UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO

FACULTAD DE QUIMICA

BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

Revisin de mtodos espectroscpicos y elaboracin de curva estandar de protena

EQUIPO: 04

Resultados:

Para la purificacin de Lactato Deshidrogenasa (LDH) se realiz el siguiente procedimiento.

Figura 1. Esquema de purificacin de LDH mediante precipitaciones sucesivas con (NH4)2SO4 .

Se realiz el desalado de la Fraccin 4 con una columna de 2.5% Sephadex-G25, utilizando como eluyente 2mL amortiguador A, se tom el segundo mL para realizar la Cromatografa de intercambio inico, separando 2 fracciones de 100L, el resto se coloc en la columna de Microprep High de BIORAD, se equilibr la columna con 3mL amortiguador C, despus se adicionaron 600L de la solucin obtenida del desalado, utilizando como eluyente 2mL de amortiguador D, se descart el 1 mL , el 2 mL es la fraccin FBc.

Figura 2. Purificacin de protenas por cromatografa de intercambio inico. A) Desalado de la Fraccin 4 Amortiguador A (20 mM de Tris/HCl pH8.5, 0.5mM -Mercaptol y 1mM de PMSF). B) Cromatografa de intercambio inico: Amortiguador C de equilibrio (20mM de Tris/HCl pH 6.5, 0.5mM -Mercaptol y 1mM de PMSF) eluyente Amortiguador D (20mM de Tris/HCl pH6.5, 0.5mM -Mercaptol y 1M NaCl).

Para la determinacin de la concentracin de protena se realiz la curva patrn adicionando los reactivos de acuerdo a la tabla 1. Tubo Blanco 1 2 3 4 5 H2O (L) 800 770 760 740 720 700 BSA(L) 0 30 40 60 80 100 Cantidad de BSA (g) 0 3 4 6 8 10 Reactivo de Bradford (L) 200 200 200 200 200 200 Absorbancia 0 0.33 0.53 0.79 0.97 1.014 Tabla 1. Curva patrn utilizando Albumina Srica Bovina (BSA) mediante el mtodo de Bradford.

Curva Patrn
Absorbancia =595nm. 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 2 4 6

y = 0.1076x + 0.0499 R = 0.9594

10

Cantidad de BSA (g)

Grafica 1. Curva patrn con protena estndar BSA. Se diluyeron las muestras y se le adicionaron 200L de Reactivo de Bradford, se tomaron 800L de la muestra diluida y se midi en el espectrofotmetro a =595 nm. Se interpolo con los resultados de la grfica 1. Fraccin Dilucin Abs Contenido de protena (g) Concentracin (g/L) 66459.108 38020.446 23708.178 55.890 12.045 83.074 47.526 29.635 0.070 0.015

F1 10000 0.765 F2 10000 0.459 F3 10000 0.305 F4 12.5 0.531 FBc 160 0.058 Tabla 2 Concentracin de protenas en las fracciones.

Se determin el rendimiento proteico durante las diferentes fases de la purificacin de la LDH Fraccin Promedio (g de protena/L) Volumen total en la fraccin Protena total en la fraccin (L) (g) 14000 1163034.387 70000 3326789.033 1900 56306.924 1000 69.862 1000 15.056

F1 83.0739 F2 47.5256 F3 29.6352 F4 0.0699 FBc 0.0151 Tabla 3. Rendimiento Proteico.

Para cargar el gel de poliacrilamida se tomaron los siguientes volmenes. Dilucin 1:10 vol (L eq. a 30 g) 5X SDS-PAGE loading buffer (L) 5 5 5 5 5 13 Vol. De H2o (L) 14 16 10 0 0 0

F1 Si 6 F2 Si 4 F3 Si 10 F4 No 20 FBc No 20 Estandar No 7 Tabla 4. Volumen a cargar en el gel de poliacrilamida

Se realiz la carga en el gel de poliacrilamida y se corri a 25 mA hasta que se corri a la base del gel, se coloc el gel en una solucin teidora de azul de Coomasie Blue R250 en 50% (v/v) metanol, y 10% (v/v) cido actico durante 1 min., despus se lav hasta que no tio el agua destilada, y se observ contrala luz. Poner la imagen del gel Anlisis de Resultados

El desarrollo del experimento se inici con una muestra previamente licuada de msculo esqueltico de pollo, este homogeneizado se realiz con el fin de lisar clulas y tejidos para dar lugar a una suspensin uniforme. A travs de mtodos fsicos como la centrifugacin que se utiliza para eliminar contaminantes y la precipitacin por salado el cual tiene como objetivo remover contaminantes ms pequeos, obteniendo as 3 fracciones: F1, F2 y F3, las cuales se utilizaron posteriormente.
F3 se desal por medio de una cromatografa de exclusin molecular (Sefadex) y as se obtuvo la fraccin F4. Esta fraccin se llev a una columna de intercambio inico (Macroprep High S de BIORAD) con el fin de separar las biomolculas de acuerdo con su carga ya que la purificacin de protenas con este tipo de cromatografa se basa en que la carga electrosttica de las protenas depende del pH en el que se encuentra. Como resultado de esta separacin fsica se obtuvo la fraccin FBc, donde se encuentra la LDH en mayor concentracin.

Para determinar la concentracin de protena en cada una de las fracciones colectadas durante el proceso de purificacin se realizaron ensayos de absorbancia por el mtodo de Bradford. Se realizaron diluciones para determinar la concentracin de cada una de las fracciones, como se puede observar en la tabla 2 la fraccin con mayor concentracin de protena fue F1, debido a que en esta fraccin y la de menor concentracin fue FBc esto nos indica que el proceso de purificacin De estos resultados se tomaron en cuenta para determinar la concentracin total de protena,, los obtenidos por el mtodo de Bradford, debido a que es un mtodo ms sensible con respecto al de abs a 280 nm. No existe una linealidad en los datos obtenidos por el metodo de Bradford, sin embargo en las fracciones PA y PB, si se aprecia que tal como se esperaba en la FPA existe una mayor concentracin de protena que en FPB. Siguiendo con la prctica, se hicieron ensayos de actividad de cada una de las fracciones, para poder determinar la actividad especifica en cada paso de la purificacin y los rendimientos de cada fraccin. En la tabla 4 se presentan los datos de absorbancia a 340 nm, medidos cada 30 segundos, para hacer un seguimiento de la reaccin y sacar la pendiente de la grafica de abs contra tiempo (figura 1), que nos permita calcular la actividad de la enzima en cada fraccin. En la figura 1, nos muestra curvas con pendientes negativas, porque la abs. A 243 es el indicativo de cuanto Piruvato se ha transformado en lactato y se espera que conforme pasa el tiempo valla disminuyendo la concentracin de Piruvato, tambin, para las fracciones F3, F1 y F4, se observa una mayor absorbancia que en la FA debido a que en estas fracciones se encontraba mayor cantidad de LDH y que se fue perdiendo poco a poco durante el proceso de purificacin. Con los datos ya obtenidos de las determinaciones anteriores, ahora se muestra en la tabla de purificacin (tabla 5), correspondiente al proceso de purificacin de la LDH. Para evaluar y comparar la actividad enzimtica a diferentes concentraciones de Piruvato, se grafico la absorbancia obtenida de cada concentracin contra tiempos distintos (figura 2).

De la tabla 6 se grafic la actividad enzimtica calculada como en la Parte I contra las concentraciones de sustrato utilizadas en el experimento. (Figura 3).

Para evaluar y comparar la actividad enzimtica a diferentes concentraciones de Piruvato con inhibidor, se grafico la absorbancia obtenida de cada concentracin contra tiempos distintos.
este caso se observo que existe una dbil pero apreciable tendencia en lo que se refiere a la actividad especfica, misma que disminuye entre menor sea la cantidad de sustrato presente. En el proceso de purificacin de la enzima, al variar las concentraciones del piruvato, se muestra que si existe una importancia significativa en el comportamiento de la reaccin, aunque aparentemente no sigue un patrn el cambio. Lo que si se observa ligeramente es que al aumentar la concentracin de sustrato la actividad aumenta. Por otra parte cuando se agrega el inhibidor, observamos que las pendientes de las rectas tienden a cero. Despus al realizar las graficas de Michaelis-Menten, podemos ver que tampoco cumplen en ninguna de las dos condiciones con la forma caracterstica de estos ensayos, pero en el caso de realizar las graficas por el mtodo de Lineaweaver-Burk y por el de HanesWolff tampoco cumplen ya que las rectas obtenidas tienen un r2 mucho menor de 0.99. De sta manera podemos decir que los datos experimentales no se comportan de acuerdo a lo que dice la literatura. Si se presta atencin a las grficas que obtuvimos de este ensayo tanto para la de Michaelis Menten como para la de Lineweaver-Burk, as como por el mtodo de HanesWolf, se da uno cuenta, por el coeficiente de correlacin que los datos experimentales se encuentran muy lejos de lo que nos dicta la teora a este respecto. Sobre todo en la parte del efecto del inhibidor ya que dan las km muy diferentes en cada mtodo. Existen muchos factores que modifican la actividad de la enzima LDH adems de la variacin de la concentracin de sustrato y la presencia de un inhibidor en el trabajo experimental como mantener la concentracin de la enzima, el pH del medio, la fuerza inica, la temperatura, el grado de pureza, etc. Un factor importante que se debe de considerar es que se realiz el trabajo experimental con la fraccin 3 obtenida en la purificacin por cromatografa. Es importante entender los conceptos de Vmax y Km en el estudio de la cintica enzimtica, ya que estas son constantes en la expresin matemtica de LineaweaverBurk, que nos permiten conocer los efectos que tienen las variaciones tanto de la concentracin de sustrato, como la presencia de un inhibidor, en la velocidad de una reaccin catalizada por una enzima (LDH), teniendo en cuenta estos conceptos podemos entender la importancia que tiene poder controlar los otros factores (pH, fuerza inica, temperatura) y que no influyan en los valores de la Vmax o la Km, valores caractersticos de cada enzima. La obtencin de valores variables en la Vmax por el modelo de Lineweaver-Burk debidos a errores experimentales como someter a la enzima a cambios constantes de temperatura, entre otros, nos llev a utilizar otro modelo grfico (HanesWolff) que nos permitiera comparar los datos obtenidos para los parmetros cinticos de la reaccin en presencia y ausencia del inhibidor. Los valores de Km fueron mayores en el experimento con inhibidor que sin inhibidor ya que en esta ltima con una Km pequea indica que en poca concentracin para la cual el sustrato satura la mitad de la enzima y por tanto existe mayor afinidad, en cambio con inhibidor no se permite esa afinidad o especificidad.

La Km terica es de 0.035 mmol/L , la experimental en el mtodo de Michaelis Menten dio de 0.055 mmol/L mayor a la de la literatura, lo cual indica que nuestra enzima LDH presenta menor afinidad a la esperada. La velocidad mxima que resulto con inhibidor fue menor que sin inhibidor. Entonces con inhibidor la Km aumento y la Vmxima disminuy lo cual indica que el oxamato es un inhibidor mixto.