UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CINCIAS FSICAS E MATEMTICAS DEPARTAMENTO DE QUMICA

SEPARAO POR ELETROFORESE CAPILAR

Ghislane Takashima Karina Mannrich Renata Ransolin

Florianpolis, 29 de junho de 2013

1. INTRODUO A eletroforese um mtodo de separao baseado nas diferenas de velocidade segundo as quais as espcies com carga migram em um campo eltrico.

Figura 1. Esquema de eletroforese capilar. A instrumentao para eletroforese capilar consiste em um capilar de slica fundida preenchido com um tampo, geralmente de dimetros interno entre 10 e 100 m e com comprimento de 40 a 100 cm, e estendido entre dois reservatrios de tampo que contem eletrodos de platina aonde so aplicados uma ddp.

Figura 2. Diagrama esquemtico de um sistema de eletroforese capilar. Uma caracterstica particular da eletroforese capilar o fluxo eletro-osmtico. Quando uma alta voltagem aplicada por meio de um capilar de slica fundida contendo uma soluo tampo, um fluxo eletro-osmtico produzido, causando uma migrao do solvente em direo ao catodo devido ionizao da parede do capilar. Como esquematizado na figura 2; a origem do fluxo a dupla camada eltrica que se desenvolve na interface slica/soluo.

Figura 3. Esquema do fluxo eletroosmtico.

Figura 4. Esquema de migrao dos analitos. Os analitos so separados em bandas de acordo com suas mobilidades eletroforticas. A mobilidade eletroforticas a razo entre a velocidade de migrao de um on e o campo eltrico aplicado. No eletroferograma as reas so proporcionais concentrao do analito. A separao eletroforticas realizada de diversas formas denominadas modos. So mostrados alguns exemplos na tabela 1.

Mtodo

Limite de deteco de Massa (Mole) 1012 -- 1015 1015 -- 1017 1018 -- 1020

UV-VIS absoro

Limite de deteco de Conc. (Molar) 105 107 107 109 109 -- 1012

Vantagens/ Desvantagens Universal. Oferece informaes espectrais. Sensvel. Geralmente requerem amostra de derivao. Extremamente Sensvel. Geralmente requerem amostra de derivao de alto custo. Universal. Menor sensibilidade em relao ao mtodo direto.

Fluorescncia

Fluorescncia induzida por laser

Indireto UV - Fluorescncia - Ampermetro

10 -100 vezes ____ menor que o mtodo direto. Tabela 1. Modos de Deteco.

Para um sistema com deteco UV-Vis utiliza-se uma analise direta ou indireta, Na analise direta importante que os componentes do eletrlito no sejam cromforos; no absorva a radiao UV-vis. Exemplos aonde podem ser empregados esse mtodo para a determinao da nicotina no fumo e flavonoides em plantas.

Figura 5. Eletroferograma de uma analise direta. Para a deteco de analitos que no absorvem radiao UV-vis utiliza-se o mtodo indireto, ou seja, nesse caso obrigatrio eletrlito absorver a radiao UV-vis para que ocorra a deteco indireta. Entretanto esse mtodo prejudicado pelo decaimento da sensibilidade em relao ao mtodo direto.

Figura 6. Eletroferograma de uma analise indireta.

O GHB uma droga de abuso conhecida popularmente como Boa-noite Cinderela isso devido aos seus efeitos depressores do SNC. A droga ministrada em gotas juntamente com bebidas alcolica que potencializa seu efeito. O sintoma mais comum a perda da conscincia por at trs dias deixando a vitima vulnervel o suficiente para ser roubada e/ou violentada, alm disso, pode causar intoxicao ou morte por desidratao. O AHB e BHB so ismeros de cadeia do GHB e seus nomes se denominam pelos prefixos grego Alfa, Beta e Gama o qual serve para identificao do carbono com o qual o grupo hidroxila esta ligado. O objetivo deste relatrio atravs do software Peakmaster 5.1 fazer uma simulao de separao eficaz por eletroforese capilar dos ismeros: GHB, AHB, BHB. Os ismeros citados possuem propriedades qumicas e fsicas semelhantes, assim dificultando a separao por mtodos convencionais e por isso necessrio o uso de um mtodo especifico como a eletroforese capilar.

2.

MTODO UTILIZADO

Parmetros para que seja efetuada uma boa separao dos ismeros GHB, BHB e AHB: pH timo: 4,5 (4,166 utilizado) Soluo tamponante: cido benzico (20mmol) e tris (10mmol) Tempo de anlise: 5 minutos Voltagem: 20000 V Fluxo eletro osmtico: negativo Deteco: Indireta ou direta por UV-Vis.

Para efetuar a separao dos ismeros GHB, BHB e AHB, verifica-se a necessidade de estabelecer critrios dos quais sero analisados para efetuar-se uma boa separao dos ismeros. Como critrio verificou-se a mobilidade efetiva de cada um dos ismeros, a partir disso, um pH no qual esse ismeros teriam melhor separao e reagente para manter esse pH. Optou-se pela construo de uma tabela que mostra as mobilidades efetivas de cada ismero em toda a escala de pH. Verifica-se dessa forma, em qual pH os ismeros tem seus valores de mobilidade mais distantes possveis, para que assim seja escolhido um pH ideal para fazer a separao. Pela Tabela 2 foi definido que em pH 4,5 a mobilidade dos trs ismeros tem valores mais distintos, com isso, optou-se por esse pH para que a anlise seja feita. Para manter o pH 4,5 em soluo, verificou-se na tabela de reagentes do programa utilizado para realizar a simulao de separao, o peakmaster 5.1, que o cido benzico possui pKa 4,203, sendo um solvente de uso freqente e de fcil acesso

nos laboratrios, optou-se por ele, juntamente com a base TRIS, que uma base forte, proporciona o efeito de tampo na soluo. O fluxo eletro osmtico que proporciona a melhor separao dos ismeros positivo, dessa forma ao fazermos a simulao de anlise, espera-se verificar que a mesma realiza efetiva separao dos picos de cada ismero, e que estes, de acordo com o tempo so: AHB, BHB e GH, conforme o que era esperado de acordo com a mobilidade efetiva de cada analito.

3. DISCUSSO DOS RESULTADOS Os trs ismeros GHB, BHB e AHB possuem pKa diferentes, o que implica em mobilidades efetivas especficas possibilitando a separao por eletroforese capilar. Para escolha do pH adequado utilizou-se as seguintes relaes, equaes 1 e 2:
[ ]

Equao 1 e 2

Onde f mobilidade efetiva e mobilidade eletrofortica. O pH escolhido foi 4,5 pois resulta numa maior diferena entre as mobilidades efetivas do GHB e BHB. Isso porque, como mostrado no grfico 1, a mobilidade efetiva de GHB e BHB so muito prximas, enquanto que a do AHB mais diferenciada. Os dados e os resultados dos clculos so mostrados nas Tabelas 2, 3.

Mobilidade efetiva vs pH
0

-5

10

15

Mobilidade Efetiva

-10 -15 GHB BHB

-20
-25 -30

AHB

-35
-40

pH

Grfico 1: Comparao da variao da mobilidade efetiva de GHB, BHB e AHB diante da mudana de pH. pKa GHB BHB AHB
4,721 4,519 3,979

Ka
1,90x10
-5

-34,300 -34,300 -34,300

3,03 x10-5 1,05 x10

-4

Tabela 2. Dados

pH

[H+]

GHB
-1

BHB

AHB

fGHB

fBHB

fAHB

|fGHB-fBHB|

1,0 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 10,5 11 11,5 12 13 14

1,00x10

0,000190 0,000601 0,001897 0,005976 0,018656 0,056708 0,159740 0,375458 0,655301 0,857382 0,950027 0,983638 0,994767 0,998339 0,999474 0,999834 0,999947 0,999983 0,999995 0,999998 0,999999 1 1 1 1

0,000303 0,000956 0,003018 0,009481 0,029380 0,087358 0,232358 0,489064 0,751671 0,905410 0,968020 0,989661 0,996707 0,998956 0,999670 0,999896 0,999967 0,999990 0,999997 0,999999 1 1 1 1 1

0,001048 0,003308 0,010386 0,032123 0,094985 0,249190 0,512086 0,768462 0,913009 0,970751 0,990562 0,996996 0,999048 0,999699 0,999905 0,999970 0,999990 0,999997 0,999999 1 1 1 1 1 1

-0,00652 -0,02061 -0,06508 -0,20497 -0,63990 -1,94509 -5,47908 -12,8782 -22,4768 -29,4082 -32,5859 -33,7388 -34,1205 -34,2430 -34,2820 -34,2943 -34,2982 -34,2994 -34,2998 -34,2999 -34,3 -34,3 -34,3 -34,3 -34,3

-0,01038 -0,03280 -0,10351 -0,32520 -1,00773 -2,99637 -7,96989 -16,7749 -25,7823 -31,0556 -33,2031 -33,9454 -34,1871 -34,2642 -34,2887 -34,2964 -34,2989 -34,2996 -34,2999 -34,3 -34,3 -34,3 -34,3 -34,3 -34,3

-0,03596 -0,11346 -0,35625 -1,10183 -3,25799 -8,54721 -17,5646 -26,3582 -31,3162 -33,2968 -33,9763 -34,197 -34,2674 -34,2897 -34,2967 -34,2990 -34,2997 -34,2999 -34,3 -34,3 -34,3 -34,3 -34,3 -34,3 -34,3

3,8 x10-3 1,2 x10-2 3,8 x10-2 1,2 x10-1 3,6x10-1 1,1 2,5 3,9 3,3 1,6 6,2x10-1 2,1x10-1 6,6x10-2 2,1x10-2 6,7x10-3 2,1x10-3 6,7x10-4 2,1x10-4 6,7x10-5 2,1x10-5 6,7x10-6 2,1x10-9 6,7x10-7 6,7x10-8 6,7x10-9

3,16x10-2 1,00x10-2 3,16x10-3 1,00x10-3 3,16x10-4 1,00x10 1,00x10 3,16x10 1,00x10

-4

3,16x10-5
-5 -6 -6

3,16x10-7 1,00x10-7 3,16x10-8 1,00x10-8 3,16x10

-9

1,00x10-9 3,16x10-10 1,00x10-10 3,16x10-11 1,00x10-11 3,16x10-12 1,00x10-12 1,00x10

-13

1,00x10-14

Tabela 3. Resultados dos clculos de mobilidade efetiva. Para obter uma pH prximo de 4,5, utilizou-se 20,00mM de cido benzoico (pKa = 4,203) e 10,00mM de TRIS. O TRIS uma base forte que desprotonar 50% do cido benzoico, fazendo com que a soluo se torne um tampo regulado pelas espcies de cido benzoico (cido) e benzoato (base conjugada). Segundo a equao 3 esta soluo ter pH ~ 4,2.
[ [ ] ]

Equao 3

Devido a outras propriedades, como atividade, fora inica e outras, o pH obtido foi de 4,166. Como as espcies possuem carga negativa utilizamos um fluxo eletro-osmtico negativo, e como esperado os analitos tiveram maior velocidade do que o fluxo, pois alm de serem carregados pelo fluxo eles so atrado pelo ctodo. O comprimento do capilar e a janela de deteco foram escolhidas em aula. E os outros parmetros voltagem e fluxo eletro osmtico foram otimizados e aps teste de vrias opes escolheu-se 20000V e EOF Mark Time, que proporcionaram melhores

resultados. Como as espcies possuem o grupo COO - que cromforo pode-se detectar a sua presena por meio direto ou indireto.

4. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

SKOOG, A. D.; WEST, D. M.; HOLLER, F. J.; CROUCH, S. R. Fundamentos de Qumica Analtica, Traduo da 8 Edio norte-americana, Editora Thomson, So Paulo-SP, 2006. Slide: Aula Eletroforese capilar, Laboratrio de eletroforese capilar - UFSC, Florianpolis-SC, 2013.