisiae
responde rpidamente sintetizando molculas que le permiten actuar o reparar el
dao causado por el estrs. Entre las molculas mejor caracterizadas en la
respuesta estn las llamadas protenas de estrs. Su estudio ha evidenciado que
la respuesta a nivel transcripcional es importante para la supervivencia celular y ha
llevado a la descripcin de varias vas de transduccin de seales y factores de
transcripcin involucrados en esta respuesta (Folch, et al, 2004). Segn estudios el
etanol inhibe el crecimiento de los microorganismos y causa daos en el ADN
mitocondrial de las clulas de las levaduras y la inactivacin de algunas enzimas
como la hexoquinasa y la dehidrogenasa. Adems, se ha encontrado que cuando S.
cerevisiae crece en presencia de etanol se incrementa la cantidad de cidos grasos
insaturados en la membrana como una alternativa ante el estrs generado por la
toxicidad del etanol (Martini, et al., 2005; Man, et al., 2003).

2.8. Determinacin de azcares reductores

Una de las tcnicas usadas para la deteccin de azcares reductores es la
denominada DNS o cido 3,5 dinitrosaliclico; esta es una tcnica de oxido-
reduccin en la que el cido 3,5 dinitrosaliclico es reducido mientras que el grupo
aldehdo del monosacrido es oxidado. La reduccin del reactivo genera una
coloracin amarilla la cual es proporcional a la concentracin de azcares
reductores presentes, esto se evidencia por medio de la lectura de absorbancias en
el espectrofotmetro lo que implica la aplicacin de la ley de Beer Lambert (Miller,
1959).

14
3. JUSTIFICACIN

Actualmente la acumulacin de residuos slidos principalmente de origen vegetal
han generado impactos ambientales por el creciente desarrollo especialmente en el
sector agroindustrial como la floricultura; ya que producen alteraciones en el paisaje,
olores, plagas de insectos y roedores, generan gases txicos al ser incinerados
como una alternativa de manejo, producen eutrofizacin de aguas si estos o sus
lixiviados son dispuestos en cuerpos de agua y potencializan riesgos de
magnificacin de plaguicidas en la cadena trfica si estos se dan como alimento a
animales de granja (Corbitt, 2003). Aproximadamente, el 90% de los residuos
slidos generados en floricultura corresponden a residuos vegetales, los cuales
ofrecen tanto una amenaza al ambiente como una alternativa de uso biotecnolgico
segn el manejo y disposicin que se les d. Actualmente, la oportunidad consiste
en aprovecharlos en compostaje y reincorporarlos al proceso productivo como
fuente de nutrientes (Asocolflores, 2000).

Adems, junto al manejo de los residuos vegetales se est presentando el impacto
ambiental por la emisin de gases de efecto invernadero en la utilizacin de
combustibles fsiles, pues actualmente es uno de los problemas que esta afectando
a todo el mundo, por la incidencia en el cambio climtico y la contaminacin
atmosfrica; por esta razn, muchos pases como Brasil y Estados Unidos, estn
adoptando como alternativa a esta problemtica, el uso del alcohol combustible
Bioetanol, para reducir las emisiones nocivas ambientales (Zaldivar, et al., 2001).
Por tal motivo el aprovechamiento biotecnolgico de estos residuos vegetales como
sustratos de origen natural en la produccin de biomasa y bioetanol, proporcionan
ventajas en la reduccin tanto en el costo de la materia prima, como en el volumen
de residuos generados y en las emisiones de gases de efecto invernadero mitigando
esta serie de impactos ambientales.

La utilizacin de microorganismos representa una opcin viable para la produccin
de etanol, adems, del manejo de residuos vegetales que pueden servir como
fuente de carbono para la produccin del mismo, favoreciendo al medio ambiente.
Por esto, en el presente trabajo se plantea una alternativa biotecnolgica para la

15
obtencin de un sustrato fermentable a partir de la conversin del material vegetal
por pretratamiento biolgico con microorganismos celulolticos y su evaluacin con
clulas libres de Saccharomyces cerevisiae en produccin de biomasa y de etanol,
usando un sustrato econmico y de origen natural, que puede llegar a proporcionar
los nutrientes necesarios para el desarrollo del microorganismo.

16
4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo general

Obtener un sustrato fermentable a partir de residuos vegetales de Crisantemo
(Dendranthema grandiflora) y evaluarlo con clulas libres de Saccharomyces
cerevisiae.

4.2. Objetivos especficos

Obtener un extracto crudo que pueda ser utilizado como sustrato fermentable.

Evaluar el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae en el sustrato de origen
vegetal

Comparar rendimientos Yx/s y Yp/s obtenidos a partir del sustrato
fermentable de origen vegetal con los obtenidos a partir de medio de cultivo
YGC.

Cuantificar el etanol como producto final de la fermentacin del sustrato de
origen vegetal.

17
5. MATERIALES Y MTODOS

Todos los procesos experimentales planteados en este proyecto fueron realizados
por triplicado.
Durante todos los procedimientos se llev a cabo la prueba de pureza para asegurar
cultivos axnicos.

5.1. Ubicacin

Este proyecto de investigacin, se desarroll en las instalaciones del laboratorio de
Biotecnologa Aplicada de la Pontificia Universidad Javeriana.

5.2. Obtencin del sustrato fermentable

5.2.1. Microorganismos

Se utiliz un consorcio microbiano celuloltico (Bacillus sp. y Streptomyces sp) de
origen vegetal y suelo, para el pretratamiento del residuo vegetal (Gaitn y Prez
2006)

5.2.2. Residuo Vegetal

Se utilizaron residuos de Crisantemo (Dendranthema grandiflora) provenientes de
un cultivo localizado al norte del municipio de Tocancip. Estos fueron sometidos a
una caracterizacin fsico-qumica en un laboratorio certificado por el FCA. A los
residuos vegetales se les realiz pretratamiento tanto qumico, como biolgico para
obtener el extracto crudo o sustrato fermentable (SF), ste fue la fuente de carbono
(azcar fermentable: glucosa) para ser utilizado como sustrato fermentable en la
produccin de etanol con clulas libres de Saccharomyces cerevisiae.

18
5.2.3. Pretratamiento del residuo vegetal

El objetivo de estos procedimientos fue aumentar la susceptibilidad del residuo
vegetal, al reducir la cristalinidad de la celulosa, e incrementar la porosidad y de
esta manera obtener un extracto crudo con mayor concentracin de glucosa; por lo
tanto, se seleccion el mejor pretratamiento por anlisis de medias (Daniel, 2002;
Romano, et al., 2005).

5.2.3.1. Lavado con SDS ( Sodio Dodecil Sulfato)

Los residuos vegetales de Crisantemo se lavaron con SDS (Sodio Dodecil Sulfato)
al 1% (p/v) y se redujo de tamao realizando molienda, para posteriormente ser
sometidos a ebullicin por un periodo de una hora con SDS al 1% (p/v). Luego se
realiz un secado a 55C y por ltimo, se someti a un proceso de esterilizacin
(Guevara y Zambrano, 2006).

5.2.3.2. Pretratamiento qumico con perxido de hidrgeno (delignificacin
oxidativa)

En una solucin alcalina de perxido de hidrgeno al 2% se suspendi el residuo
vegetal molido y pretratado con SDS en una relacin 10:1 respectivamente, esta
mezcla fue llevada a un bao termostatado durante 12 horas a 50C. Luego se filtr
y lav con agua destilada. Por ltimo se someti a un proceso de secado en horno
de conveccin a 90C por 12 horas (Sun, et al., 2000).

El residuo vegetal fue sometido a diferentes pretratamientos todos con reduccin de
tamao:
Lavado con SDS.
Lavado con SDS y tratado con perxido de hidrgeno.
Sin lavado con SDS y sin tratamiento con perxido de hidrgeno (Control).
Sin lavado con SDS y con tratamiento con perxido de hidrgeno.
Todos los anteriores se sometieron a temperatura de 50C por 12 horas,
condiciones del pretratamiento con perxido de hidrgeno.

19
5.2.4. Pretratamiento biolgico

5.2.4.1. Fermentacin discontinua del residuo vegetal por parte del
consorcio celuloltico

Se llevaron a cabo tres fermentaciones con concentraciones de 5% (p/v), 10% (p/v)
y 12% (p/v) de residuo vegetal por triplicado; para evaluar en cual se obtena la
mayor concentracin de azcares reductores.

5.2.4.1.1. Preparacin del inculo

Las cepas de los microorganismos celulolticos fueron cultivadas en agar celulosa al
1% (p/v), cuya composicin en g/L es: carboximetilcelulosa 10, extracto de levadura
2.5, peptona universal 2.5, sulfato de amonio 0.5, cloruro de calcio 0.5, fosfato
monobsico de potasio 0.1, fosfato dibsico de potasio 0.1, agar 15, pH final 7.0 +/-
0.2, bajo condiciones controladas de 35C por 48 horas. Posteriormente, se realiz
un raspado de las colonias para preparar una suspensin en solucin salina
0.85%(p/v), a una concentracin de 10
8
clulas/ml, la cual fue obtenida para el
inculo de bacterias igualando al tubo 5 de McFarland. En el caso del inculo del
actinomiceto se realiz el recuento en cmara de Neubauer para obtener la misma
concentracin en el consorcio.

En un erlenmeyer de 500mL con 90mL de caldo celulosa, fueron adicionados los
10ml de preinculo y se cultivaron a 130 rpm, 35C por 24 horas.

5.2.4.1.2. Fermentacin discontinua

Se adicionaron 900mL de caldo residuo vegetal estril a la concentracin
correspondiente (5%(p/v), 10%(p/v) 12%(p/v)) cuya composicin en g/L es:
residuo vegetal a las diferentes concentracines, extracto de levadura 2.5, peptona
universal 2.5, sulfato de amonio 0.5, cloruro de calcio 0.5, fosfato monobsico de
potasio 0.1, fosfato dibsico de potasio 0.1, (Caldo SVS) a un erlenmeyer de 2 litros;
posteriormente se agreg el 10% de inculo (100mL), y se controlaron las

20
condiciones de operacin: temperatura 35C por 24 horas y agitacin de 130 rpm.
Adicionalmente, como control se realiz una fermentacin con la concentracin de
residuo vegetal 10% (p/v) y 12% (p/v) sin la adicin de los dems componentes
(sales, peptona y extracto de levadura) (Caldo SV), esto para verificar si el residuo
proporcionaba todas las fuentes nutricionales para el desarrollo de los
microorganismos celulolticos.

Se realizaron muestreos cada 2 horas hasta completar 24 horas. Para cada
muestreo, se tomaron 6 mL distribuidos as: 1mL para evaluar la produccin de
azcares reductores mediante la tcnica de DNS (Miller, 1959), 2mL para
determinacin de pH, 3mL para determinacin de actividad enzimtica.

Al finalizar el proceso de fermentacin se obtuvo el extracto crudo o sustrato
fermentable (SF), mediante un proceso de centrifugacin y filtracin, con el fin de
eliminar la poblacin celular.

Se seleccion la concentracin de residuo vegetal que arroj mayor cantidad de
azcares; ste sustrato fermentable obtenido, fue sometido a la tcnica de
cromatografa lquida HPLC para evaluar la concentracin de glucosa, sacarosa y
celulosa disponible.

5.2.5. Determinacin de actividad celuloltica cuantitativa

Esta se realiz evaluando dos condiciones de pH (5 y 7) y temperatura diferentes
(37 y 50C) reportadas por literatura. Para la interpretacin de los resultados, una
unidad celuloltica equivale a la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar una
micromol de glucosa por minuto, bajo las condiciones de ensayo (Guevara y
Zambrano, 2006).

5.2.5.1. Actividad celuloltica a pH 7

Se tom un volumen de 1mL de sobrenadante correspondiente a cada hora de
muestreo y se adicion 1mL de solucin de carboximetilcelulosa 1% (p/v) disuelta

21
en buffer fosfato 0.1M pH 7 +/- 0.2 (Anexo A1). La mezcla final se incub en bao
termostatado a 37C durante 1 hora, finalizado este tiempo se fren la reaccin
refrigerando a 4C durante 5 minutos. Posteriormente se centrifug la muestra por
10 minutos a 5000 rpm, a partir del sobrenadante se determin la concentracin de
azcares reductores por la tcnica de DNS (Miller, 1959; Guevara y Zambrano,
2006).

5.2.5.2. Actividad celuloltica a pH 5

Se tom un volumen de 1mL de sobrenadante correspondiente a cada hora de
muestreo y se adicion 1mL de solucin de carboximetilcelulosa 1% (p/v) disuelta
en buffer cido ctrico 0.1M pH 5 +/- 0.2 (Anexo A2). La mezcla final se incub en
bao termostatado a 50C durante 1 hora, finalizado este tiempo se fren la
reaccin refrigerando a 4C durante 5 minutos. Posteriormente se centrifug la
muestra por 10 minutos a 5000 rpm, a partir del sobrenadante se determin la
concentracin de azcares reductores por la tcnica de DNS (Miller, 1959; Sun y
Cheng, 2002; Palmarola, et al., 2005).

5.3. Evaluacin del Sustrato con Saccharomyces cerevisiae

Como microorganismo control para la produccin de etanol se utiliz la levadura
Saccharomyces cerevisiae (Muoz y Poutou, 1999). La cepa fue tomada del banco
de cepas del Laboratorio de Biotecnologa Aplicada de la Universidad Javeriana.

A partir de la concentraciones de residuo vegetal evaluadas se seleccion el
sustrato fermentable que aport mayor concentracin de azcares reductores para
la fermentacin con Saccharomyces cerevisiae.

5.3.1. Fermentacin discontinua control

Se realiz esta fermentacin con el objetivo de verificar la actividad metablica de la
cepa Saccharomyces cerevisiae en la produccin de etanol.

22
5.3.1.1. Preparacin del inculo

La cepa de Saccharomyces cerevisiae fue cultivada en agar YGC cuya composicin
es en g/L: extracto de levadura 5, D-glucosa 20, cloramfenicol 0.1 y agar-agar 14.9,
pH final 6.6 (Merck, 2000), bajo condiciones controladas de 30C por 12 horas.
Posteriormente se realiz un raspado de las colonias de la levadura para preparar
una suspensin en solucin salina 0.85%(p/v), con una absorbancia de 0.8 a
620nm.

En un erlenmeyer de 500mL con 135mL de caldo YGC, fueron adicionados los 15ml
de preinculo y se cultivaron a 120rpm, 30C por 12 horas.

5.3.1.2. Fermentacin discontinua

Se adicionaron 1350mL de caldo YGC estril a un erlenmeyer de 2 litros;
posteriormente se agreg el 10% de inculo (150ml), y se controlaron las
condiciones de operacin: temperatura 30C por 14 horas y agitacin de 70rpm
(Noor, et al., 2003).

Se tomaron 3 ml de medio estril para determinar la concentracin inicial de sustrato
y el pH. Luego de ser inoculado el erlenmeyer se retiraron 7 ml de muestra, que
correspondi a la hora cero (0) y, posteriormente se realizaron cada dos horas hasta
completar 14 horas; a estas muestras se les determin la concentracin de biomasa
por el mtodo de peso seco y de azcares reductores mediante la tcnica de DNS.

Adicionalmente, se evalu la produccin de etanol por cromatografa lquida HPLC.

5.3.2. Fermentacin discontinua con sustrato vegetal (SF)

5.3.2.1. Preparacin del inculo

La cepa de Saccharomyces cerevisiae fue cultivada en agar YGC, bajo condiciones

23
controladas de 30C por 12 horas. Posteriormente, se realiz un raspado de las
colonias de la levadura para preparar una suspensin en solucin salina 0.85%(p/v),
con una absorbancia de 0.8 a 620nm.

En un erlenmeyer de 500mL con 135mL de caldo YGC, fueron adicionados los 15ml
de preinculo y se cultivaron a 120rpm, 30C por 12 horas.

5.3.2.2. Fermentacin discontinua

Se adicionaron 1350mL de caldo SF a un erlenmeyer de 2 litros; posteriormente se
agreg el 10% de inculo (150ml), y se controlaron las condiciones de operacin:
temperatura 30C por 24 horas y agitacin de 70 rpm (Noor, et al., 2003).

Se tomaron 3 ml de medio estril para determinar la concentracin inicial de sustrato
y el pH. Luego de ser inoculado el erlenmeyer se retiraron 7 ml de muestra, que
correspondi a la hora cero (0) y, posteriormente se realizaron cada dos horas hasta
completar 32 horas; a estas muestras se les determin la concentracin de biomasa
por el mtodo de peso seco, de azcares reductores mediante la tcnica de DNS
(Miller, 1959) y de etanol por cromatografa lquida HPLC.

5.3.3. Determinacin de azcares reductores por la tcnica del cido 3,5
dinitrosaliclico (DNS)

Se tom un volumen de 0.25 ml a partir del extracto crudo obtenido en cada
muestreo durante la fermentacin, al cual se le adicion 0.25 ml de DNS, esta
mezcla fue sometida primero a ebullicin por 5 minutos, y luego a un recipiente con
hielo por 5 minutos para frenar la reaccin, y por ltimo se adicionaron 2.5 ml de
agua destilada, a la mezcla. Para determinar la absorbancia, esta solucin fue leda
en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 540nm y sensibilidad media. El
dato de absorbancia fue reemplazado en la ecuacin de la lnea recta determinada
por la curva patrn utilizando glucosa previamente realizada y se obtuvo la
concentracin de glucosa residual en g/L para cada muestreo (Miller, 1959).

24
5.3.4. Determinacin de biomasa por peso seco en funcin del tiempo

Este procedimiento permiti obtener la concentracin celular de Saccharomyces
cerevisiae al transformar los valores de absorbancia correspondientes a cada
tiempo de fermentacin en unidades de gramos de masa celular seca por litro (g/L).

Para realizar la curva patrn de peso seco, se prepar una suspensin concentrada
de la levadura, fue lavada dos veces con solucin salina 0.85% (p/v) por
centrifugacin a 2250 g por 20 minutos. El pellet se resuspendi al volumen inicial.
Posteriormente, fueron adicionados en 10 tubos previamente pesados 10 mL de la
solucin de clulas a cada uno, igualmente 10 mL de solucin salina en 10 tubos
que sirvieron como blanco. Estos fueron llevados al horno a 105C por 24 horas,
terminado el tiempo de evaporacin del lquido se pasaron al desecador para ser
pesados nuevamente y determinar el promedio del peso de los 10 tubos que
contenan las clulas y el de los 10 tubos con solucin salina, a partir de esto se
calcul la diferencia de peso entre los dos promedios para expresar la concentracin
en gramos de biomasa seca por litro de solucin (g/L). A partir de la solucin
concentrada de clulas se realizaron diluciones por triplicado para ajustar la
absorbancia entre 0.2 0.9 y calcular las concentraciones finales para cada
dilucin. Esto permiti hallar la ecuacin
b c m Abs + = *
al graficar la absorbancia
promedio en funcin de la concentracin celular (g/L).

Se tomaron 5 ml de cada muestra de fermentacin, se realizaron dos lavados con
solucin salina 0.85 % (p/v) por centrifugacin a 2250 g por 20 minutos. El pellet se
resuspendi al volumen inicial. Se agit en vortex y se ley la absorbancia a 620nm
para hallar la concentracin de biomasa a partir de la ecuacin de peso seco
(Godoy, 2002).

5.3.5. Determinacin de etanol

El contenido de etanol se analiz por cromatografa lquida de alto desempeo
HPLC, en un cromatgrafo WATERS, con detector de indice de refraccin (Waters

25
Corporation, Milford, MA). La fase mvil fue agua con un flujo de 0.5mL/min, y se
empleo una columna Sugar Pak I con precolumna KC-G (Waters Corporation,
Milford, MA). La temperatura de la columna fue 84C. Para el anlisis de los
resultados se uso el programa Millenium V 2.15.01.

Para la determinacin de los factores de respuesta se utilizaron glucosa grado
cromatogrfico (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), y etanol anhidro grado analtico
Merck (Darmastadt, Alemania).

5.3.6. Determinacin de rendimientos

A partir de los datos de biomasa obtenidos por peso seco, de sustrato por la tcnica
del DNS, y de producto por cromatografa lquida HPLC. Se determinaron los
rendimientos por las siguientes frmulas (Doran, 1995):

sustrato de consumo
formado producto
s
p
Y
. .
) etanol .( .
=

sustrato de Consumo
formada Biomasa
s
x
Y
. .
.
=

5.3.7. Anlisis estadstico

Para el anlisis estadstico de los datos obtenidos se realizaron curvas de biomasa,
consumo de sustrato y actividad enzimtica en funcin del tiempo, adems se utiliz
el programa SPSS versin 14 en el cual se determinaron las medias (nivel de
confianza 95%), la desviacin estndar, el coeficiente de variacin y la estadstica
de prueba de la distribucin t student para comparar la concentracin de azcares
liberados con el residuo vegetal al 10% (p/v) y 12%(p/v). Y comparar la

26
concentracin celular de S. cerevisiae tanto en el control de 2 g/L de glucosa y en el
SF (Daniel, 2002).

Hiptesis general:

La concentracin de azcares reductores liberados en la fermentacin con SV al
10%(p/v) no difiere de la concentracin de azcares reductores liberados en la
fermentacin con SV al 12%(p/v).

H
0
:
1
-
2
= 0
H
i
:
1
-
2
0

Hiptesis general:

La concentracin celular de Saccharomyces cerevisiae en el caldo sustrato
fermentable no difiere de la concentracin celular en el caldo YGC con 2 g/L de
glucosa (control).

H
0
:
1
-
2
= 0
H
i
:
1
-
2
0

27
6. RESULTADOS Y DISCUSION

6.1 Pretratamiento del residuo vegetal

El propsito de realizar pretratamiento a los residuos vegetales es aumentar la
susceptibilidad del material al remover la lignina y hemicelulosa, reducir la
cristalinidad de la celulosa, e incrementar la porosidad del residuo. Por tal razn, se
evaluaron diferentes pretratamientos para determinar cual permita obtener mayor
concentracin de azcares reductores, al facilitar la hidrlisis enzimtica de la
celulosa por parte del consorcio celuloltico. Para estos anlisis se seleccion la
concentracin de residuo vegetal al 10% (p/v) por ser la concentracin intermedia a
las propuestas.

Con el residuo vegetal molido tratado con y sin SDS; se realiz una fermentacin de
22 horas realizando muestreos en las horas 0 y 22, obteniendo como resultado que
la mayor cantidad de azcares reductores liberados por los microorganismos
celulolticos se present en el residuo vegetal sin tratamiento con SDS teniendo una
concentracin de 2.46 g/L comparado con 1.44g/L del tratado con SDS (Figura 1,
anexo C).

0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 22
TIEMPO (h)
CALDO SV 10% SIN SDS CALDO SV 10% CON SDS

Figura 1. Azcares reductores liberados en funcin del Tiempo. Residuo tratado con
SDS y sin SDS.

28
Al realizar los pretratamientos del residuo al 10% (p/v) con SDS, con perxido de
hidrgeno 2% y un control en agua a las mismas condiciones 50C por 12 horas,
se evalu la liberacin de azcares reductores por parte del consorcio celuloltico en
una fermentacin de 22 horas para cada tratamiento. El control se realiz con el
objetivo de evaluar el efecto de la temperatura. La concentracin de azcares
reductores con el residuo tratado con SDS y H
2
O
2
fue de 0.870 g/L, estos
resultados mostraron que no actu el complejo enzimtico por parte del consorcio
celuloltico; porque de la hora 0 a la 22 no hubo una diferencia en la concentracin
de azcares reductores; mientras que en el control se present la mayor
concentracin de azcares reductores 1.84g/L a las 12 horas teniendo relacin con
la mayor actividad enzimtica 52.1 UC/L, como se observa en la tabla 1.

Tabla 1. Fermentacin con el consorcio celuloltico en residuo vegetal al 10% sin
suplemento tratado con SDS y perxido de hidrgeno. (Temperatura 50C por 12
horas).

ND = No se determin
a
Una unidad celuloltica equivale a la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar una
micromol de glucosa por minuto, bajo las condiciones de ensayo.

Se observ que el tratamiento a 50C por 12 horas no tiene efecto en la liberacin
de azcares (Tabla 1); ya que los resultados obtenidos con el residuo vegetal sin
ningn tratamiento (sin SDS, sin H
2
O
2
y sin temperatura a 50C) son similares en la
hora 0 de fermentacin (1.35 g/L y 1.329 g/L) (Figura 1), adems en la hora 22 la
concentracin de azcares reductores fue mayor (2.461 g/L), que en el control de la
CALDO SV 10% (p/v) CON
SDS
H
2
O
2
Y SIN SDS
CALDO SV 10% (p/v)SIN
H
2
O
2
Y SIN SDS (control)
H
2
O
2
Y CON SDS
AZCARES
REDUC.
ACT. ENZ
pH 7 37C
AZCARES
REDUC.
ACT. ENZ
pH 7 37C
AZCARES
REDUC.
ACT. ENZ
pH 7 37C
AZCARES
REDUC.
ACT. ENZ
pH 7 37C
H
O
R
A

g/L
a
UC/L g/L UC/L g/L UC/L g/L UC/L
0 0,595 0,0 0,471 0,0 1,350 0,0 0,835 0
12 0,926 23,1 0,484 15,0 1,840 52,1 ND ND
22 0,749 23,9 0,555 17,4 1,502 40,0 0,871 4,07

29
fermentacin del residuo con tratamiento de temperatura (1.502 g/L); posiblemente,
en los pretratamientos al realizar los lavados para retirar tanto el SDS como el
perxido de hidrgeno se pierden varios nutrientes necesarios para el crecimiento y
actividad enzimtica de los microorganismos celulolticos.

Estos resultados reflejaron que el tratamiento con SDS y H
2
O
2
causa una inhibicin
enzimtica en el consorcio celuloltico, esto se debe a que el SDS es un tensoactivo
inico y desnaturalizante de protenas, y al quedar trazas de ste en el residuo
impide la degradacin de la celulosa por parte del complejo enzimtico (Castagnino,
2000), al igual que el perxido de hidrgeno, agente oxidante usado para remover
la lignina y la hemicelulosa presentes en materiales lignocelulsicos. Segn la
caracterizacin fsico qumica del residuo vegetal de Crisantemo, el porcentaje de
lignina es 0.51%, de hemicelulosa 2.03% y celulosa 65.3% (Anexo D), por lo tanto,
el pretratamiento con perxido no sera necesario por la baja proporcin de lignina y
hemicelulosa. Por el contrario su presencia inhibi la hidrlisis enzimtica al
proporcionar un pH alcalino de 9.8 el cual esta por encima de las condiciones
ptimas de actividad del complejo enzimtico reportadas por varios autores pH 5 a
50C (Palmarola, et al., 2005; Sun y Cheng 2002; Duff y Murria, 1996).

Al comparar los pretratamientos realizados al residuo vegetal, se determin que era
suficiente la reduccin de tamao del material para obtener mayor concentracin de
azcares reductores y de actividad enzimtica, pues algunos factores que afectan la
hidrlisis de la celulosa son el contenido de lignina y hemicelulosa, la porosidad de
la materia prima (rea superficial accesible) y cristalinidad de la celulosa, la cual se
reduce con la molienda; por lo tanto, no es necesario realizar tratamientos qumicos
al residuo de crisantemo debido a la mnima proporcin de lignina y hemicelulosa,
polmeros que reducen la eficiencia de la hidrlisis (Prasad, et al., 2006); debido
esto, el residuo vegetal se redujo de tamao en un molino de martillo hasta que
pasara por un tamiz con un dimetro de poro menor a 850m.

30
6.2 Fermentacin discontinua del residuo vegetal con el consorcio celuloltico

El objetivo de utilizar el consorcio celuloltico (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en
fermentacin discontinua con el residuo vegetal, fue obtener azcares reductores
presentes en la celulosa, gracias a la hidrlisis enzimtica catalizada por el complejo
de celulasas. Por tal razn se evaluaron diferentes variables: concentracin 5%
(p/v), 10% (p/v) y 12% (p/v) de residuo vegetal fresco y suplemento con: sales,
extracto de levadura y peptona (SVS), que podran tener algn efecto sobre la
degradacin de este polmero y por ende, en la concentracin de azcares
reductores liberados en el extracto crudo al finalizar la fermentacin (Figura 2). De
acuerdo con estos resultados, se determinaron las variables que permitieran obtener
la mayor concentracin de azcares reductores en el extracto crudo que fue
evaluado como sustrato fermentable con Saccharomyces cerevisiae.

Figura 2. Fermentacin del residuo vegetal con el consorcio celuloltico.

6.2.1 Residuo vegetal al 10% (p/v)

Para confirmar el efecto del tratamiento con SDS en la hidrlisis enzimtica, se
decidi realizar una fermentacin con el consorcio celuloltico en residuo vegetal
fresco al 10% (p/v), suplementado (SVS) y tratado con SDS, se realizaron
muestreos desde la hora 12 hasta la 24 (Figura 3, tabla 1 del anexo E). Adems se

31
realiz una fermentacin con SVS sin tratamiento con SDS (Figura 4, tabla 2 -
anexo E), para establecer diferencias, con el fin de determinar si el consorcio
necesita otros requerimientos nutricionales para su crecimiento y actividad
enzimtica.

Al comparar los resultados de la fermentacin con suplemento (SVS) 10% (p/v) con
y sin tratamiento se observ que la actividad enzimtica del consorcio es mejor al
utilizar el residuo sin tratamiento, al obtenerse una concentracin de azcares
reductores de 1.63g/L a la hora 12, mientras que en el residuo tratado fue 1.317 g/L
en la hora 20 (Figura 3 y 4). Este resultado corrobor que el SDS afecta la hidrlisis
enzimtica y reduce su velocidad de reaccin; probablemente al quedar trazas de
este tensoactivo en el residuo vegetal; razn por la cual se decidi no realizar
ningn pretratamiento, lo que significa una gran ventaja para llevar a cabo el
proceso al disminuir costos y tiempo de fermentacin.

0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
0 5 10 15 20 25 30
TIEMPO (h)
A
Z
C
A
R
E
S

R
E
D
U
C
T
O
R
E
S

(
g
/
L
)
0
10
20
30
40
50
60
U
C
/
L
Azcares reductores (g/L) UC/L pH 7 37C UC/L pH 5 50C

Figura 3. Fermentacin del consorcio celuloltico en residuo vegetal fresco al 10%,
tratado con SDS y suplementado. Azcares reductores liberados y actividad
enzimatica pH 7 a 37C Y pH 5 a 50C en funcin del Tiempo.

Al analizar los resultados de la fermentacin con residuo fresco al 10% (p/v) sin
tratamiento, con y sin suplemento, se observ que la mayor concentracin de

32
azcares reductores liberados se present al utilizar el residuo sin suplemento de
sales y fuente de nitrgeno (caldo SV). A la hora 12 y 22 se obtuvo una
concentracin de azcares de 2.08 g/L y 2.47 g/L, respectivamente (Figura 4, tabla
3 - anexo E), mientras que en la fermentacin con el residuo suplementado (caldo
SVS) la mayor concentracin de azcares fue 1.63 g/L a la hora 12.

Este resultado se present gracias a la composicin del residuo vegetal, el cual
posee 5.01% de protenas como fuente de nitrgeno, adems de minerales que
proporcionan un medio nutritivo para el crecimiento del consorcio celuloltico (Anexo
E). Los requerimientos nutricionales de los microorganismos celulolticos son
nitrgeno, fsforo, azufre, macroelementos y microelementos, los cuales
encuentran en su ambiente natural (residuo de Crisantemo); por esta razn no se
requieren de fuentes adicionales de nutrientes como peptona, extracto de levadura y
sales (Lynd, et al., 2002).

0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
0 5 10 15 20 25
TIEMPO (h)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
p
H
Azcares (con suplemento) Azcares (sin suplemento)
pH (con suplmento) pH (sin suplemento)

y sin suplemento.

33
Para determinar las mejores condiciones de la actividad celuloltica se evalu la
tcnica cuantitativa en un buffer fosfato pH 7 a 37C y un buffer de cido ctrico pH 5
a 50C. Segn varios autores el pH cido en un rango de 4 a 5 y la temperatura
entre 45C 50C, favorecen la hidrlisis enzimtica de la celulosa (Palmarola, et
al., 2005; Sun y Cheng, 2002; Duff y Murria, 1996). Los resultados obtenidos
mostraron en general, que la actividad enzimtica es mayor en condiciones de pH 7
y 37C (Figura 5 y 6), evidenciando que la expresin de las enzimas es mejor a pH
neutro y a una temperatura que no exceda los 40C, por ser microorganismos
mesfilos; y el pH cido reduce la produccin enzimtica de los dos
microorganismos en consorcio (Lynd, et al., 2002).

No obstante, la actividad celuloltica es muy baja con el consorcio celuloltico; ya que
la mayor actividad fue de 98.4UC/L (0.098 UC/mL), a la hora 22 de la fermentacin
con caldo SV 10% (p/v) (Figuras 5 y 6), en la cual el pH se mantuvo en un rango de
6 7 durante todo el proceso (Figura 4). Esta actividad es menor a la reportada por
Guevara y Zambrano 2006, al utilizar consorcios con cepas de B. subtilis y
Streptomyces sp. en residuos de caa de azcar, obteniendo valores mximos de
0.694 UC/mL y 0.680 UC/mL. A pesar que la actividad celuloltica se determin con
carboximetilcelulosa (CMC), sustrato que no representa la misma estructura
heterognea de los sustratos celulsicos naturales; siendo ms fcil de degradar por
los microorganismos al producir enzimas endoglucanasas, mientras que la hidrlisis
de la celulosa cristalina requiere todo el complejo enzimtico (Guevara y Zambrano
2006). Esto indica que los microorganismos utilizados para degradar el residuo
vegetal de Crisantemo no tienen una buena actividad celuloltica, tambin se ve
reflejado en la baja concentracin de azcares reductores liberados, al tener en
cuenta que la proporcin de celulosa en el residuo vegetal es de 65.3% (Anexo D),
aunque varios autores reportan que Streptomyces sp. produce las enzimas del
complejo, endoglucanasas, exoglucanasa y - glucosidasa (Ramrez y Coha 2003).

34
0
20
40
60
80
100
120
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
TIEMPO (h)
U
C
/
L
UC/L 10% sin suplemento UC/L 10% con suplemento

y sin suplemento.

0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
TIEMPO (h)
U
C
/
L

y sin suplemento.

35

Al evaluar esta concentracin de residuo vegetal en caldo SV y SVS se observ que
el consorcio tiene el mismo comportamiento de la fermentacin al 10% (p/v), ya que
la mayor concentracin de azcares reductores se obtuvo a la hora 14 con 2.25 g/L
en el caldo SV, mientras en el caldo SVS fue 2.15 g/L (Figura 7, tabla 4 y 5 - anexo
E). Igualmente la actividad enzimtica fue baja y mostr mejor expresin a 37C
(Figura 8 y 9) y pH neutro, durante las 22 horas de fermentacin el pH se mantuvo
entre 6 y 7 (Figura 7).

0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
TIEMPO (h)
A
Z
C
A
R
E
S

R
E
D
U
C
T
O
R
E
S

(
g
/
L
)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
p
H
Azcares (con suplemento) Azcares (sin suplemento)
pH (con suplemento) pH (sin suplemnto)

y sin suplemento.

36
0
20
40
60
80
100
120
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
TIEMPO (h)
U
C
/
L

y sin suplemento.

0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
TIEMPO (h)
U
C
/
L

Figura 9. Actividad enzimtica pH 5 a 50C vs. Tiempo. Fermentacin del
consorcio celuloltico en residuo vegetal fresco al 12% (p/v) sin tratamiento, con y
sin suplemento.


En esta fermentacin, se observ que la mayor actividad enzimtica y concentracin
de azcares reductores fue de 35.70 UC/L (pH 7 a 37C) y 0.849g/L en la hora 18,

37
respectivamente (Figura 10). Al comparar las tres concentraciones evaluadas de
sustrato vegetal con suplemento (SVS) 5% (p/v), 10% (p/v) y 12% (p/v) se
observaron valores muy bajos, por tal razn, no se realizaron ms experimentos con
la concentracin al 5% (p/v), como se muestran en la tabla 6 - anexo E.

0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
TIEMPO (h)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
U
C
/
L
Azcares reductores (g/L) UC/L pH 7 37C

Figura 10. Fermentacin del consorcio celuloltico en residuo vegetal fresco al 5%
(p/v), tratado con SDS y suplementado. Azcares reductores liberados y actividad
enzimtica pH 7 a 37C en funcin del Tiempo.

La concentracin de sustrato es uno de los principales factores que afectan la
produccin y la velocidad inicial de la hidrlisis enzimtica de la celulosa. Un
incremento de la concentracin de sustrato normalmente resulta en un aumento de
la produccin y de la velocidad de reaccin de la hidrlisis. Sin embargo, altas
concentraciones de sustrato pueden causar inhibicin enzimtica, lo cual disminuye
sustancialmente la velocidad de la hidrlisis, y la dimensin de la inhibicin por
sustrato depende de la relacin del sustrato total a enzima total (Romano, et al.,
2005; Sun y Cheng, 2002). Al evaluar las tres concentraciones de residuo vegetal
(SVS) se observ una diferencia en la actividad celuloltica entre el 5% (p/v) y el
10% (p/v), pues la mayor actividad en el caldo SVS, fue 35.70 UC/L y 64.2 UC/L
respectivamente, de igual forma en el caldo SVS 12% (p/v) fue 80 UC/L a 37C y pH
7. En el SV 10% (p/v) y 12% (p/v) a la hora 22 se present la actividad ms alta
98.4 UC/L y 105.2 UC/L respectivamente (Tabla 3 y 5 - anexo E).

38
De acuerdo al anlisis de medias y la desviacin estndar los datos de las
repeticiones de cada fermentacin no presentaron una amplia dispersin, por lo
tanto, se determin que la mayor concentracin de azcares reductores liberados
estaba entre el residuo vegetal al 10% (p/v) y 12% (p/v) sin tratamiento y sin
suplemento, se decidi obtener el sustrato fermentable con el residuo de crisantemo
al 10% (p/v); ya que se llevo a cabo la estadstica de prueba con la distribucin t
student, concluyendo que no existe suficiente evidencia estadstica para rechazar la
hiptesis nula (Ho). Por lo tanto, se afirma que no existe evidencia estadsticamente
significativa en la concentracin de azcares reductores liberados tanto en el SV
10%(p/v) como en el SV 12%(p/v). Adems, la manipulacin del residuo a esta
concentracin (10%) era ms fcil y se obtena un volumen ms alto del extracto
crudo (Anexo E). As mismo, se decidi utilizar el caldo SV porque present mayor
concentracin de azcares reductores liberados, lo cual es una ventaja en cuanto
costos del proceso, ya que no es necesario adicionar fuentes nutricionales para que
el consorcio se desarrolle, pues el residuo vegetal de Crisantemo proporciona la
fuente de carbono, nitrgeno y sales. Tambin se determin que el tiempo de la
fermentacin para la obtencin del sustrato fermentable (extracto crudo) fuera de 12
horas al encontrar que la diferencia con la hora 22 no era relevante para prolongar
10 horas ms el proceso.

6.3 Evaluacin del sustrato fermentable con Saccharomyces cerevisiae

6.3.1 Fermentacin discontinua control

Se evalu el comportamiento de Saccharomyces cerevisiae en caldo YGC con 20
g/L y 2 g/L de glucosa, para determinar biomasa por peso seco (Anexo F), consumo
de sustrato y produccin de etanol. Estas curvas se utilizaron como control para
evaluar el comportamiento de la cepa, teniendo en cuenta que esta levadura crece
con 20g/L de glucosa, pero debido a que la concentracin de azcares reductores
en el sustrato fermentable obtenido a partir del residuo vegetal de Crisantemo fue de
2g/L, se realiz el control con esta concentracin.

39

De acuerdo a pruebas preliminares realizadas para determinar las condiciones
ptimas de las fermentaciones control se decidi llevarlas a cabo durante 16 horas a
30C, 70 rpm, pH 6,5 6,7 y sin suministro de oxgeno.

Se utiliz un inculo de 12 horas de incubacin con una concentracin celular de
2.76 g/L, un recuento de 50 x 10
6
UFC/mL, y una concentracin de azcares de 0.37
g/L

6.3.1.1 Fermentacin control con 20 g/L de glucosa

En esta fermentacin no se present una fase de adaptacin, se observ una fase
exponencial desde la hora 0 hasta la hora 12 con una concentracin de biomasa de
6.326 g/L, en esta hora del proceso la concentracin de glucosa disminuy hasta
0.311 g/L, y luego empez la fase estacionaria, esto mostr un crecimiento rpido
de la levadura relacionado con el consumo de sustrato (Figura 11, tabla 1 - anexo
G).

Saccharomyces cerevisiae en condiciones aerobias aumenta la biomasa y produce
poco alcohol, pero en anaerobiosis el crecimiento celular es lento y la produccin de
etanol es alta al realizar la conversin de hexosas, principalmente glucosa, fructosa,
manosa y galactosa. Alrededor del 70% de la energa es liberada como calor; el
resto es preservado en dos ATP, con enlaces fosfato terminales de alta energa,
para usarlo en las reacciones de transferencia, tales como la activacin de la
glucosa (fosforilacin) y de aminocidos antes de la polimerizacin (Romano, et al.,
2005; Zaldivar, et al., 2005). Por tal razn, Saccharomyces cerevisiae es el
microorganismo ms utilizado para produccin de etanol al llevar a cabo un
metabolismo respiratorio o fermentativo de acuerdo con la concentracin de oxgeno
(Noor, et al., 2003).

En la fermentacin control la concentracin de oxgeno fue baja, por la mnima
agitacin (70 rpm) y el volumen utilizado, aunque no se proporcion totalmente las

40
condiciones de anaerobiosis para produccin de etanol. Sin embargo por el
metabolismo de la levadura en medios ricos en azcar en presencia de aire se pasa
espontneamente al proceso anaerbico porque el consumo de oxgeno es muy
alto, por lo que se agota rpidamente. Adems, la abundante produccin de CO
2

suele desplazar el aire de la atmsfera, dificultando la disolucin del oxgeno
(Carballo 2000; Otterstedt, et al., 2004).

0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
TIEMPO (h)
B
I
O
M
A
S
A

(
g
/
L
)

-

p
H
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
Biomasa (g/L) pH Azcares reductores (g/L)

tiempo. Fermentacin control Saccharomyces cerevisiae en caldo YGC con 20 g/L
de glucosa.

Al principio de la fermentacin el valor de pH fue de 6.38, al transcurrir el proceso el
pH disminuy hasta llegar a 5 en la hora 10, lo que tuvo relacin con la cada de la
concentracin de la fuente de carbono; esto indica que el consumo de la glucosa
acidific el medio al producirse cidos como el succnico, actico, frmico,
propinico y pirvico. Desde la hora 12 el pH present un leve aumento debido al
consumo del extracto de levadura; ya que se da la liberacin de aminocidos y otros
productos nitrogenados (Figura 11).

Para cuantificar el etanol por cromatografa lquida HPLC se seleccionaron las
muestras de las diferentes horas de fermentacin que por destilacin simple
indicaron la produccin de este alcohol (datos no mostrados).

41

Al determinar el etanol por HPLC, a la hora 10 de fermentacin se obtuvo una
concentracin de 9.333 g/L y un rendimiento (Y
p/s
) de 0.45 g/g (Tabla 2). Este
resultado evidenci que la cepa de S. cerevisiae utilizada si produjo etanol bajo las
condiciones de fermentacin planteadas. Segn un estudio realizado por Yu y
Zhang, 2004, esta levadura con una concentracin de 31.6 g/L de glucosa produce
13.7g/L de etanol con un rendimiento (Y
p/s
) de 0.43 g/g, luego de 18 horas de
fermentacin en caldo YGC; por lo tanto, en la fermentacin control con 20g/L de
glucosa, el consumo de la fuente de carbono fue consistente con el periodo de
tiempo de produccin de etanol (Anexo J1).

Tabla 2. Determinacin de etanol por HPLC fermentaciones control
Control con 20g/L Control con 2g/L Hora
Rendimiento
Y
(p/s)
(g/g)
Etanol
g/L
%v/v Rendimiento
Y
(p/s)
(g/g)
Etanol
g/L
%v/v
6
(Fase
exponencial)
ND ND ND 0.11 0.229 0.029
10
(Fase
estacionaria)
0.45 9.333 1.20 1.14 2.8 0.36
ND= No se determin

6.3.1.2 Fermentacin control con 2 g/L de glucosa

En esta fermentacin Saccharomyces cerevisiae no present fase de adaptacin, la
fase exponencial fue hasta la hora 6 con una concentracin celular de 2.7g/L y de
glucosa 0.35g/L, a partir de la hora 8 empez la fase estacionaria y la concentracin
de la fuente de carbono se mantuvo estable (Figura 12, tabla 2 anexo G).

El pH disminuy de 6.3 a 5.75 a la hora 4, mostrando la relacin del consumo de
glucosa y la produccin de cidos, mientras en la fase estacionaria el pH tuvo un
aumento leve por la liberacin de aminocidos al consumirse el extracto de levadura
(Figura 12).

42

Al comparar esta fermentacin con la de 20g/L de glucosa (Y
x/s
= 0.37 g/g), se
evidenci un mayor rendimiento de biomasa a partir de sustrato (Y
x/s
) de 1.44 g/g
para la fermentacin de 2g/L de glucosa. Esto indica que la levadura transforma con
mayor eficiencia la glucosa en mnimas concentraciones; ya que cuando la fuente
de carbono es el factor limitante del crecimiento se obtiene ms biomasa y un
equilibrio entre el nmero de clulas, el peso seco, el nitrgeno celular, el RNA y el
DNA al producirse a la misma velocidad (Pars y Jurez 1997). Con 20 g/L de
glucosa Saccharomyces cerevisiae present en la hora 6 una concentracin celular
de 3.07 g/L al consumir 7.53 g/L de glucosa, esto confirm que en la fermentacin
control de 2 g/L existi mayor produccin de biomasa con menor consumo de
sustrato al obtenerse la mayor concentracin de clulas a la hora 6 de fermentacin
2.729g/L al consumir 1.775g/L de glucosa.

Al analizar la cintica de S. cerevisiae en las fermentaciones control no fue posible
comparar la velocidad de crecimiento (
x
); ya que el control de 20g/L no cumple con
la cintica de orden 1, por esto solo se determin el tiempo de duplicacin el cual
fue de 18 min para el control de 20g/L y 57 min en el control de 2g/L, esto evidenci
que la levadura al tener mayor concentracin de glucosa tiene un crecimiento ms
rpido.

0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
TIEMPO (h)
B
I
O
M
A
S
A

(
g
/
L
)

-

p
H
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
BIOMASA (g/L) pH AZCARES REDUCTORES (g/L)

43
tiempo. Fermentacin control Saccharomyces cerevisiae en caldo YGC con 2 g/L de
glucosa.

Al cuantificar el etanol por cromatografa lquida se obtuvo una concentracin de
etanol de 2.805 g/L (Anexo J2) con un rendimiento (Y
p/s
) de 1.14 g/g en la hora 10
de fermentacin (Tabla 2). Este resultado evidenci que con 2g/L de glucosa
Saccharomyces cerevisiae puede producir etanol, esta concentracin de azcar es
mnima para la obtencin de alcohol; pues en varios estudios la menor
concentracin de glucosa para este fin es de 20g/L, aunque en la investigacin
realizada por Zaldivar, et al., 2005, con una concentracin de 13.5g/L y 120 g/L de
glucosa se obtuvo un rendimiento de producto a partir de sustrato (Y
p/s
) de 0.46 g/g
y 0.47 g/g con una concentracin de etanol de 6.2 g/L y 5.6 g/L, respectivamente.

El rendimiento (Y
p/s
) obtenido en esta fermentacin control fue mayor al terico 0.51
g/g, posiblemente, por la presencia de sacarosa en el medio de cultivo, azcar que
fue detectado en el anlisis cromatogrfico y no por la tcnica de DNS por ser un
azcar no reductor. S. cerevisiae posee la enzima invertasa para hidrolizar la
sacarosa y producir glucosa y fructosa, azcares fermentables que no fueron
cuantificados desde la hora 0 de fermentacin, esto ocasion la determinacin de
valores no reales de la concentracin de azcares reductores, por esta razn el
rendimiento fue muy alto.

6.3.2 Fermentacin discontinua del sustrato fermentable con Saccharomyces
cerevisiae

El sustrato fermentable con una concentracin de 2.547 g/L de azcares reductores
se obtuvo al realizar la fermentacin de 12 horas con el consorcio celultico en el
residuo vegetal de Crisantemo al 10% sin pretratamiento ni suplemento (Figura 13).

44
La evaluacin del SF se llev a cabo en una fermentacin con Saccharomyces
cerevisiae por 32 horas, se determin concentracin de biomasa por peso seco, de
azcares reductores por la tcnica de DNS y produccin de etanol por cromatografa
lquida HPLC.

Figura 13. Fermentacin del sustrato fermentable con clulas libres de

El SF fue sometido a esterilizacin por 30 minutos a 20 lb de presin, adems se le
adicion ampicilina en una concentracin de 300mg/L; esto debido a la presencia
del bacilo esporulado del consorcio celulolitico que podra ser un contaminante en
esta parte del proceso. Lo anterior se determin al realizar pruebas preliminares que
demostraron la resistencia de este microorganismo a la esterilizacin en condiciones
normales (15min, 15 lb de presin a 121C), adems, no se evidenci algn efecto
por parte de la ampicilina sobre Saccharomyces cerevisiae, por ser un antibitico
bactericida que inhibe la sntesis del peptidoglicano.

El inculo se realiz bajo las mismas condiciones que en la fermentacin control, se
propag en caldo YGC para asegurar una alta concentracin de biomasa al iniciar la
fermentacin. El inculo present una concentracin celular de 2.8 g/L, un recuento
de 40 x 10
6
UFC/mL, y una concentracin de azcares de 0.38 g/L.

45
Las condiciones durante las 32 horas de fermentacin fueron iguales a las del
control, es decir que la concentracin de oxgeno fue reducida por el volumen
efectivo de trabajo utilizado y la mnima agitacin (70 rpm).

La levadura en el SF tuvo una fase exponencial hasta la hora 12 con una
concentracin de biomasa de 2.594 g/L, de azcares reductores 1.09g/L y un
rendimiento de biomasa a partir de sustrato (Y
x/s
) de 1.45 g/g; desde de la hora 14
se observ la fase estacionaria hasta la hora 28 en la cual, la biomasa disminuy
entrando a la fase de muerte y la concentracin del sustrato se mantuvo estable. El
consumo de azcares reductores fue rpido hasta la hora 14, terminando la
fermentacin con una concentracin de 0.667 g/L (Figura 14), estos posiblemente
pueden ser azcares reductores no asimilables por Saccharomyces cerevisiae como
la celobiosa, que es producto de la hidrlisis de la celulosa del residuo vegetal de
Crisantemo.

Al comparar la cintica de Saccharomyces cerevisiae en el SF con el control de 2g/L
de glucosa, se encontr una diferencia en fase exponencial, en el control fue hasta
la hora 6 y en el sustrato fermentable hasta la hora 14, se determin que la levadura
presenta una fase de adaptacin hasta la hora 4, posiblemente porque el inculo se
propag en caldo YGC; razn por la cual, la fase logartmica se prolong unas horas
ms. Por otra parte, no fue posible comparar con el control de 2g/L de glucosa, la
velocidad de crecimiento (
x
); ya que la fermentacin en el SF no cumple con la
cintica de orden 1, por esto solo se determin el tiempo de duplicacin el cual fue
de 57 min y 46.5 min, respectivamente, esto evidenci que la levadura tiene un
crecimiento ms rpido en el sustrato fermentable.

El comportamiento de la biomasa en la fermentacin evidenci que el SF puede ser
considerado como un medio que permite el crecimiento de Saccharomyces
cerevisiae al suplir ciertos requerimientos nutricionales como la fuente de carbono,
de nitrgeno, fsforo, azufre y elementos traza. Segn la caracterizacin de
composicin nutricional el SF contiene 0.87g/L de nitrgeno total, 0.41 g/L de
fsforo, 34 ppm de azufre y elementos como calcio, zinc, hierro, magnesio y
manganeso en bajas concentraciones (Anexo I); estas fuentes nutricionales

46
promueven el crecimiento de la levadura sin necesidad de adicionar otros
componentes al sustrato fermentable, ya que se obtuvo un tiempo de duplicacin
menor, una concentracin de biomasa similar y el mismo rendimiento (Y
x/s
) que en
caldo YGC (medio sinttico) de la fermentacin control 2 g/L de glucosa. Este SF es
una alternativa como medio de cultivo que proporciona ventajas en cuanto a costos
y composicin nutricional al tener adems elementos traza que no se encuentran en
el medio convencional (YGC), lo que favorece la produccin de biomasa.

El pH fue aumentando en funcin del tiempo de 6.38 a 6.8 (Figura 14), esto
evidenci que el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae puede darse en un
rango amplio de pH debido a la capacidad de mantener estable el pH intracelular
entre 5.8 y 6.3 (Tuite, 1991). Varios autores reportan que el pH cido (4.5 5) es
una de las condiciones ptimas para la levadura al incrementar la produccin de
biomasa y de etanol (Yu y Zhang, 2004; Martn, et al, 2005; Palmarola, et al, 2005).
En este estudio se realiz una prueba preeliminar para determinar si el pH 4.5
favoreca la produccin de etanol por parte de la cepa utilizada; se concluy que el
pH entre 6 y 7 mostr mejores resultados, ya que a pH cido no hubo produccin de
etanol (datos no mostrados).

0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
TIEMPO (h)
B
I
O
M
A
S
A

(
g
/
L
)

-

p
H
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
BIOMASA (g/L) pH AZCARES REDUCTORES (g/L)

Figura 14. Concentracin de biomasa y azcares reductores en funcin del tiempo.
Fermentacin con Saccharomyces cerevisiae en caldo SF.

47
Al analizar los datos de cromatografa lquida se obtuvo una concentracin promedio
de etanol de 3.5 g/L (Anexo J3) y un rendimiento (Y
p/s
) de 1.73 g/g, en la hora 10 de
fermentacin. En la fase estacionaria la concentracin de etanol estuvo estable
hasta la hora 28, en la cual disminuyo posiblemente, porque la levadura lo empez a
consumir como fuente de carbono (Tabla 3). Esto indica que la produccin de etanol
si esta directamente asociada con el metabolismo energtico, es decir, que la
velocidad de produccin esta relacionada con la demanda de energa de las clulas;
por esto, el etanol se sintetiza en las rutas de formacin de ATP (Doran, 1995).

A la hora 24 del proceso el rendimiento (Y
p/s
) mostr un resultado de 0.46 g/g, pero
los dems rendimientos fueron mayores al terico 0.51 g/g, posiblemente, por la
presencia de sacarosa en el sustrato fermentable, azcar que fue detectado en el
anlisis cromatogrfico y no por la tcnica de DNS por ser un azcar no reductor.
Pues S. cerevisiae seguramente hidroliz la sacarosa en glucosa y fructosa durante
el tiempo de fermentacin, esto ocasion la determinacin de valores no reales de
la concentracin de azcares reductores, por esta razn el rendimiento fue muy alto.

Tabla 3. Determinacin de etanol fermentacin en SF
Hora Rendimiento Y
(p/s)
(g/g)
Etanol g/L %v/v etanol
10
(Fase exponencial)
1.73 3.5 0.45
18
(Fase estacionaria)
0.85 3.536 0.45
22
(Fase estacionaria)
0.613 3.750 0.48
24
(Fase estacionaria)
0.46 3.627 0.47
28
(Fase estacionaria)
0.21 2.212 0.28

Al comparar estos resultados con el control de 2g/L de glucosa se corrobor que
Saccharomyces cerevisiae si puede producir etanol con esta mnima concentracin
de glucosa. Aunque en el SF la concentracin de etanol fue mayor que el control,
esto confirm que el SF si es un medio nutritivo, natural y econmico que

48
proporciona los requerimientos para el crecimiento de la levadura y la produccin de
etanol con mejores resultados que el medio de cultivo sinttico YGC; ya que,
adems de glucosa tiene otros azcares como fructosa y sacarosa que S. cerevisiae
puede fermentar (Anexo J4).

De acuerdo al anlisis de medias se determin que la mayor concentracin de
biomasa se obtuvo en la fermentacin control con 20g/L de glucosa, adems, los
datos de las repeticiones de cada fermentacin no presentaron una amplia
dispersin (Anexo H). Para comparar el crecimiento de S. cerevisiae en el control
con 2 g/L de glucosa y la fermentacin del sustrato fermentable se llevo a cabo la
estadstica de prueba con la distribucin t student, concluyendo que no existe
suficiente evidencia estadstica para rechazar la hiptesis nula (Ho). Por lo tanto, se
afirma que no existe evidencia estadsticamente significativa en la concentracin
celular promedio de S. cerevisiae tanto en el control como en el sustrato
fermentable evaluado (p > 0.05) (Anexo K).

49
CONCLUSIONES

Los tratamientos con SDS y Perxido de hidrgeno mostraron inhibicin de la
actividad enzimtica del consorcio celuloltico.

El residuo vegetal de Crisantemo (Dendranthema grandiflora) no requiere
pretratamiento qumico por la proporcin mnima de lignina 0.51% y
hemicelulosa 2.03%, solo es necesario la reduccin de tamao para obtener
mayor concentracin de azcares reductores liberados por parte del consorcio
celuloltico.

El residuo vegetal de Crisantemo no requiere de suplemento para liberar mayor
concentracin de azcares reductores por parte del consorcio celuloltico.

Se seleccion el residuo vegetal al 10% (p/v), el cual mostr una mnima
diferencia con el 12% (p/v) al comparar la concentracin de azcares reductores
liberados en las fermentaciones de las tres concentraciones evaluadas.

El proceso para la obtencin del sustrato fermentable consta de las siguientes
etapas: reduccin de tamao, fermentacin discontinua con el consorcio
celuloltico (35C por 12 horas, 130 rpm), centrifugacin y filtracin.

Se obtuvo un sustrato fermentable a partir de residuo vegetal 10% (p/v) con un
consorcio celuloltico (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) con una concentracin de
azcares reductores de 2.547 g/L.

Al comparar la produccin de biomasa de Saccharomyces cerevisiae entre las
fermentaciones control de 20g/L y 2g/L de glucosa y el sustrato fermentable el
rendimiento Y
x/s
fue igual en las dos ltimas 1.44 g/g, mejor que el obtenido con
20g/L.

50
El tiempo de duplicacin fue mayor en el sustrato fermentable, demostrando
mayor velocidad de crecimiento comparado con el control de 2 g/L de glucosa.

La cepa de Saccharomyces cerevisiae utilizada mostr baja produccin de
etanol tanto en caldo YGC como en el SF.

Los rendimientos Y
p/s
de la fermentacin control 2 g/L y del SF fueron mayores
que el terico, seguramente por la presencia de sacarosa, azcar que no se
cuantifico durante el proceso.

No existi evidencia estadsticamente significativa en la concentracin celular
promedio de S. cerevisiae tanto en el control de 2 g/L de glucosa como en el
sustrato fermentable evaluado.

El sustrato fermentable permiti la obtencin de etanol con una concentracin de
3.75 g/L usando S. cerevisiae, mayor que la obtenida en el control de 2 g/L de
glucosa 2.8 g/L.

El sustrato fermentable obtenido demostr ser un medio nutritivo y econmico
que favorece la produccin de biomasa de Saccharomyces cerevisiae, al tener
fuente de carbono, nitrgeno, sales y elementos traza.

51
RECOMENDACIONES

Evaluar otras cepas de microorganismos celulolticos en el residuo vegetal
de Crisantemo, que puedan presentar mayor actividad enzimtica, para
obtener un sustrato fermentable con alta concentracin de azcares
reductores.

Utilizar tcnicas de inmovilizacin de microorganismos en la obtencin del
sustrato fermentable y en la produccin de etanol.

Estudiar la produccin de etanol a partir del sustrato fermentable utilizando
otra cepa capaz de fermentar los azcares reductores presentes.

Utilizar el sustrato fermentable para produccin de biomasa o suplemento
nutricional para suelos o procesos de compostaje.

Evaluar el crecimiento de otros microorganismos en el sustrato fermentable,
al ser una alternativa como medio de cultivo.

52
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BIBLIOGRAFIA COMO RECURSOS ELECTRONICOS

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http://unalmed.edu.co/~prensa/impro4.htm [Consulta 28 de Enero de 2006].

59
ANEXO A

SOLUCIONES DE TRABAJO

A.1 Buffer fosfato

Pesar 3.5g de Na
2
HPO
4
y disolver en 100ml de agua destilada
Pesar 3.45g de NaH
2
PO
4
y disolver en 100ml de agua destilada.
Mezclar las dos soluciones
Ajustar a pH 70.2

A.2 Buffer cido ctrico

Pesar 1.03g de cido citrico y disolver en 49 mL de agua destilada.
Pesar 2.74g de Na
2
HPO
4
y disolver en 51 mL de agua destilada.
Mezclar las dos soluciones.
Ajustar a pH 5 0.2

60
ANEXO B
Curva patrn de cido 3,5-dinitrosaliclico DNS


Curva utilizada para conocer la concentracin de azcares reductores obtenidos en
el residuo tratado con el consorcio celuloltico

Concentracin de glucosa g/L Absorbancia a 540nm
0.5 0.26
0.7 0.37
1 0.5
1.5 0.73
1.7 0.89
2 1.09
Promedio tres repeticiones

y = 0.5346x - 0.0186
R
2
= 0.9885
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Concentracin (g/L)
A
B
S

5
4
0
n
m


61

Curva utilizada para conocer la concentracin de glucosa consumida por

CONCENTRACIN
g/l
ABS
540nm
0,5 0,271
0,7 0,352
1 0,485
1,5 0,775
1,7 0,827
2 0,995

y = 0.4883x + 0.0153
R
2
= 0.9962
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Concentracin (g/L)
A
B
S

5
4
0
n
m


62
ANEXO C

Pretratamiento del residuo vegetal

TABLA 1. Fermentacin con el consorcio celuloltico en residuo vegetal 10% con y
sin tratamiento en SDS

SIN SDS CON SDS
AZCARES REDUCTORES Hora
g/L
0 1,329 0,586
22 2,461 1,440

Promedio de tres repeticiones

63
ANEXO E.

Fermentacin discontinua del residuo vegetal con el consorcio celuloltico

TABLA 1. Fermentacin con el consorcio celuloltico en residuo vegetal 10% suplementado y tratado con SDS

Azcares reductores Act enzimtica 37pH 7 Act enzimtica 50pH 5 pH
Hora
g/L Desv. estndar Coef. variacin *UC/L Desv. estndar Coef. variacin UC/L Desv. estndar Coef. variacin Promedio Desv. estndar Coef. variacin
12 1,104 0,03 3,1 35,0 0,01 0,03 43,7 0,05 0,11 6,65 0,03 0,43
14 1,062 0,02 2,2 33,7 0,20 0,59 35,7 0,06 0,16 6,63 0,01 0,09
16 0,961 0,08 8,8 32,8 0,05 0,15 30,1 0,09 0,30 6,64 0,04 0,53
18 1,286 0,00 0,0 52,1 0,11 0,22 37,8 0,80 2,12 6,61 0,01 0,11
20 1,317 0,02 1,5 53,7 0,03 0,06 41,0 0,44 1,08 6,55 0,01 0,15
22 1,059 0,06 5,3 35,2 0,01 0,03 28,2 1,14 4,06 6,45 0,04 0,54
24 1,118 0,04 3,7 39,8 0,05 0,13 41,4 0,57 1,37 6,39 0,01 0,16

* Una unidad celuloltica equivale a la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar una micromol de glucosa por minuto, bajo las condiciones del
ensayo.

64

TABLA 2. Fermentacin con el consorcio celuloltico en residuo vegetal 10% suplementado y sin tratamiento

Hora
g/L Desv. estndar Coef. variacin UC/L Desv. estndar Coef. variacin UC/L Desviacin estndar Coeficiente de variacin Promedio Desv. estndar Coef. variacin
0 1,08 0,021 1,9 ND ND ND ND ND ND 5.83 0.01 0.17
6 1,42 0,026 1,9 54,4 1,20 2,21 38,5 1,13 2,93 5,91 0,01 0,17
12 1,63 0,018 1,1 55,7 1,23 2,21 39,9 0,93 2,32 6,02 0,08 1,33
14 1,59 0,000 0,0 56,2 2,36 4,20 46,2 0,00 0,00 6,31 0,30 4,76
16 1,19 0,084 7,0 52,5 2,08 3,96 37,6 0,14 0,37 6,22 0,02 0,28
18 1,03 0,075 7,2 32,7 0,12 0,37 33,2 1,90 5,72 6,26 0,09 1,42
20 1,05 0,035 3,4 35,1 1,34 3,81 35,3 1,20 3,40 6,46 0,29 4,43
22 1,14 0,042 3,7 37.9 0 0 43,2 0,00 0,00 7,12 0,49 6,85
* ND= No se determin

65

TABLA 3. Fermentacin con el consorcio celuloltico en residuo vegetal 10% sin suplemento y sin tratamiento

Hora
g/L Desv. estndar Coef. variacin UC/L Desv. estndar Coef. variacin UC/L Desv. estndar Coef. variacin Promedio Desv. estndar Coef. variacin
0 1,533 0,08 5,0 ND ND ND ND ND ND 6.00 0.01 0.17
6 1,607 0,03 1,6 59,7 1,56 2,62 46,5 0,36 0,77 6,30 0,02 0,32
12 2,084 0,04 2,0 80,8 2,47 3,06 55,7 0,00 0,00 6,54 0,05 0,76
14 2,082 0,06 2,9 97,6 4,36 4,47 72,5 0,21 0,29 6,72 0,03 0,39
16 2,015 0,06 3,0 83,9 3,28 3,91 54,0 0,38 0,70 6,96 0,06 0,90
18 1,932 0,09 4,7 80,2 4,68 5,83 60,2 0,28 0,46 7,27 0,13 1,77
20 1,742 0,05 2,9 65,1 4,26 6,54 48,3 2,36 4,89 7,47 0,03 0,39
22 2,474 0,09 3,6 98,4 4,65 4,73 78,1 0,99 1,27 7,60 0,03 0,33
* ND= No se determin

66

TABLA 4. Fermentacin con el consorcio celuloltico en residuo vegetal 12% suplementado y sin tratamiento

Hora
0 1,47 0,07 4,8 ND ND ND ND ND ND 5.53 0.02 0.36
6 1,53 0,00 0,1 51,56 1,045 2,03 31,92 0,84 2,64 5,70 0,03 0,53
12 2,15 0,10 4,7 79,73 1,732 2,17 36,67 0,00 0,00 5,83 0,04 0,69
14 1,91 0,00 0,0 82,79 0,000 0,00 74,81 0,02 0,03 5,89 0,05 0,85
16 1,89 0,02 1,1 76,24 2,861 3,75 29,13 0,02 0,07 6,50 0,06 0,92
18 1,60 0,04 2,2 58,54 1,423 2,43 32,23 0,32 0,98 6,26 0,09 1,44
20 1,78 0,02 1,3 54,22 2,754 5,08 29,83 1,14 3,80 6,26 0,08 1,28
22 1,60 0,02 1,2 56,04 2,052 3,66 33,52 1,30 3,89 6,29 0,03 0,48
* ND No se determin

67

TABLA 5. Fermentacin con el consorcio celuloltico en residuo vegetal 12% sin suplemento y sin tratamiento

Hora
0 1,773 0,05 2,8 ND ND ND ND ND ND 6.29 0.01 0.16
6 1,842 0,06 3,0 77 0,44 0,57 50,914 10,00 19,64 6,31 0,05 0,81
12 1,952 0,09 4,6 85,1 0,18 0,21 55,388 15,42 27,85 6,6 0,01 0,15
14 2,249 0,03 1,3 104,9 0,82 0,78 68,093 6,89 10,12 6,82 0,11 1,57
16 2,227 0,06 2,6 92 0,95 1,03 61,256 11,28 18,42 6,96 0,03 0,38
18 2,089 0,06 2,7 94,9 0,43 0,45 68,481 23,90 34,90 7,15 0,15 2,14
20 1,931 0,08 4,0 73,4 0,18 0,25 48,332 23,37 48,35 7,4 0,05 0,62
22 2,317 0,03 1,3 105,2 0,29 0,28 82,884 8,39 10,12 7,49 0,08 1,11
* ND No se determin

68
TABLA 6. Fermentacin con el consorcio celuloltico en residuo vegetal 5%
(p/v), 10% (p/v) y 12% (p/v) suplementado y sin tratamiento

ND No se determin

Residuo vegetal 5% Residuo vegetal 10% Residuo vegetal 12%
Azcares
reductores
Act
enzimtica
37pH 7
Azcares
reductores
Act
enzimtica
37pH 7
Azcares
reductores
Act
enzimtica
37pH 7

HORA
g/L UC/L g/L UC/L g/L UC/L
0 0,378 0 1,08 ND 1,47 ND
6 0,435 11,85 1,42 54,4 1,53 51,56
12 0,352 30,27 1,63 55,7 2,15 79,73
14 ND ND 1,59 56,2 1,91 82,79
16 0,589 17,80 1,19 52,5 1,89 76,24
18 0,849 35,70 1,03 32,7 1,60 58,54
20 0,423 35,00 1,05 35,1 1,78 54,22
22 0,419 25,50 1,14 37,9 1,60 56,04

69
ANLISIS ESTADSTICO

Estadstica de prueba distribucin t student

Hiptesis general:

La concentracin de azcares reductores liberados en la fermentacin con SV al
10%(p/v) no difiere de la concentracin de azcares reductores liberados en la
fermentacin con SV al 12%(p/v).

H
0
:
1
-
2
= 0
H
i
:
1
-
2
0

Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas desiguales SV 10%(p/v) SV 12%(p/v)
Media 1.934 2.048
Varianza 0.092 0.041
Observaciones 8 8
Diferencia hipottica de las medias 0
Grados de libertad 12
Estadstico t -0.881
P(T<=t) dos colas 0.395
Valor crtico de t (dos colas) 2.179

70
ANEXO D

Caracterizacin fsico-qumica del Residuo Vegetal de Crisantemo

RESULTADOS ANALTICOS

Humedad 7,92 % GRAVIMTRICO (MET. INTERNO)
Fraccin Mineral 2,84 % GRAVIMTRICO (MET. INTERNO)
Prdidas por Volatilizacin 89,2 % GRAVIMTRICO (MET. INTERNO)
CARACTERIZACIN DE LA FRACCIN ORGNICA (89.2 %)
Protena 5,01 % MICRO-KJELDHAL (MET. INTERNO)
Celulosa 65,3 % SUMATORIA
Hemicelulosa 2,03 % SUMATORIA
Carbohidratos no
estructurales
16,6 % COLORIMTRICO (MET. INTERNO)
Lignina 0,51 % GRAVIMTRICO (MET. INTERNO)
Humedad 7,92 % GRAVIMTRICO (MET. INTERNO)
Fraccin Mineral 2,84 % GRAVIMTRICO (MET. INTERNO)
Prdidas por Volatilizacin 89,2 % GRAVIMTRICO (MET. INTERNO)
FRACCIN ORGNICA (89.2%)
Grasa 0,31 % GRAVIMTRICO (MET. INTERNO)
Fibra Cruda 46,4 % GRAVIMTRICO (MET. INTERNO)
Protena 5,01 % MICRO-KJELDHAL (MET. INTERNO)
Extracto no Nitrogenado 37,5 % SUMATORIA

Fibra detergente neutra 68,3 % GRAVIMTRICO (MET. INTERNO)

71
Fibra detergente cida 66,3 % GRAVIMTRICO (MET. INTERNO)
NUTRIENTES
Fsforo (P2O5) 0,27 % COLORIMTRICO (NTC 234)
Calcio (CaO) 0,69 % ABS. ATMICA (MET. INTERNO)
Slice (SiO2) 0,55 % ABS. ATMICA (MET. INTERNO)

72
ANEXO F

Curva peso seco de Saccharomyces cerevisiae

Concentracin biomasa g/L ABS 620 nm
3.18 0.858
2.39 0.745
1.59 0.501
1.19 0.416
0.95 0.339
0.8 0.294
0.68 0.257
0.6 0.192
0.53 0.170

y = 0,2625x + 0,0718
R
2
= 0,9803
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Biomasa g/L
A
B
S

6
2
0

n
m

Figura 3. Curva peso seco de Saccharomyces cerevisiae. Absorbancia en funcin
de la concentracin de biomasa

73
ANEXO G.

Evaluacin del sustrato fermentable con Saccharomyces cerevisiae

Fermentacin discontinua control

TABLA 1. Fermentacin control con Saccharomyces cerevisiae en caldo YGC 20 g/L de glucosa

AZCARES REDUCTORES BIOMASA pH
HORA
g/L Desv. estndar Coef. variacin g/L Desv. estndar Coef. variacin Promedio Desv. estndar Coef. variacin
0 18,850 0,09 0,48 0,201 0,01 7,32 6,38 0,19 2,95
2 17,559 0,09 0,51 0,460 0,06 11,95 6,03 0,14 2,36
4 15,727 0,06 0,38 1,868 0,04 1,94 5,565 0,10 1,88
6 11,323 0,61 5,39 3,068 0,23 7,40 5,24 0,07 1,28
8 2,411 0,04 1,66 5,541 0,05 0,97 5,12 0,04 0,71
10 2,487 0,05 2,01 6,205 0,08 1,20 4,99 0,01 0,25
12 0,311 0,03 10,51 6,326 0,26 4,15 5,045 0,07 1,47
14 0,269 0,04 15,92 6,207 0,13 2,00 5,095 0,09 1,81
16 0,258 0,02 8,22 6,277 0,01 0,09 5,125 0,02 0,41


74

TABLA 2. Fermentacin control con Saccharomyces cerevisiae en caldo YGC 2 g/L de glucosa

HORA
0 2,124 0,18 8,56 0,174 0,01 7,28 6,26 0,17 2,71
2 1,667 0,33 19,57 0,409 0,09 23,06 6,12 0,10 1,70
4 1,141 0,42 36,76 1,405 0,24 17,15 5,75 0,03 0,59
6 0,349 0,11 30,31 2,729 0,32 11,54 5,75 0,23 4,00
8 0,184 0,01 7,55 2,445 0,07 2,73 5,89 0,19 3,17
10 0,172 0,02 13,37 2,412 0,10 4,19 5,98 0,18 3,09
12 0,15 0,03 17,29 2,434 0,12 5,08 6,02 0,26 4,24
14 0,148 0,03 17,63 2,443 0,25 10,13 6,13 0,20 3,26
16 0,124 0,00 0,00 2,404 0,01 0,56 6,08 0,22 3,61

75
ANEXO H.

Fermentacin discontinua del sustrato fermentable con Saccharomyces cerevisiae

TABLA 1. Fermentacin con Saccharomyces cerevisiae en caldo SF

HORA
0 2,738 0,06 2,25 0,194 0,010 4,91 6,38 0,04 0,65
2 2,650 0,01 0,38 0,185 0,012 6,49 6,38 0,01 0,16
4 2,590 0,02 0,77 0,210 0,016 7,62 6,37 0,02 0,31
6 1,605 0,03 1,87 1,340 0,014 1,01 6,36 0,04 0,64
10 1,224 0,02 1,63 1,986 0,020 1,02 6,29 0,03 0,51
12 1,091 0,04 3,72 2,594 0,014 0,52 6,37 0,04 0,57
14 0,888 0,02 2,21 2,545 0,006 0,24 6,43 0,03 0,39
18 0,871 0,03 2,99 2,531 0,004 0,14 6,53 0,07 1,13
20 0,861 0,08 8,87 2,526 0,008 0,31 6,57 0,06 0,95
22 0,816 0,02 3,03 2,529 0,002 0,09 6,59 0,06 0,92
24 0,797 0,001 0,13 2,487 0,006 0,25 6,60 0,09 1,39
26 0,725 0,01 1,70 2,449 0,004 0,16 6,69 0,11 1,70
28 0,686 0,001 0,17 2,400 0,008 0,33 6,73 0,10 1,43
30 0,674 0,01 1,69 2,367 0,015 0,63 6,76 0,09 1,29
32 0,667 0,01 1,80 2,228 0,006 0,27 6,80 0,12 1,71

76
ANEXO I.

Caracterizacin de composicin nutricional del sustrato fermentable (SF)

PARMETRO RESULTADO UNIDADES MTODO ANALTICO
Carbono Orgnico Oxidable 4,00 g/L WALKLEY-BLACK (NTC 5167)

Nitrgeno total (NT) 0,87 g/L MICRO-KJELDHAL (NTC 5167)
Fsforo total (P
2
O
5
) 0,41 g/L COLORIMTRICO (NTC 5167)
Potasio total (K
2
O) 1,93 g/L ABS. ATMICA (NTC 5167)
Calcio total (CaO) 0,07 g/L ABS. ATMICA (NTC 5167)
Magnesio total (MgO) 0,05 g/L ABS. ATMICA (NTC 5167)
Azufre total 34 p.p.m. TURBIDIMTRICO (NTC 5167)
Hierro total 2,6 p.p.m. ABS. ATMICA (NTC 5167)
Manganeso total 1,4 p.p.m. ABS. ATMICA (NTC 5167)
Cobre total 0,21 p.p.m. ABS. ATMICA (NTC 5167)
Zinc total 1,6 p.p.m. ABS. ATMICA (NTC 5167)
Boro total 7,0 p.p.m. COLORIMTRICO (NTC 5167)
Sodio total 225 p.p.m. EMISIN LLAMA (NTC 5167)

77
ANEXO J
Cromatografa lquida HPLC
J1. Fermentacin control con S. cerevisiae en caldo YGC con 20 g/L de
glucosa hora 10 (Repeticin 1)

78
Fermentacin control con S. cerevisiae en caldo YGC con 20 g/L de glucosa
hora 10 (Repeticin 2)

79
J2. Fermentacin control con S. cerevisiae en caldo YGC con 2 g/L de
glucosa hora 6

80
Fermentacin control con S. cerevisiae en caldo YGC con 2g/L de glucosa
hora 10

81
J3. Fermentacin con S. cerevisiae en SF hora 10 (Repeticin 1)

82
Fermentacin con S. cerevisiae en SF hora 10 (Repeticin 2)

83
Fermentacin con S. cerevisiae en SF hora 10 (Repeticin 3)

84
Fermentacin con S. cerevisiae en SF hora 18

85

86
Fermentacin con S. cerevisiae en SF hora 24 (repeticin 1)

87

88

89

90
J4. Sustrato fermentable

91
ANEXO K

ANLISIS ESTADSTICO

Tabla 1. Estadstica de prueba distribucin t student
SF CONTROL 2 g/L Prueba t para dos muestras suponiendo
varianzas desiguales Biomasa g/L Biomasa g/L
Media 2.167394383 1.872671958
Varianza 0.467267849 0.940370635
Observaciones 13 9
Diferencia hipottica de las medias 0
Grados de libertad 13
Estadstico t 0.786473886
P(T<=t) dos colas 0.445690435
Valor crtico de t (dos colas) 2.160368652

Hiptesis general:

La concentracin celular de Saccharomyces cerevisiae en el caldo sustrato
fermentable no difiere de la concentracin celular en el caldo YGC con 2 g/L de
glucosa (control).

H
0
:
1
-
2
= 0

H
i
:
1
-
2
0
EVALUACIN DE UN SUSTRATO VEGETAL OBTENIDO A PARTIR DE RESIDUOS
VEGETALES DE CRISANTEMO (Dendranthema grandiflora) CON UN CONSORCIO
CELULOLTICO

J. Buitrago, D. Tenjo, B. Quevedo, A. Matiz.
Facultad de Ciencias, Departamento de Microbiologa
Pontificia Universidad Javeriana, Cra. 7 No. 40 62, Bogot, Colombia
bquevedo@javeriana.edu.co

RESUMEN

En este trabajo se plante una alternativa de manejo de residuos vegetales de crisantemo
(Dendranthema grandiflora), mediante la transformacin de este material celulsico en azcares
fermentables, por pretratamiento biolgico con un consorcio celuloltico en cultivo discontinuo, y
de esta manera obtener un sustrato fermentable (SF) rico en nutrientes y azcares reductores que
permitan el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae y la produccin de etanol. Se evaluaron
diferentes variables para obtener el mejor sustrato fermentable con el consorcio celuloltico: la
concentracin del residuo vegetal al 5% (p/v), 10% (p/v) y 12% (p/v), pretratamientos qumicos y
suplemento con sales, extracto de levadura y peptona. Se determin que la actividad enzimtica fue
mejor en la fermentacin con el residuo al 10% (p/v) sin tratamiento y sin suplemento al obtenerse
un SF con 2.5 g/L de azcares reductores. El SF obtenido demostr ser un medio nutritivo y
econmico que favorece la produccin de biomasa de Saccharomyces cerevisiae, pero no favorece
la produccin de etanol por la mnima concentracin de azcares liberados.

Palabras claves: Consorcio celuloltico, crisantemo, etanol, residuos vegetales, Saccharomyces
cerevisiae

ABSTRACT
This work proposes a management alternative of the vegetable waste of chrysanthemum
(Dendranthema grandiflora) that consists in the conversion of this cellulosic substrate to
fermentable sugars through the biological pretreatment with a microbial consortium and thus
obtains a fermentable substrate (SF) rich in nutrients and reductor sugars that allow the growing of
Saccharomyces cerevisiae and the production of ethanol. Different variables were examined to
obtain the best fermentable substrate with the microbial consortium: the concentration of the
vegetable waste to 5% (w/v), 10% (w/v) and 12% (w/v), chemical pretreatment and supplement
with salts, extract of yeast and peptone. It was found a better enzimatic activity with the vegetable
waste 10% (w/v) without treatment and without supplement obtaining a fermentable substrate with
2.5 g/L of reductor sugars. The fermentable substrate proved to be a nutritious and economic that
favors the production of biomass of Saccharomyces cerevisiae, but one determined that it does not
favor the ethanol production by the minimum concentration of sugar presents.

Keywords: celulolytic consortium, chrysanthemum, ethanol, Saccharomyces cerevisiae, vegetable
waste.

J. Buitrago, D. Tenjo, B. Quevedo, A. Matiz

INTRODUCCIN
Aproximadamente, el 90% de los residuos slidos generados en floricultura corresponden a
residuos vegetales, los cuales ofrecen tanto una amenaza al ambiente, como una alternativa de uso
biotecnolgico segn la disposicin final de los mismos. Actualmente, la oportunidad consiste en
aprovecharlos en compostaje y reincorporarlos al proceso productivo como fuente de nutrientes
(Asocolflores, 2000).

La actual administracin colombiana ha iniciado algunas acciones tendientes a identificar y
promover alternativas de produccin de biocombustibles (como el etanol), de forrajes y alimento
para animales a partir de distintas fuentes, pues la actividad del sector agropecuario nacional es
generadora, actual o potencial de: jugo de caa de azcar, paja de cereales, maz, papa,
remolacha, melaza, yuca, y residuos vegetales como los que provienen de los cultivos de flores,
producto del manejo y ciclo vital de las plantas que actualmente son aprovechados en compostaje
y reincorporados al proceso productivo como fuente de nutrientes y acondicionador de suelos,
adems pueden servir como fuente de carbono de los microorganismos en el proceso de
fermentacin de los azcares que los componen. Esto promete doble beneficio para el ambiente:
primero una alternativa de manejo de residuos vegetales y subproductos agroindustriales que
actualmente son utilizados en compostaje o incinerados (generando gases txicos), y sus tres
componentes: celulosa, hemicelulosa y lignina. Segundo, la posible utilizacin en la obtencin de
etanol u otros combustibles.

Teniendo en cuenta lo anterior, el objetivo de este trabajo fue la obtencin de un sustrato
fermentable a partir de la conversin del residuo vegetal de Crisantemo (Dendranthema
grandiflora), por pretratamiento biolgico con microorganismos celulolticos y su evaluacin con
clulas libres de Saccharomyces cerevisiae, como una alternativa para la produccin de etanol,
para lograr obtener un sustrato rico en azcares fermentables u otros nutrientes que permitan el
crecimiento en cultivo discontinuo, contribuyendo con el desarrollo biotecnolgico a nivel
industrial.

MATERIALES Y MTODOS
Microorganismos
Se utiliz un consorcio microbiano celuloltico (Bacillus sp. y Streptomyces sp) de origen vegetal
y suelo, para el pretratamiento del residuo vegetal (Gaitn, et al., 2006). Como microorganismo
control para la evaluacin del sustrato fermentable se utiliz la levadura Saccharomyces

cerevisiae (Muoz y Poutou, 1999), microorganismos tomados del banco de cepas del
Laboratorio de Biotecnologa Aplicada de la Universidad Javeriana.

Obtencin del sustrato fermentable
Residuo Vegetal
Se utilizaron residuos de crisantemo (Dendranthema grandiflora) provenientes de un cultivo
localizado al norte del municipio de Tocancip. Estos fueron sometidos a una caracterizacin
fsico-qumica en un laboratorio certificado por el ICA (Instituto colombiano Agropecuario).

Lavado con SDS ( Sodio Dodecil Sulfato)
Se redujo de tamao el residuo vegetal realizando molienda, se lavaron con SDS (Sodio Dodecil
Sulfato) al 1% (p/v) para posteriormente ser sometidos a ebullicin por un periodo de una hora en
SDS al 1% (p/v) y se realizaron lavados con agua destilada. Luego fueron secados a 55C y por
ltimo, se someti a un proceso de esterilizacin (Guevara y Zambrano, 2006).

Pretratamiento qumico con perxido de hidrgeno (delignificacin oxidativa)
En una solucin alcalina de perxido de hidrgeno al 2% se suspendi el residuo vegetal molido
y pretratado con SDS en una relacin 10:1 respectivamente, esta mezcla fue llevada a un bao
termostatado durante 12 horas a 50C. Luego se filtr y lav con agua destilada. Por ltimo se
someti a un proceso de secado en horno de conveccin a 90C por 12 horas (Sun, et al., 2000).
Adicionalmente, como control, se estudi el residuo molido y sin ningn tratamiento.

Pretratamiento biolgico

Fermentacin discontinua del residuo vegetal por parte del consorcio celuloltico
Se llevaron a cabo tres fermentaciones con concentraciones de 5% (p/v), 10% (p/v) y 12% (p/v)
de residuo vegetal por triplicado; para evaluar en cual se obtena la mayor concentracin de
azcares reductores.
Preparacin del inculo
Las cepas de los microorganismos celulolticos fueron cultivadas en agar celulosa al 1% (p/v),
cuya composicin en g/L es: carboximetilcelulosa 10, extracto de levadura 2.5, peptona universal
2.5, sulfato de amonio 0.5, cloruro de calcio 0.5, fosfato monobsico de potasio 0.1, fosfato
dibsico de potasio 0.1, agar 15, pH final 7.0 +/- 0.2, bajo condiciones controladas de 35C por

48 horas. Posteriormente, se realiz un raspado de las colonias para preparar una suspensin en
solucin salina 0.85%(p/v), a una concentracin de 10
8
clulas/ml.
En un erlenmeyer de 500mL con 90mL de caldo celulosa, fueron adicionados los 10ml de
preinculo y se cultivaron a 130 rpm, 35C por 24 horas.

Fermentacin discontinua
Se adicionaron 900mL de caldo residuo vegetal suplementado (SVS) estril a la concentracin
correspondiente (5%(p/v), 10%(p/v) 12%(p/v)) cuya composicin en g/L fue: residuo vegetal a
las diferentes concentraciones, extracto de levadura 2.5, peptona universal 2.5, sulfato de amonio
0.5, cloruro de calcio 0.5, fosfato monobsico de potasio 0.1, fosfato dibsico de potasio 0.1,
(Caldo SVS) a un erlenmeyer de 2 litros; posteriormente se agreg el 10% de inculo (100mL), y
se controlaron las condiciones de operacin: temperatura 35C por 24 horas y agitacin de 130
rpm. Adicionalmente, se realizaron cultivos con la concentracin de residuo vegetal 10% (p/v) y
12% (p/v) sin la adicin de los dems componentes (sales, peptona y extracto de levadura) (Caldo
SV). Se realizaron muestreos cada 2 horas hasta completar 24 horas, evaluando la produccin de
azcares reductores mediante la tcnica de DNS (Miller, 1959), pH y actividad enzimtica
(Guevara y Zambrano, 2006; Sun y Cheng, 2002).

Al finalizar el proceso de fermentacin se obtuvo el extracto crudo o sustrato fermentable (SF),
mediante un proceso de centrifugacin y filtracin, con el fin de eliminar la poblacin celular.

Determinacin de actividad celuloltica cuantitativa

Esta tcnica se realiz evaluando dos condiciones de pH (5 y 7) y temperatura diferentes (37 y
50C) reportadas por literatura. Para la interpretacin de los resultados, una unidad celuloltica
(UC) equivale a la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar una micromol de glucosa por
minuto, bajo las condiciones de ensayo.

Se tom un volumen de 1mL de sobrenadante correspondiente a cada hora de muestreo y se
adicion 1mL de solucin de carboximetilcelulosa 1% (p/v) disuelta en buffer fosfato 0.1M pH 7
+/- 0.2 y en buffer cido ctrico 0.1M pH 5. La mezcla final se incub en bao termostatado a
37C y 50C, respectivamente, durante 1 hora. Finalizado el tiempo de incubacin de cada
muestra se fren la reaccin refrigerando a 4C durante 5 minutos (Guevara y Zambrano, 2006;
Sun y Cheng, 2002; Palmarola, et al., 2005). Posteriormente se centrifug cada muestra por 10

minutos a 5000 rpm. A partir del sobrenadante se determin la concentracin de azcares
reductores por la tcnica de DNS (Miller, 1959).

Evaluacin del Sustrato fermentable con Saccharomyces cerevisiae

A partir de las concentraciones de residuo vegetal evaluadas se seleccion el sustrato fermentable
que aport mayor concentracin de azcares reductores para la fermentacin con S. cerevisiae.
Como control de la cepa se realizaron fermentaciones en caldo YGC cuya composicin es en g/L:
extracto de levadura 5, D-glucosa 20 y cloramfenicol 0.1, pH final 6.6 (Merck, 2000), y se llev a
cabo la modificacin de este medio de cultivo al utilizar 2g/L de glucosa para comparar con el
sustrato fermentable.

Preparacin del inculo
La cepa de S. cerevisiae fue cultivada en agar YGC cuya composicin es en g/L: extracto de
levadura 5, D-glucosa 20, cloramfenicol 0.1 y agar-agar 14.9, pH final 6.6 (Merck, 2000), bajo
condiciones controladas de 30C por 12 horas. Posteriormente, se realiz un raspado de las
colonias de la levadura para preparar una suspensin en solucin salina 0.85%(p/v), con una
absorbancia de 0.8 a 620nm.

En un erlenmeyer de 500mL con 135mL de caldo YGC, fueron adicionados los 15ml de
preinculo y se cultivaron a 120rpm, 30C por 12 horas.

Fermentacin discontinua
Se adicionaron 1350mL del respectivo caldo (YGC, YGC modificado y SF) estril a un
erlenmeyer de 2 litros; posteriormente se agreg el 10% de inculo, y se controlaron las
condiciones de operacin: temperatura 30C por 16 horas para cultivo con YGC y 32 horas para
el SF con agitacin de 70rpm, tomando muestras cada dos horas. A estas muestras se les
determin la concentracin de biomasa por el mtodo de peso seco (Godoy, 2002), de azcares
reductores mediante la tcnica de DNS (Miller, 1959) y de etanol por cromatografa lquida
(HPLC).

Determinacin de etanol
El contenido de etanol se analiz por cromatografa lquida de alto desempeo HPLC, en un
cromatgrafo WATERS, con detector de indice de refraccin (Waters Corporation, Milford,

MA). La fase mvil fue agua con un flujo de 0.5mL/min, y se empleo una columna Sugar Pak I
con precolumna KC-G (Waters Corporation, Milford, MA). La temperatura de la columna fue
84C. Para el anlisis de los resultados se us el programa Millenium V 2.15.01. Para la
determinacin de los factores de respuesta se utilizar glucosa grado cromatogrfico (Sigma-
Aldrich, St. Louis, MO), y etanol anhidro grado analtico Merck (Darmastadt, Alemania).

Anlisis estadstico
Para el anlisis estadstico de los datos obtenidos se utiliz el programa SPSS versin 14 en el
cual se determinaron las medias (nivel de confianza 95%), la desviacin estndar, el coeficiente
de variacin y la estadstica de prueba de la distribucin t student para comparar la concentracin
de azcares liberados con el residuo vegetal al 10% (p/v) y 12%(p/v). Y comparar la
concentracin celular de S. cerevisiae tanto en el control de 2 g/L de glucosa y en el SF (Daniel,
2002).

RESULTADOS Y DISCUSIN

Obtencin del sustrato fermentable

Se evaluaron diferentes pretratamientos para determinar cual permita obtener mayor
concentracin de azcares reductores, al facilitar la hidrlisis enzimtica de la celulosa por parte
del consorcio celuloltico.

Con el residuo vegetal molido tratado con y sin SDS; se realiz una fermentacin de 22 horas,
obteniendo como resultado que la mayor cantidad de azcares reductores liberados se present en
el residuo vegetal sin tratamiento con SDS teniendo una concentracin de 2.46 g/L comparado
con 1.44g/L del tratado con SDS a la hora 22.

Al realizar los pretratamientos del residuo al 10% (p/v) con y sin perxido de hidrgeno 2%,
luego de una fermentacin de 22 horas se presentaron valores de concentracin de azcares
reductores de 0.555 g/L y 1.502 g/L, respectivamente (Tabla 1).

Estos resultados reflejaron que el tratamiento con SDS y H
2
O
2
causa una inhibicin enzimtica
en el consorcio celuloltico, esto se debe a que el SDS es un tensoactivo inico y desnaturalizante

de protenas, y al quedar trazas de ste en el residuo impide la degradacin de la celulosa por
parte del complejo enzimtico (Castagnino, 2000), al igual que el perxido de hidrgeno, agente
oxidante usado para remover la lignina y la hemicelulosa presentes en materiales
lignocelulsicos. Segn la caracterizacin fsico qumica del residuo vegetal de Crisantemo, el
porcentaje de lignina es 0.51%, de hemicelulosa 2.03% y celulosa 65.3%, por lo tanto, el
pretratamiento con perxido no sera necesario por la baja proporcin de lignina y hemicelulosa

Se determin que era suficiente la reduccin de tamao del material para obtener mayor
concentracin de azcares reductores y de actividad enzimtica, pues algunos factores que
afectan la hidrlisis de la celulosa son el contenido de lignina y hemicelulosa, la porosidad de la
materia prima (rea superficial accesible) y cristalinidad de la celulosa, la cual se reduce con la
molienda.

Tabla 1. Fermentacin con el consorcio celuloltico en residuo vegetal al 10% sin suplemento
tratado con SDS y perxido de hidrgeno. (Temperatura 50C por 12 horas).
ND = No se determino Fuente:
Autores
a
Una unidad celuloltica equivale a la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar una micromol
de glucosa por minuto, bajo las condiciones de ensayo.

Fermentacin discontinua del residuo vegetal con el consorcio celuloltico
Se evaluaron diferentes variables: concentracin 5% (p/v), 10% (p/v) y 12% (p/v) de residuo
vegetal fresco y suplemento con: sales, extracto de levadura y peptona (SVS), que podran tener
algn efecto sobre la degradacin de este polmero y por ende, en la concentracin de azcares
reductores liberados en el extracto crudo al finalizar la fermentacin con el consorcio celuloltico
(Bacillus sp. y Streptomyces sp.), los resultados se muestran en la tabla 2.
CALDO SV 10% (p/v)
CON SDS
CALDO SV 10% (p/v)
CON H2O2 Y SIN SDS
CALDO SV 10% (p/v)SIN
H
2
O
2
Y SIN SDS
(control)
CALDO SV 10% (p/v)
CON H 2O2 Y CON SDS
AZCAR
REDUC.
ACT. ENZ
pH 7 37C
AZCAR
REDUC.
ACT. ENZ
pH 7 37C
AZCAR
REDUC.
ACT. ENZ
pH 7 37C
AZCAR
REDUC.
ACT. ENZ
pH 7 37C
H
O
R
A

g/L
a
UC/L g/L UC/L g/L UC/L g/L UC/L
0 0,595 0,0 0,471 0,0 1,350 0,0 0,835 0
12 0,926 23,1 0,484 15,0 1,840 52,1 ND ND
22 0,749 23,9 0,555 17,4 1,502 40,0 0,871 4,07

TABLA 2. Fermentacin con el consorcio celuloltico en residuo vegetal 5% (p/v), 10% (p/v) y
12% (p/v) suplementado y sin tratamiento
ND= No se determin
Fuente: Autores

Las concentraciones del 10% y 12% (p/v) mostraron los valores ms altos de azcares reductores
en la hora 12 de fermentacin, evidenciando mejor expresin de la actividad enzimtica. Al
evaluar la concentracin de residuo al 5% (p/v) se presentaron valores muy bajos, por tal razn,
no se realizaron ms experimentos con esta concentracin.

Es importante analizar la concentracin de sustrato; ya que es uno de los principales factores que
afectan la produccin y la velocidad inicial de la hidrlisis enzimtica de la celulosa. Un
incremento de la concentracin de sustrato normalmente resulta en un aumento de la produccin
y de la velocidad de reaccin de la hidrlisis. Sin embargo, altas concentraciones de sustrato
pueden causar inhibicin enzimtica, lo cual disminuye sustancialmente la velocidad de la
hidrlisis (Romano, et al., 2005; Sun y Cheng, 2002).

Se evalu la concentracin de residuo vegetal fresco al 10% (p/v) y 12%(p/v) sin suplemento,
para determinar si la composicin del residuo (tabla 3) puede ser favorable para el crecimiento
del consorcio celuloltico. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

Este resultado se present gracias a la composicin del residuo vegetal, el cual posee 5.01% de
protenas como fuente de nitrgeno, adems de minerales, fsforo, azufre, macroelementos y
microelementos que proporcionan un medio nutritivo para el crecimiento del consorcio
celuloltico.
Residuo vegetal 5% Residuo vegetal 10% Residuo vegetal 12%
Azcares
reductores
Act enzimtica
37 pH 7
Azcares
reductores
Act enzimtica
37 pH 7
Azcares
reductores
Act enzimtica
37 pH 7

HORA
g/L UC/L g/L UC/L g/L UC/L
0 0,378 0 1,08 ND 1,47 ND
6 0,435 11,85 1,42 54,4 1,53 51,56
12 0,352 30,27 1,63 55,7 2,15 79,73
14 ND ND 1,59 56,2 1,91 82,79
16 0,589 17,80 1,19 52,5 1,89 76,24
18 0,849 35,70 1,03 32,7 1,60 58,54
20 0,423 35,00 1,05 35,1 1,78 54,22
22 0,419 25,50 1,14 37,9 1,60 56,04

De acuerdo al anlisis de medias y la desviacin estndar, los datos no presentaron una amplia
dispersin, por lo tanto, se determin que la mayor concentracin de azcares reductores
liberados estaba entre el residuo vegetal al 10% (p/v) y 12% (p/v) sin tratamiento y sin
suplemento (Tabla 4), se decidi obtener el sustrato fermentable con el residuo de crisantemo al
10% (p/v); ya que no se encontr gran diferencia con el 12%(p/v), mostrando 2.1g/L y 2.2g/L de
azcares reductores, respectivamente. Por lo tanto, se llevo a cabo la estadstica de prueba con la
distribucin t student, concluyendo que no existe suficiente evidencia estadstica para rechazar la
hiptesis nula (Ho). Por consiguiente, se afirma que no existe evidencia estadsticamente
significativa en la concentracin de azcares reductores liberados tanto en el SV 10%(p/v) como
en el SV 12%(p/v). Tambin se determin que el tiempo de la fermentacin para la obtencin del
sustrato fermentable fuera de 12 horas al encontrar que la diferencia con la hora 22 no era
relevante para prolongar 10 horas ms el proceso.

Los resultados obtenidos mostraron en general, que la actividad enzimtica es mayor en
condiciones de pH 7 y 37C, evidenciando que la expresin de las enzimas es mejor a pH neutro y
a una temperatura que no exceda los 40C, por ser microorganismos mesfilos (Tabla 4) (Lynd, et
al., 2002).

TABLA 3. Caracterizacin fsico-qumica del Residuo Vegetal de Crisantemo
CARACTERIZACIN DE LA FRACCIN ORGNICA (89.2 %)
Protena 5,01 %
Celulosa 65,3 %
Hemicelulosa 2,03 %
Carbohidratos no estructurales 16,6 %
Lignina 0,51 %
FRACCIN ORGNICA (89.2%)
Grasa 0,31 %
Fibra Cruda 46,4 %
Protena 5,01 %
NUTRIENTES
Fsforo (P
2
O
5
) 0,27 %
Calcio (CaO) 0,69 %
Slice (SiO
2
) 0,55 %
FUENTE: LABORATORIO AGRILAB


TABLA 4. Fermentacin con el consorcio celuloltico en residuo vegetal 10% (p/v) y 12% (p/v)
suplemento y sin tratamiento
ND= No se determin
Fuente: Autores

Evaluacin del sustrato fermentable con Saccharomyces cerevisiae

Fermentacin discontinua control caldo YGC 20 g/L de glucosa.
En esta fermentacin no se present una fase de adaptacin, se observ una fase exponencial
desde la hora 0 hasta la hora 12 con una concentracin de biomasa de 6.326 g/L, en esta hora del
proceso la concentracin de glucosa disminuy hasta 0.311 g/L, y luego empez la fase
estacionaria, esto mostr un crecimiento rpido de la levadura relacionado con el consumo de
sustrato (Figura 1).

Al principio de la fermentacin el valor de pH fue de 6.38, al transcurrir el proceso el pH
disminuy hasta llegar a 5 en la hora 10, lo que tuvo relacin con la cada de la concentracin de
la fuente de carbono; esto indica que el consumo de la glucosa acidific el medio (Navarro y
Sossa, 2003).

Al determinar el etanol por HPLC, a la hora 10 de fermentacin se obtuvo una concentracin de
9.333 g/L. Este resultado evidenci que la cepa de S.cerevisiae utilizada si produjo etanol bajo las
condiciones de fermentacin planteadas. Ya que, la concentracin de oxgeno fue baja, por la
mnima agitacin (70 rpm) y el volumen utilizado, aunque no se proporcionaron totalmente las
condiciones de anaerobiosis para produccin de etanol. Sin embargo por el metabolismo de la
levadura en medios ricos en azcar en presencia de aire se pasa espontneamente al proceso
anaerbico porque el consumo de oxgeno es muy alto, por lo que se agota rpidamente (Carballo
2000; Otterstedt, et al., 2004).
RESIDUO VEGETAL 10% (p/v) RESIDUO VEGETAL 12% (p/v)
Azcares
reductores
Act enzimtica
37 pH 7
Act enzimtica
50 pH 5
Azcares
reductores
Act enzimtica
37 pH 7
Act enzimtica
50 pH 5

Hora
g/L UC/L UC/L g/L UC/L UC/L
0 1,53 ND ND 1,77 ND ND
6 1,61 59,7 46,5 1,84 77 50,91
12 2,1 80,8 55,7 1,95 85,1 55,39
14 2,08 97,6 72,5 2,25 104,9 68,09
16 2,01 83,9 54,0 2,23 92 61,26
18 1,93 80,2 60,2 2,09 94,9 68,48
20 1,74 65,1 48,3 1,93 73,4 48,33
22 2,47 98,4 78,1 2,32 105,2 82,88

Fermentacin discontinua control caldo YGC 2 g/L de glucosa.
En esta fermentacin Saccharomyces cerevisiae no present fase de adaptacin, la fase
exponencial fue hasta la hora 6 con una concentracin celular de 2.7g/L y de glucosa 0.35g/L, a
partir de la hora 8 empez la fase estacionaria y la concentracin de la fuente de carbono se
mantuvo estable (Figura 2).

El pH disminuy de 6.3 a 5.75 a la hora 4, mientras en la fase estacionaria el pH tuvo un
aumento leve por la liberacin de aminocidos al consumirse el extracto de levadura.

Al cuantificar el etanol por cromatografa lquida (HPLC) se obtuvo una concentracin de etanol
de 2.805 g/L en la hora 10 de fermentacin. Este resultado evidenci que con 2g/L de glucosa S.
cerevisiae puede producir etanol.
0
1
2
3
4
5
6
7
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
TIEMPO (h)
B
I
O
M
A
S
A

(
g
/
L
)

-

p
H
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
A
Z
C
A
R
E
S

R
E
D
U
C
T
O
R
E
S

(
g
/
L
)
BIOMASA g/L pH AZCARES REDUCTORES g/L
Figura 1. Fermentacin control en caldo
YGC 20g/L de glucosa.
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
0 5 10 15 20
TIEMPO (h)
B
I
O
M
A
S
A

(
g
/
L
)

-

p
H
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
A
Z
C
A
R
E
S

R
E
D
U
C
T
O
R
E
S

(
g
/
L
)
BIOMASA g/L pH AZCARES REDUCTORES g/L
Figura 2. Fermentacin control en caldo
YGC con 2 g/L de glucosa.

Fermentacin discontinua del sustrato fermentable (SF) con Saccharomyces cerevisiae
El sustrato fermentable con una concentracin de 2.547 g/L de azcares reductores se obtuvo al
realizar la fermentacin de 12 horas con el consorcio celultico en el residuo vegetal de crisantemo
al 10% (p/v) sin pretratamiento ni suplemento.

La fermentacin en el SF se realiz de 32 horas. La levadura present una fase de adaptacin de 4
horas y la exponencial hasta la hora 12 con una concentracin de biomasa de 2.5g/L, 1.1g/L de
azcares reductores; desde de la hora 14 se observ la fase estacionaria hasta la hora 28 en la cual,

la biomasa disminuy entrando a la fase de muerte. El consumo de azcares reductores fue rpido
hasta la hora 14, terminando la fermentacin con una concentracin de 0.667 g/L (Figura 3), estos
posiblemente pueden ser azcares reductores no asimilables por S. cerevisiae como la celobiosa,
que es producto de la hidrlisis de la celulosa del residuo vegetal de crisantemo.

Al analizar los datos de cromatografa lquida (HPLC) se obtuvo una concentracin de etanol de
3.5 g/L en la hora 10 de fermentacin y 3.8 g/L en la hora 22 (Figura 3 y 4).
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
TIEMPO (h)
B
I
O
M
A
S
A

g
/
L
0.0
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A
Z
C
A
R
E
S

R
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D
U
T
O
R
E
S

E
T
A
N
O
L

(
g
/
L
)
BIOMASA g/L ETANOL g/L AZCARES REDUCTORES g/L

Figura 3. Fermentacin en SF con S. cerevisiae

Por otra parte, se determin el tiempo de duplicacin el cual fue de 57 min para el control de 2 g/L
y 46.5 min para el SF, esto evidenci que la levadura tiene un crecimiento ms rpido en el sustrato
fermentable. Segn la caracterizacin de composicin nutricional el SF contiene 0.87g/L de
nitrgeno total, 0.41 g/L de fsforo, 34 ppm de azufre y elementos como calcio, zinc, hierro,
magnesio y manganeso en bajas concentraciones, adems el anlisis cromatogrfico mostr la
presencia de sacarosa, glucosa y fructosa (Figura 5); estas fuentes nutricionales promueven el
crecimiento de la levadura sin necesidad de adicionar otros componentes al sustrato fermentable, ya
que se obtuvo un tiempo de duplicacin menor, una concentracin de biomasa similar que en caldo
YGC (medio sinttico) de la fermentacin control 2 g/L de glucosa.


Figura 4. Fermentacin en SF con S.
cerevisiae hora 10.

Figura 5. Cromatografa liquida SF.

El pH fue aumentando en funcin del tiempo de 6.38 a 6.8, esto evidenci que el crecimiento de S.
cerevisiae puede darse en un rango amplio de pH debido a la capacidad de mantener estable el pH
intracelular entre 5.8 y 6.3 (Tuite y Oliver, 1991). En este estudio se realiz una prueba preeliminar
para determinar si el pH 4.5 favoreca la produccin de etanol por parte de la cepa utilizada; se
concluy que el pH entre 6 y 7 mostr mejores resultados, ya que a pH cido no hubo produccin
de etanol (datos no mostrados).

Para comparar el crecimiento de S. cerevisiae en el control con 2 g/L de glucosa y la fermentacin
del sustrato fermentable se llevo a cabo la estadstica de prueba con la distribucin t student,
concluyendo que no no existe evidencia estadsticamente significativa en la concentracin celular
promedio de S. cerevisiae tanto en el control de 2g/L de glucosa como en el sustrato fermentable
evaluado.

CONCLUSIONES

El residuo vegetal de crisantemo (Dendranthema grandiflora) no requiere pretratamiento qumico
ni suplemento para obtener mayor concentracin de azcares reductores liberados por parte del
consorcio celuloltico.


Se obtuvo un sustrato fermentable a partir de residuo vegetal 10% (p/v) con un consorcio
celuloltico (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) con una concentracin de azcares reductores de
2.5g/L.

El sustrato fermentable obtenido demostr ser un medio nutritivo y econmico que favorece la
produccin de biomasa de S. cerevisiae, al tener fuente de carbono, nitrgeno, sales y elementos
traza; pero esta cepa mostr baja produccin de etanol tanto en caldo YGC como en el SF.

Al comparar la produccin de biomasa de S. cerevisiae entre las fermentaciones control de 20g/L y
2g/L de glucosa y el sustrato fermentable el rendimiento Y
x/s
fue igual en las dos ltimas 1.44 g/g,
mejor que el obtenido con 20g/L.

El sustrato fermentable permiti la obtencin de etanol con una concentracin de 3.8 g/L usando S.
cerevisiae, mayor que la obtenida en el control de 2 g/L de glucosa 2.8 g/L.

El Sustrato fermentable permiti la obtencin de etanol 3.5 g/L, luego de la fermentacin con
Saccharomyces cerevisiae.

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