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La medicina di laboratorio la disciplina clinica che ricerca dati relativi alla natura e all'entit delle alterazioni di struttura e di funzione,

, su campioni ottenuti dal paziente o sul paziente stesso, con mezzi chimici, fisici e biologici. I dati ottenuti vengono elaborati in informazioni da utilizzare accanto ai sintomi ed ai segni clinici a scopo preventivo, diagnostico, terapeutico, di monitoraggio e riabilitativo

Le indagini di laboratorio vanno prevalentemente effettuate in presenza dei segni e sintomi cardinali di malattia

- le modalit operative del laboratorio; - il ricorso agli esami di laboratorio; - la logica della risposta del laboratorio; - il valore semeiotico delle indagini di laboratorio; - la qualit del dato di laboratorio.

LE MODALIT OPERATIVE DEL LABORATORIO Finalit Le indagini di laboratorio vengono praticate per restringere, in modo progressivo, le ipotesi iniziali formulate dal medico clinico, fino ad una diagnosi ove possibile di certezza; esse costituiscono inoltre un insostituibile supporto al giudizio prognostico e al monitoraggio del decorso e delle terapie instaurate

Modalit Il modo di operare della medicina di laboratorio si differenzia da quello della medicina clinica essenzialmente per questi aspetti: a) II medico di laboratorio conduce le sue indagini prevalentemente su campioni prelevati dal paziente. Il medico clinico ricorre a queste indagini, che sono una estensione dei suoi sensi fisici, per venire in possesso di ulteriori informazioni oltre a quelle che ha ottenuto con la storia clinica e con l'esame fisico del paziente. b) I campioni, le parti cio di liquidi organici o di tessuti ottenute spontaneamente o prelevate dall'uomo, vengono sottoposti a trattamenti e analisi di varia natura: fisici (come ad esempio la centrifugazione), chimici (l'aggiunta di sostanze reagenti), microscopici (sia a fresco che dopo particolari colorazioni), biologici(reazioni sull'animale, immunologiche ecc) c) Le indagini sui campioni solo in rari casi possono essere attuate accanto al letto del malato; comunemente esse vengono praticate nei laboratori clinici, le strutture cio particolarmente attrezzate a tal fine. d) Nei laboratori, accanto al medico operano laureati qualificati dotati di specifiche competenze analitiche di settore, quali chimici, biologi, fisici, statistici e tecnici analisti di laboratorio medico. e) L'esecuzione delle indagini, solo in determinati casi avviene per scelta o su indicazione dei medici che operano nei laboratori; in linea generale sono i medici curanti che richiedono gli esami, specificando il sospetto diagnostico o la presenza di determinati sintomi e segni clinici (in questa fase il medico di laboratorio ricorre agli esami di base ). Un compito molto importante dei medici che operano nei laboratori invece quello di proseguire nell'approfondimento diagnostico (esami di approfondimento). In tali casi, i campioni iniziali possono molto opportunamente essere conservati e quindi utilizzati senza ulteriore impegno del paziente.

Attivit Le attivit della medicina di laboratorio vanno sotto il nome di esami di laboratorio (o analisi o test o ricerche o indagini di laboratorio o cliniche). Un esame di laboratorio pertanto l' applicazione di procedimenti analitici di varia natura, su campioni biologici umani, che si concludono con l'ottenimento di dati, qualitativi o quantitativi , che vengono espressi in un referto . Del referto il medico curante si avvale per completare il suo ragionamento diagnostico e per condurre la terapia (in termini generali, per prendere una decisione). Un esame di laboratorio consiste in una serie ordinata di passaggi: - il primo viene operato da un medico, clinico o di laboratorio, e consiste nella richiesta dell'esame stesso; segue la preparazione del paziente e la raccolta del campione . - Il secondo passaggio attuato dal personale medico e tecnico che opera nei laboratori, comprende la fase preparativa (o preanalitica ), la fase analitica vera e propria e la fase interpretativa (o postanalitica). Quest'ultima fase consiste innanzitutto nel completamento del controllo della buona qualit della misurazione effettuata e poi nella presentazione dei dati ottenuti sotto forma di referto

Natura dei campioni I liquidi ed i tessuti dell'organismo oggetto delle indagini della medicina di laboratorio ( sistema) sono essenzialmente: il sangue (sangue intero, plasma e siero), l 'urina e, in minor misura, il liquido cerebrospinale, il liquido amniotico, il liquido seminale, le feci, l'escreato, i succhi gastrico e duodenale; i frammenti di tessuto prelevati per biopsia sui quali si ricercano numerosi costituenti chimici, soprattutto enzimi; elementi formati del sangue, che con sempre maggiore frequenza vengono utilizzati per determinare le alterazioni della struttura e delle funzioni metaboliche. Tutte le parti di liquidi o di tessuti prelevate od ottenute dal corpo umano da sottoporre ad analisi, si definiscono campioni Costituenti Con il termine costituente si indicano le sostanze chimiche che costituiscono i tessuti dell'organismo, i liquidi circolanti o cavitari e gli escreti che vengono esaminati in laboratorio. Si va dalla determinazione della concentrazione degli ioni idrogeno liberi e della pressione parziale dell'anidride carbonica nel sangue arterioso, alla determinazione dei gas nel sangue intero e nel plasma; si ricercano proteine, lipidi e glucidi; si studiano gli enzimi nella loro attivit catalitica e, come proteine, in concentrazione di massa; gli ormoni gli elementi in tracce, le porfirine, le purine ed i nucleotidi, le vitamine, i farmaci ed i tossici, i cosiddetti marker tumorali, i recettori cellulari ecc.; i costituenti biochimici che pi specificamente sono parte del sistema emopoietico, del sistema emocoagulativo e di quello immunitario.

IL RICORSO AGLI ESAMI DI LABORATORIO II medico ricorre agli esami di laboratorio in un contesto logico costituito dalla storia clinica e dall'esame obiettivo: alle forme dirette cio di intervento sul paziente, vengono ad aggiungersi le indagini di laboratorio, strumentali e per immagini, cio le forme indirette di acquisire elementi da utilizzare nelle scelte decisionali diagnostiche e terapeutiche. Essenzialmente per il medico ha la necessit di raccogliere dati per confermare (od escludere) il suo sospetto diagnostico oppure per monitorare il decorso della malat tia e l'efficacia delle sue scelte terapeutiche .

In linea di massima: - troviamo innanzitutto il ricorso al metodo diagnostico dello screening, come separare i sani dagli ammalati in base a dei test di laboratorio per lo pi singoli, in alcuni casi multifasici. - la richiesta di esami iniziali ( l'esame obiettivo di laboratorio) di un complesso cio di dati di base (profili) standardizzato in modo da essere comunque utilizzabile per un primo impatto diagnostico, a prescindere dalla malattia specifica per cui viene richiesto (si tratta di una pratica laboratoristica gi molto utilizzata nella fase di accoglimento al ricovero ospedaliero). - l'altra forma di ricorso al laboratorio quella dell 'approfondimento diagnostico: essa deve far seguito alla precedente con test mirati, dettati dai risultati iniziali oppure dal persistere del convincimento diagnostico del clinico fondato sulla storia e sull'esame obiettivo. Fanno parte dell'approfondimento diagnostico gli esami di laboratorio che si richiedono per avere una misura possibilmente quantitativa dell'entit delle lesioni che sono alla base di una malattia gi diagnosticata. - vi infine il monitoraggio che pu riguardare l'andamento di una malattia gi diagnosticata oppure i livelli dei farmaci somministrati a scopo terapeutico, per mantenerli al richiesto grado di efficacia e per prevenire un'eventuale tossicit.

Finalit di screening

Screening: modalit di indagine per evidenziare malattie o difetti che non sono manifesti clinicamente. vi possono essere screening biochimici, ematologici, microbiologici ecc. a se conda dei test o gruppi di test che vengono attuati per raggiungere lo scopo si tratta per lo pi di indagini programmate che rientrano nell'ambito della medicina preventiva e sociale I programmi di screening possono essere di due tipi : - mirati ad una singola malattia (o difetto) ben definita e delimitata, e costituiti in genere dall'applicazione di un singolo test; - non mirati e attuati per lo pi per mezzo di batterie di test, nella ricerca indiscriminata di qualche stato patologico

Linee-guida definite per gli screening mirati: la malattia (o difetto) oggetto dello screening sia suscettibile di un qualche trattamento terapeutico ; in secondo luogo indispensabile mettere in atto mezzi analiticamente soddisfacenti anche se raramente attendibili al 100%; terzo, occorre identificare chiaramente la popolazione a rischio da esaminare ; quarta ed ultima condizione (talora la pi difficile da soddisfare) che la malattia da evidenziare rappresenti realmente un problema medico significativo. intuitivo che queste linee-guida non possono essere applicate agli screening non mirati ad una specifica forma morbosa, fatta eccezione forse solo per quella forma di controllo periodico dello stato di salute che va sotto il nome di check'Up. Non devono essere fatti rientrare fra le forme diagnostiche di screening i profili multifasici che vengono attuati come esame preliminare del malato, sia nella pratica ambulatoriale sia in quella di ricovero ospedaliero.

Situazioni cliniche principali nelle quali possono trovare applicazione gli esami di screening
a. Malatte metaboliche congenite. Le malattie metaboliche, genetiche e non, sono un ambito tipico di applicazione degli screening biochimici, in taluni casi praticati per tradizione, in altri per ricerca, in altri ancora obbligatori per legge. Si tratta di stati patologici in genere complessi, che incidono in una o pi fasi dello sviluppo, per la massima parte su base enzimatica dimostrata o presunta, e per i quali l'efficacia del trattamento, ove questo sia noto, dipende in modo essenziale dalla precocit della diagnosi. Attualmente si ritengono possibili circa quattromila errori genetici trasmessi per via autosomica (dominante o recessiva) o gonosomica (legati all'X). I progressi di questi ultimi anni hanno portato alla specifica evidenziazione di circa trecento di questi errori ed hanno messo a disposizione procedimenti diagnostici per il riconoscimento, oltre che degli individui affetti dalla malattia (omozigoti), anche delle persone sane portatrici del gene patologico (eterozigoti). ( ipotiroidismo fenilchetonuria fibrosi cistica, galattosemia aminoacidopatie congenite e sui difetti del tubo neurale) b. Malattie latenti. Un altro campo di applicazione degli screening quello delle malattie latenti l'ambito della diagnosi precoce che si pratica ad esempio per il diabete , per le emoglobinopatie e, al limite, per i tumori. e. Ricerca di fattori di rischio. Si tratta dei soli fattori bioumorali di rischio che possono essere definiti come variazioni metaboliche, dovute talora ad un gene mutante, influenzate da fattori ambientali, dotate di significato premonitore per determinate lesioni (prima fra tutte la malattia aterosclerotica). Si visto: a) che si tratta di varianti genetiche di tipo particolare, per lo pi ad eredit multifattoriale e a penetranza incompleta (non raffrontabili ad esempio con i deficit di glucosio-6-fosfato deidrogenasi eritrocitaria); b) che non sono indici di malattia in atto come lo pu essere, ad esempio per il diabete, il riscontro di una iperglicemia a digiuno, persistente e dimostrata ripetutamente in laboratorio, si tratta invece di indici, umorali o cellulari, correlati strettamente a malattie che si manifesteranno in epoca successiva; c) che non sono alterazioni biochimiche ad evoluzione definita, perch non sempre si assiste ad una conferma del significato premonitore La ricerca dei livelli del colesterolo-HDL diventata pertanto un'indagine importante per dimostrare l'esposizione al rischio aterogenico. Attualmente accanto al colesterolo totale, a quello LDL e HDL e ai trigliceridi, si determinano anche le apolipoproteine (per lo pi con metodi immunochimici), alcune delle quali si dimostrano particolarmente ben correlabili con il rischio aterogeno (la concentrazione di apoA diminuita e quella di apoB aumentata nei soggetti con aterosclerosi coronarica comparati con individui sani). d. Controllo dello stato di salute. Rientrano fra gli esami di screening i controlli dello stato di salute, vale a dire le indagini praticate su soggetti presunti sani e intese a fare il punto sullo stato di salute individuale. la pratica che va sotto il nome consolidato di check-upSi tratta in sostanza di indagini condotte per lo pi con cadenza periodica, su fasce di et grossolanamente definibili a rischio. e. Prevenzione del danno iatrogenico. Questi danni sono riferiti a misure terapeutiche e diagnostiche, e, sia pure in minor grado, anche alle azioni del medico stesso. Conosciamo due tipi diversi di danno da farmaci: da un lato quello raro, per lo pi sconosciuto e imprevedibile, e dall'altro quello insito nel meccanismo d'azione del farmaco stesso f. Malattie professionali. La ricerca di composti tossici nei liquidi organici o delle conseguenze biochimiche dell'azione di composti tossici (piombo, esteri organo-fosforiciecc.) g. Abuso di droghe. un campo che richiede tecniche rapide, economiche e affidabili per separare i presunti campioni positivi da sottoporre a successiva conferma.

h. Malattie infettive contagiose. Alcuni test (in prevalenza sierologici) possono identificare i soggetti portatori, vengono effettuati su intere categorie di persone. il caso, ad esempio, dell'epatite B. La ricerca sul sangue prelevato dell'HBsAg riduce ancora l'incidenza di epatiti trasfusionali del 20-30%. La ricerca degli anticorpi antiHBc potrebbe riconoscere praticamente tutti i portatori. Lo stesso concetto vale per i marcatori sierologici di infezione da virus HIV

Finalit diagnostiche
Fra i motivi di richiesta di esami di laboratorio, ovviamente la parte maggiore e talora unica, nella pratica clinica, rappresentata dagli esami diagnostici veri e propri. Non tutti i segni di laboratorio presentano per la stessa efficienza diagnostica: molto importanti sono la fase della malattia in cui i test vengono praticati e le modalit operative messe in atto dal laboratorio, il cosiddetto livello di intervento, che strettamente modellato sulle esigenze cliniche. La nuova logica operativa si basa sul principio di considerare gli esami diagnostici inquadrabili in due grandi gruppi: esami di base o iniziali ed esami di approfondimento o di conferma.

A. RICHIESTE NELLA FASE INIZIALE

In un primo approccio al malato, viene generalmente richiesto un gruppo di esami ottenibili dal laboratorio contestualmente o quasi all'esame fisico e alla storia clinica. Si tratta di un complesso di dati biochimici, ematologici ed urinari, disposti in profili, intesi a dare un quadro generale delle condizioni metaboliche del paziente e ad indirizzare nella richiesta di esami di approfondimento (profili di base) .

B. RICHIESTE IN FASE DI APPROFONDIMENTO DIAGNOSTICO

La richiesta di approfondimento diagnostico pu avvenire in due forme principali: la prima, che attualmente ancora molto comune, la richiesta del medico curante di uno o pi esami, per lo pi accorpati secondo tradizione, talora mirati, conseguente al solo ragionamento diagnostico basato sull'anamnesi e sull'esame obiettivo; la seconda, proposta con la nuova logica operativa, consiste di un'indagine mirata successiva e conseguente alla valutazione congiunta dei dati anamnestici, dell'esame fisico del malato e dei profili di base, che in questa eventualit , possono essere definiti l'esame obiettivo di laboratorio.

Il medico clinico richiede e raccoglie i dati di laboratorio accanto ad altri segni, con l'intento preciso di giungere ad una decisione diagnostica e terapeutica la pi completa possibile. Gli esami di approfondimento devono pertanto consentirgli di raggiungere: a) la possibilit di specificazione diagnostica b) la valutazione della gravita della forma morbosa diagnostica c) la formulazione di un giudizio prognostico c) monitorare levoluzione e il decoso della malattia

Motivi minori di richiesta degli esami di laboratorio L'evenienza pi frequente il timore di ripercussioni medico legali in casi clinici complessi o sospetti di implicazioni delittuose. Un altro movente sono le ipotesi di oscure, quanto improbabili, rarissime malattie.

LA LOGICA DELLA RISPOSTA DEL LABORATORIO La logica del processo diagnostico intesa come riconoscimento della classe o gruppo di malattie cui appartiene il malato, basato sulle esperienze precedenti fatte su detta classe o gruppo, e finalizzato ad una scelta decisionale. Fare diagnosi in altri termini ha un significato preciso: classificare correttamente per decidere correttamente . l'applicazione dei test di laboratorio infatti non si limita alla fase di classificazione di una forma morbosa e di scelta delle specificazioni (la diagnosi vera e propria) ma prosegue, con impegno variabile a seconda della gravita, nelle fasi evolutive della malattia (monitoraggio del decorso e dei farmaci). La logica diagnostica del medico di laboratorio I dati obiettivi, la quantificazione cio delle alterazioni strutturali e metaboliche che sono presenti nel corso della malattia o che ne documentano la guarigione, possono essere fomiti dal laboratorio con una tempestivit ed un'affidabilit molto elevate in virt degli incessanti progressi della tecnologia, pertanto ad ogni situazione clinica vengono fatti corrispondere livelli di interventi del laboratorio. Questi livelli presuppongono tipi di analisi, tempi di esecuzione e modalit di refertazione organizzati secondo una logica che tenga conto, oltre che ovviamente delle necessit clini che, anche delle possibilit tecnologiche di cui pu disporre il laboratorio moderno. I livelli di intervento sono suddivisi in tre grandi gruppi di situazioni cliniche: l'urgenza, la diagnostica, il monitoraggio. Gli esami d'urgenza sono dettati in modo diretto, in forma e con una tipologia speciali date le condizioni del malato, dall'esame fisico e dall'anamnesi. I loro risultati vanno direttamente al medico con particolare sollecitudine perch la decisione clinica deve essere tempestiva. Gli esami di base, che abbiamo denominato anche esame obiettivo di laboratorio, sono considerati parte dell'esame del paziente, unitamente all'esame fisico e all'anamnesi. questo un aspetto qualificante del nuovo modo di procedere, perch codifica in modo preciso che alcuni dati obiettivi (i segni di laboratorio) sono essenziali ad orientare la prima impostazione diagnostica. In alcuni casi, i risultati di questi esami unitamente a quelli dell'esame clinico, possono portare alla decisione clinica; nella maggioranza dei casi, suggeriscono e consentono di passare agli esami di approfondimento. Gli esami di approfondimento , articolati in varie forme, dai test singoli ai profili ed ai modelli biodinamici, sono il cuore dell'attivit del laboratorio e lo saranno sempre pi per l'affinarsi delle tecniche analitiche, di biologia molecolare ed informatiche. I risultati della diagnostica di approfondimento sono quelli che pi pesano nella decisione clinica. Gli esami di monitoraggio infine, hanno una collocazione particolare in quanto, da un lato contribuiscono alla decisione clinica, dall'altro sono dettati dalla decisione clinica: nel primo caso infatti il laboratorio fornisce tempestivamente dati obiettivi sul decorso della malattia gi diagnosticata ma in fase evolutiva; nel secondo, i dati sono il naturale completamento della condotta terapeutica in particolare, e della sorveglianza dell'evoluzione in generale.

ESAMI D'URGENZA E DI EMERGENZA Per esame d'urgenza si deve intendere quell'analisi di laboratorio le cui richiesta, esecuzione e refertazione debbono essere attuate in un tempo tale da assicurare un'ottimale condotta diagnostica e terapeutica in situazioni cliniche gravi e talora di pericolo per la vita del paziente . opportuno definire come analisi di emergenza quelle analisi urgenti di laboratorio che sono indispensabili al medico per fronteggiare le situazioni di pericolo di vita . Rientrano in questo gruppo (emergenza) tutti i test che vengono abitualmente impiegati nella diagnostica differenziale dei coma, nella diagnosi e nella valutazione delle cardiopatie ischemico-infartuali, delle turbe elettrolitiche, della osmolarit e dell'equilibrio acido-base di interesse pediatrico o dei pazienti dei centri di terapia intensiva.

Nel gruppo delle analisi d'urgenza vanno incluse tutte quelle prestazioni diagnostiche per le quali il quesito clinico esige un'esecuzione rapida ma non quanto quella propria dell'emergenza. Sono i casi clinici in cui pu essere attuata una terapia sintomatica in attesa di un dato; o i casi che necessitano di conferma laboratoristica, ma nei quali l'orientamento clinico di immediata intuizione. Ad alcune analisi possibile riconoscere solo il carattere di tempestivit di esecuzione perch tecnicamente ineseguibili nei tempi che sono propri dell'urgenza e ancor pi dell'emergenza (rientravano in questo ambito fino a non molto tempo fa alcuni test di interesse ostetrico e tra questi la determinazione dell'estriolo in gravidanza o di altri indici di sofferenza fetoplacentare). Al livello operativo dell 'urgenza e dell'emergenza clinica, i referti vengono resi disponibili per i curanti entro due ore nel primo caso ed entro un'ora nel secondo . Gli esami d'urgenza rientrano ormai per la quasi totalit fra gli esami automatizzabili: sono pertanto di rapida esecuzione e di attendibilit molto elevata. Anche per gli esami praticati manualmente comunque assicurabile la tempestivit della refertazione.

ESAMI DIAGNOSTICI DI BASE Gli esami diagnostici di base sono un complesso di esami raggruppati secondo criteri fisiopatologici, di esecuzione agevole, ottenibili con gradi di accuratezza e di precisione analitiche molto elevati. loro caratteristica di non essere mirati ad una particolare malat tia, come non mirato l'esame clinico generale che si pratica su di un paziente per inquadrarlo diagnosticamente (gli esami mirati sono successivi a quelli di base e vengono definiti esami diagnostici di approfondimento). Comprendono: PROFILI GENERALI, PROFILO BIOCHIMICO ED EMATOLOGICO, PROFILO URINARIO

ESAMI DI MONITORAGGIO a. il monitoraggio del decorso b. Il monitoraggio dei livelli dei tarmaci. La seconda forma di monitoraggio programmato quella del livello dei farmaci nel plasma. Per questa pratica di laboratorio (TDM), essenziale l'esatta programmazione dei tempi di prelievo, la conoscenza delle caratteristiche farmacocinetiche e farmacodinamiche del farmaco, il tempo necessario perch esso raggiunga lo steady state nel plasma. e. Il monitoraggio dell'esposizione a sostanze tossiche. Epossibile determinare la concentrazione della sostanza stessa o dei suoi metaboliti nei liquidi o tessuti biologici, oppure valutare le variazioni di parametri biologici indotte dalle sostanze tossiche sospettate o dimostrate.

IL VALORE SEMEIOTICO DELLE INDAGINI DI LABORATORIO

Le indagini di laboratorio sono praticate al fine di accrescere le possibilit di discriminare le persone sane dalle ammalate (screening), di classificare queste ultime in modo corretto per prendere le decisioni terapeutiche conseguenti (diagnosi), per seguire e sorvegliare i trattamenti (monitoraggio). Per conseguire questi scopi, le indagini di laboratorio devono essere in grado di apportare conoscenze aggiuntive rispetto a quelle gi in possesso del medico clinico : un dato di laboratorio deve essere cio richiesto e preso in considerazione per il suo contenuto di informazione. Il contenuto di informazione del dato analitico ha un vero e proprio intrinseco valore semeiotico che deve tener conto di alcuni fattori, in particolare: 1. la variabilit del risultato , che propria dei risultati di tutte le misurazioni e riconosce cause di natura biologica e cause dinatura analitica; 2. la posizione del risultato , relativamente a valori di riferimento. I valori di riferimento sono rilevati su di una popolazione detta di riferimento: il riferimento pu essere a specifiche forme morbose, ma per lo pi si tratta del riferimento alla popolazione sana (valori di riferimento per il normale, detti in passato valori normali); 3. la rilevanza clinica del dato valutata in base a precisi indici o criteri. Questi indici di valutazione da tempo sono venuti a sostituire talune espressioni cliniche approssimative che definivano l'importanza di un segno (sia di laboratorio sia clinico) come: frequente, raro... intenso, debole... sicuro, probabile... ecc. Si tratta degli indici di sensibilit diagnostica, di specificit diagnostica, di efficienza diagnostica e del valore predittivo Gli aggettivi diagnostica sono indispensabili per evitare una possibile confusione con gli indici che si riferiscono alle qualit tecniche del dato di laboratorio e non al suo valore semeiotico.

La variabilit dei risultati - Molti fattori, oltre naturalmente alle malattie, possono provocare alterazioni dei valori dei costituenti del corpo umano - Quando si ripete pi volte, in successione ravvicinata di tempo, su di uno stesso campione la determinazione di un costituente dell'organismo, il risultato quantitativo che si ottiene differisce ogni volta per un certo ordine di grandezza (in genere non spiccato); questo comportamento viene definito variabilit del risultato - Lo stesso avviene se si eseguono le determinazioni di un dato costituente, sullo stesso soggetto, con lo stesso metodo, in ore diverse della giornata; e anche sullo stesso soggetto nelle stesse condizioni basali ma in giorni successivi - Variabilit dei risultati si osserva se le determinazioni dello stesso costituente avvengono su soggetti diversi ma scelti in quanto appartenenti ad un gruppo omogeneo, tutti cio nelle stesse condizioni (et, sesso, stato di benessere ecc). La variabilit riconosce essenzialmente due cause: le condizioni biologiche dei soggetti al momento dell'esame e le caratteristiche analitiche dei metodi con cui si eseguono le misurazioni. Si pu parlare cio di una variabilit biologica e di una variabilit analitica: la somma di questi due tipi di variabilit pu essere definita variabilit totale del risultato

La variabilit biologica La variabilit biologica dovuta alla diversit delle influenze fisiologiche: per quelle a carico dello stesso individuo si parla di variabilit biologica intraindividuale; le diversit fra individui caratterizzano invece la variabilit interindividuale. La prima in causa quando si eseguono determinazioni dei costituenti dell'organismo sullo stesso individuo in tempi e condizioni fisiologiche diverse. La variabilit interindividuale si riferisce invece alle differenze dei risultati che si ottengono nelle misura zioni di laboratorio dello stesso costituente effettuate su individui diversi ma tutti nelle stesse condizioni. Le fonti pi importanti di variabilit biologica
1. I ritmi circadian i. Molti costituenti del siero e delle urine presentano variazioni di concentrazione lungo l'arco del giorno e della notte. Si tratta di variazioni in parte veramente cicliche, in parte dovute a momenti occasionali quali lo stress, l'ansia, l'ingestione di cibo ecc. Le variazioni cicliche possono essere irrilevanti per taluni costituenti, come nel caso delle attivit enzimatiche (solo la lattato-deidrogenasi e la creatinchinasi presentano valori diurni lievemente superiori a quelli notturni); oppure molto mar cate, come nel caso della sideremia. 2. Le variazioni stagionali . La variabilit legata all'avvicendarsi delle stagioni meno conosciuta di quella circadiana. In linea generale, la concentrazione nel siero e l'eliminazione urinaria dimolti costituenti maggiore in estate che in inverno, riflettendo probabilmente la maggiore ricchezza della dieta estiva e l'aumentata attivit sportiva o muscolare in genere. Il colesterolo stato trovato invece pi alto in inverno e cos pure il glucosio, mentre i trigliceridi decrescono dall'estate all'inverno. 3. Il ciclo mestruale . Le singole fasi del ciclo sono ovviamentecaratterizzate da livelli diversi degli ormoni della riproduzione e diquelli ad essa correlati pi strettamente. Anche altri costituentituttavia presentano variazioni legate al ciclo. Il livello plasmatico del colesterolo basso nel periodo dell'ovulazione, in corrispondenza della massima secrezione estrogenica. Le proteine totali e l'albumina diminuiscono a met del ciclo, con una rapida ripresa nel periodo immediatamente seguente. La creatinina e l'acido urico sono pi elevati nel siero durante il periodo mestruale. Nella fase ovulatoria si ha una diminuzione dei livelli di acido ascorbico del plasma. Le attivit enzimatiche non sembrano influenzate dal ciclo. 4. La dieta. L'apporto calorico e le relative proporzioni di protidi,glucidi e lipidi nella dieta, variano enormemente a seconda delle disponibilit di cibo sulla Terra: queste variazioni hanno grande influenza sulla composizione dei tessuti corporei e quindi sulle concentrazioni dei costituenti nel sangue e nei liquidi organici. La concentrazione plasmatica ed urinaria di molti costituenti correlata con l'apporto proteico. Gi dopo quattro giorni dall'inizio di una dieta iperproteica, l'urea sanguigna aumenta del 75%, il colesterolo del 18% ed i fosfati del 10%. Una riduzione proteica porta invece a ridotto turnover azotato. Con dieta ricca di glucidi, si hanno nel plasma attivit della lattato-deidrogenasi e della fosfatasi alcalina pi elevate; una riduzione dei carboidrati porta a diminuzione dei trigliceridi del siero, delle lipoproteine a bassa densit, del colesterolo e delle proteine. Un ricco apporto calorico aumenta il colesterolo e i trigliceridi del siero, una dieta priva di colesterolo non sembra per aver effetti stabili sulla sua diminuzione. Le diete vegetariane, le diete sintetiche, il digiuno possono indurre variazioni dei risultati dei test di laboratorio per cui necessario esserne a conoscenza nella fase interpretativa dei referti. 5. La gravidanza . Questo stato fisiologico provoca molte variazioni biologiche sui test di laboratorio. Di ci va tenuto conto,prima di attribuire un risultato ad un evento patologico. 6. Il sesso. Le differenze dei valori di laboratorio fra i due sessisono legate essenzialmente alle diverse influenze ormonali e alladiversa massa muscolare. Queste differenze sono cos sensibili che si usano valori di riferimento appropriati per l'uno e per l'altro sesso (come per le et). Le differenze pi marcate si hanno nell'epoca fra la pubert e la menopausa. 7. La razza . Anche se molto difficile discendere quanto dovuto alla diversit razziale da quelle che sono definite genericamente condizioni socio-economiche ed ambientali, pure gli studi sull'assetto proteico sono concordi nel senso di segnalare variazioni delle proteine totali, dell'albumina, e di talune proteine specifiche fra razza bianca e negra.

8. La massa corporea. Le concentrazioni plasmatiche di coleste-rolo e di trigliceridi sono correlate alla massa corporea. Anchel'acqua corporea segue questa correlazione positiva, e cos pure le lipop roteine, ma non le proteine. Altre correlazioni significative si hanno per il cortisolo, per la triiodotironina, per alcuni aminoacidi essenziali e per le due transaminasi. 8. L' et . Il passare degli anni ha una notevole influenza sulla composizione dell'organismo e quindi sulla concentrazione dei costituenti del plasma e dei liquidi organici. Anche se le variazioni fisio-logiche sono un continuo, opportuno considerare quattro periodidi et ai fini della corretta interpretazione dei dati di laboratorio: l'et neonatale, l'et infantile fino alla pubert, l'et adulta, l'et avanzata. Con l'applicazione degli intervalli di riferimento nell'impostazione diagnostica che alla base del laboratorio moderno, i fattori di variabilit biologica legati all'et vengono evidenziati e presi in considerazione in modo molto approfondito e quindi efficace. 10. Il tipo i attivit lavorativa e la classe sociale . Le variazioni dovute a questi fattori non sono n numerose n troppo marcate. Sono stati dimostrati comunque livelli di acido urico pi elevati negli uomini d'affari e di pensiero rispetto ai lavoratori del braccio e pi nelle persone ad elevato quoziente intellettivo che in altre;le attivit aminotransferasiche sono risultate lievemente pi alte negli agricoltori rispetto ad altri lavoratori. 11. La localizzazione geografica . Non sono molti gli studi che delineano chiaramente l'importanza di questo fattore. E certo comunque che delle influenze ambientali va tenuto conto nella definizione degli intervalli di riferimento per il normale. Mentre si hanno pochi elementi sicuri sulle variazioni a lungo termine da altitudine, sono ben note quelle a carico di alcuni costituenti nei cambiamenti improvvisi di quota: si hanno diminuzioni del glucosio plasmatico, aumenti del lattato, riduzioni proteiche, diminuzioni del volume urinario, aumenti del numero e della costituzione dei globuli rossi, con aumento fino anche al 25% del 2-3-difosfo-glicerato e deviazione a destra della curva di dissociazione delPO 2. 12. Il fumo di tabacco . Non viene qui intesa l'abitudine al fumo pi o meno marcata fino al tabagismo: le variazioni da tabagismo sono vere e proprie alterazioni patologiche. Entro 1-2 ore dall'inalazione di fumo di tabacco si hanno in particolare aumenti della norepinefrina e dell'epinefrina nel sangue, aumenti del glucosio(anche di 10 mg/L), del rapporto lattato/piruvato, del glicerolo, degli acidi grassi liberi, del volume e della secrezione acida del succo gastrico, una lieve emodiluizione ed una diminuzione delcontenuto di acido ascorbico sia del plasma sia dei leucociti. 13. L'ingestione recente di cibo. Un numero enorme di ricerche sono state effettuate sulle variazioni dei costituenti del sangue entro le prime ore (fino a 12) dall'assunzione di cibo e di liquidi. L'assunzione di alcool, come vino e liquori, deve essere considerata a parte ( importante anche nei confronti della variabilit analitica, come l'assunzione di farmaci). 14. La postura. Quando un soggetto passa dalla posizione supina a quella seduta o eretta, il volume del sangue circolante subisce una riduzione di 600-800 mL. In questo passaggio vengono messi in moto meccanismi compensatori immediati e si verificano, entro i primi 10-30 minuti dal cambiamento di posizione, variazioni della concentrazione plasmatica di talune grosse molecole come le proteine, che aumentano; le variazioni sono soprattutto a carico degli ormoni pressori: norepinefrina, aldosterone, angiotensina II,renina ed ormone antidiuretico. Nel passaggio inverso, dalla po sizione eretta alla supina, le alterazioni funzionali e biochimiche sono di segno opposto. Oltre alle variazioni proteiche (soprattutto albumina ed enzimi) si riscontrano anche variazioni delle piccole molecole che dalle proteine sono veicolate nel plasma (tiroxina,farmaci ecc). Tutte queste complesse variazioni sono un ulteriore elemento di spinta alla standardizzazione del prelievo dei campioni. 15. Disturbi del sonno - Stati di ansia - Affaticamento fisico -Immobilizzazione forzata . In tutte queste condizioni sono state dimostrate variazioni dei costituenti del sangue che, seppure non spiccate, possono venire ad aggiungersi agli altri fattori che provocano la variabilit biologica. Si sono dimostrati aumenti di norepinefrina, epinefrina, tiroxina e cortisolo nei disturbi del sonno; variazioni nell'eliminazione del calcio nell'immobilit protratta; alterazioni proteiche e aumenti di talune attivit enzimatiche dopo esercizio fisico estenuante o attuato in condizioni di non allenamento.

La variabilit analitica. La variabilit analitica la variabilit dei risultati delle analisi di laboratorio che pu essere attribuita ai procedimenti usati per ottenerli. possibile suddividere la variabilit analitica a seconda delle fasi che caratterizzano una determinazione e cio la fase preanalitica o preparativa, l'analitica propriamente detta e la postanalitica o interpretativa.
Poich il ciclo analitico ha inizio con la preparazione del paziente e l'ottenimento dei campioni, devono essere richiamati a questo punto anche alcuni fattori di variabilit biologica: assunzione recente di cibo e bevande; esercizio fisico; postura; fumo di tabacco; disturbi del sonno, inquietudine ecc.

L'importanza della variabilit dei risultati. a) La variabilit biologica, essendo un fenomeno generale, interessa tutti gli aspetti della fisiopatologia e della diagnostica .Nelle righe precedenti, l'attenzione stata richiamata essenzialmente sulla variabilit dei risultati delle determinazioni dei costituenti biochimici ed ematologici, ma un comportamento analogo si ha per la risposta immunologica, per le ricerche microbiologiche, per la reattivit individuale alle malattie ecc. b) La variabilit biologica pu essere solo esattamente conosciuta ma non pu essere eliminata, a differenza di quella analitica che dipende dallo stato dell'arte della medicina di laboratorio in continuo progresso migliorativo. e) La conoscenza dei limiti della variabilit, sia biologica che analitica, essenziale per il medico clinico che deve prendere delle decisioni discernendo quanto nel valore numerico di un risultato frutto della variabilit e quanto del processo patologico

La posizione del risultalo rispetto ai valori di comparazione I risultati delle analisi di laboratorio (come del resto tutti gli altri elementi che il medico raccoglie nel suo esame del malato) devono essere visti per comparazione con altri dati stabiliti a priori come riferimento. Questo lavoro di comparazione viene molto facilitato se sono resi disponibili, assieme al risultato del test, dati oggettivi come per esempio i valori di riferimento . Per i risultati delle indagini di laboratorio, il riferimento per consuetudine ancora rappresentato dai cosiddetti valori normali. Questo termine per risultato, con l'esperienza, ambiguo e per ovviarvi stato introdotto il concetto dei limiti di riferimento per il normale. La rilevanza clinica del dato di laboratorio Per avere rilevanza clinica nella diagnosi della malattia e nella cura del paziente, un test di laboratorio deve fornire risultati: a) dotati di elevato spessore informativo; b) non altrimenti ottenibili allo stesso rischio e costo; e) correlati al massimo grado con la malattia indagata e solo in minima parte con altre forme morbose. In altri termini, un test di laboratorio deve essere efficace e affidabile, altrimenti porter a decisioni diagnostiche o terapeutiche errate.

Il prelievo e la raccolta dei campioni per gli esami biochimico-clinici ed ematologici

IL PRELIEVO II prelievo il primo in ordine temporale dei momenti che costituiscono l'impegno del Laboratorio nei confronti del paziente. E un momento di contatto personale fra paziente e medico di Laboratorio che deve essere utilizzato per conoscere i motivi per i quali il paziente necessita degli esami, per capire se la preparazione stata adeguata e per ottenere utili informazioni sulla appropriatezza e sull'urgenza dei test richiesti. Le tre modalit principali di raccolta del sangue sono il prelievo per puntura cutanea, il prelievo venoso ed arterioso. Puntura cutanea La punizione cutanea pu essere attuata nei polpastrelli delle dita della mano, al lobulo dell'orecchio nel piede del neonato e del lattante lungo una linea che ideal mente congiunga la parte interna del tallone al centro dell'alluce. La punzione cutanea viene praticata con lancette sterili monouso di diverso tipo a seconda della profondit dell'incisione da praticare, inferiore nel neonato e nel lattante. La parte deve essere opportunamente disinfettata e perfettamente asciutta prima della punzione; deve essere evitato il massaggio. La puntura cutanea non pu essere praticata in parti fredde o cianotiche. La fuoriuscita del sangue deve essere spontanea evitando nel modo pi assoluto qualsiasi manovra di spremitura. La prima goccia va eliminata, la parte detersa e le successive gocce opportunamen te raccolte in idonei tubi capillari, in genere eparinati, allo scopo di impedire la coagulazione del campione Il prelievo da puntura cutanea rappresenta la tecnica di elezione nei neonati e nella prima et pediatrica sia perch meno invasiva per il paziente sia perch consente una riduzione dei volumi di sangue da prelevare.

LIMITI

La scarsa affidabilit dei dati ottenuti su sangue da prelievo capillare da attribuirsi a numerose cause: La cute, sede della punzione, se non opportunamente asciutta pu provocare la commistione del disinfettante al campione con grave deterioramento di alcuni analiti e degli elementi figurati del sangue specie delle emazie; se non opportunamente detersa, la cute pu d'altro canto trasferire al campione elevate concentrazioni di cloro e di urea, falsando i risultati di queste determinazioni. I liquidi interstiziali, a diversa concentrazione proteica ed elettro litica, rispetto a quella del plasma, inquinano immancabilmente il campione con variabile quanto imprevedibile diluizione dello stesso. Anche in assenza di qualsiasi manovra di spremitura una certa entit di emolisi da rottura delle emazie sempre presente con aumento dell'emoglobina plasmatica; sono queste le cause pi comuni di conteggi eritrocitari falsamente bassi o di interferenze da parte dell'emoglobina a livello analitico. Non sempre la seconda goccia offre una quantit sufficiente di sangue e la raccolta delle successive gocce peraltro del tutto inadeguata per i conteggi piastrinici. L'aspirazione del campione nei capillari deve essere attuata rapidamente evitando l'immissione di aria tra un segmento e l'altro della colonna liquida, in grado di pregiudicare gravemente l'attendibilit delle determinazioni dell'equilibrio acido-base. Per l'esecuzione di quest'ultimo test la parte deve essere preliminarmente arterializzata mediante ri scaldamento e massaggio ed il prelievo pu essere utilizzato esclu sivamente per l'esecuzione di questo test Per effetto della punzione cutanea e dei piani sottocutanei pu effettuarsi il trasferimento nel campione di elementi endoteliali o di detriti cellulari di problematica interpretazione all'esame microscopico degli strisci colorati per un normale conteggio leucocitario differenziale. La raccolta protratta nel tempo del sangue negli appositi capillari pu provocare la formazione di microcoaguli ed invalidare i risultati dei conteggi cellulari. Sono stati descritti casi di osteomielite da punzione cutanea nei neonati e lattanti ed anche negli adulti Nell'interpretazione dei risultati analitici relativi a campioni da puntura cutanea deve infine essere tenuto presente che per moltidi questi la composizione del sangue capillare diversa da quella del sangue venoso, tanto che il confronto tra questi dati del tutto ingiustificato e purtroppo non sono stati idoneamente identificati gli intervalli di riferimento della concentrazione di molti analiti nel sangue capillare.

Prelievo venoso

II prelievo venoso viene generalmente attuato per punzione delle vene cubitali alla piega del gomito. L'ago deve essere sufficientemente grosso al fine di consentire la penetrazione pressoch spontanea del sangue nelle siringhe. L'aspirazione forzata provoca rottura delle emazie ed emolisi e l'aumento dell'emoglobina plasmatica. La presenza di schiuma pregiudica gravemente i conteggi piastrinici. Per i test della coagulazione viene raccomandato un prelievo unico e ad essi riservato; in alternativa possono essere eseguite due diverse aspirazioni di sangue con prelievo a due siringhe. Prelievi protratti, indaginosi e brusche manovre di aspirazione pregiudicano gravemente tutti i test della coagulazione ed i campioni in tale modo ottenuti non dovrebbero essere utilizzati. La presenza di microcoaguli in campioni di sangue ottenuti da prelievi protratti, oltre che i test della coagulazione pregiudicano in misura determinante i conteggi cellulari, l'emocitometria in generale e la determinazione della velocit di eritrosedimentazione. Il trasferimento del campione dalla siringa ai contenitori deve essere rapido, ma non forzato, ed attuato dopo aver disinnestato l'ago dalla siringa. L'immissione del sangue nei contenitori deve privilegiare nel tempo l'eventuale miscelazione del campione agli anticoagulanti. Questa operazione deve essere effettuata altrettanto rapidamente con provetta tappata, mediante agitazione dolce, in genere a seguito di capovolgimenti ripetuti del contenitore. La raccolta del sangue nelle provette contenenti anticoagulanti pressoch costantemente vincolata ad un rapporto ottimale tra campione ed anticoagulante. La quantit del sangue da aggiungere viene generalmente indicata da una tacca tracciata nel contenitore . Questi problemi sono quasi totalmente superati
adottando i sistemi sottovuoto (ad es. Va-cutainer, Becton Dickinson) che riducono anche i pericoli di emolisi, imbrattamento esterno delle provette e consentono una migliore standardizzazione operativa.

Le alterazioni del rapporto sangue/anticoagulante possono indurre eccessive diluizioni del campione, ed il pericolo della coagulazione; in difetto di campione alcuni analiti risultano falsamente concentrati (esempio fattori della coagulazione) e gli elementi del sangue alterati per forma e volume come pu accadere nel miscuglio sangue/EDTA, in eccesso di anticoagulante. Le manovre di aspirazione del sangue e di raccolta del campione nei contenitori vengono rigidamente standardizzate utilizzando i sistemi sotto vuoto.

Prelievo arterioso

II prelievo arterioso viene praticato dalle arterie radiali, brachiali o dalla femorale richiesto per pochi test, come ad esempio per la valutazione dell'equilibrio acido-base o per la valutazione comparata della concentrazione venosa ed arteriosa di alcuni analiti (es.: ammonio). La composizione del sangue arterioso assolutamente uniforme in tutto l'organismo, a differenza di quanto avviene per il sangue venoso che pu presentare variazioni significative di alcuni costituenti a seconda della sede di prelievo ed in rapporto all'attivit metabolica.

LA PREPARAZIONE DEL CAMPIONE

La separazione del plasma o del siero dal coagulo deve essere attuata quanto prima onde evitare il rilascio dalle emazie degli analiti o degli enzimi il cui gradiente di concentrazione sia notevolmente pi elevato che nel plasma o nel siero (potassio, fosforo ed aminotransferasi) ed il fenomeno della glicolisi con progressiva diminuzione nel tempo della concentrazione del glucosio nel plasma o nel siero. Al fine di minimizzare quanto pi possibile questo inconveniente, all'anticoagulante possono essere aggiunte sostanze ad attivit antiglicolitica, quali ad esempio il fluoruro od il monoiodoacetato. La coagulazione e la spremitura del siero da parte del coagulo si effettuano in genere a temperatura ambiente od anche a 4C qualora la separazione del siero non sia immediatamente effettuata ed i campioni non possano essere processati in tempo sufficientemente breve. Lo studio del consumo dei fattori della coagulazione ha dimostrato come quest'ultima sia completa dopo almeno 60 min a temperatura ambiente, indipendentemente dal tipo di contenitore (vetro, plastica siliconata o non siliconata). La centrifugazione che viene in genere praticata per separare il plasma dagli elementi figurati od il siero dal coagulo richiede tempi e forze rotazionali (g) differenziati a seconda che si debba separare il plasma od il siero e soprattutto se il plasma viene impiegato per i test dell'emocoagulazione. In ogni caso preferibile l'impiego di centrifughe a temperatura controllata (20-25 C). Le determinazioni ematochimiche di routine, eccettuate le determinazioni dell'ammonio, dei lattati e la valutazione dei parametri dell'equilibrio acido-base, che vanno eseguite quanto prima, dovrebbero essere effettuate entro due ore dal prelievo e le provette comunque tappate onde impedire l'evaporazione dei liquidi e la concentrazione dei campioni. La rapida separazione del plasma o del siero consente che i campioni vengano processati anche a maggiore distanza di tempo dal prelievo. L'impiego di speciali separatori che si frappongono nell'interface tra il coagulo od il sedimento degli elementi corpuscolati ed il siero od il plasma, impedisce entro certi limiti il rilascio degli analiti dalle emazie e favorisce una pi idonea conservazione del campione da analizzare.

IL TRASPORTO DEI CAMPIONI

II trasporto dei campioni ed il loro recapito in sedi diverse, anche lontane da quella del prelievo, pu essere effettuato tappando accuratamente i contenitori e riponendo gli stessi in scatole refri gerate. In ricerche di trasporto simulato per 4 giorni a 20 C, 4 C e 20 C, con e senza agitazione dei campioni, non sono state riscontrate variazioni della concentrazione degli analiti plasmatici e dei costituenti cellulari; sono invece apparsi instabili i fattori della coagulazione con significative variazioni del PT e del PTT, anche in campioni mantenuti a 4 C.