DETERMINACIN DE PROTENA TOTAL Y DE CASENA EN LA LECHE I. OBJETIVO: La cantidad de protena en la leche puede determinarse mediante distintos mtodos.

. El ms exacto es el mtodo Kjedahl, sin embargo es largo y dificultoso y para realizarlo se necesitan condiciones de laboratorio. En la prctica para evaluar la leche de vacas segn su valor proteico es necesario utilizar mtodos como: Titulacin con formalina, Mtodo refractomtrico, Mtodo colorimtrico. II. FUNDAMENTO TERICO: Como otras protenas de origen animal las protenas de la leche se caracterizan por un elevado valor biolgico, ellas contienen todos los aminocidos esenciales, necesarios para nuestro organismo. La asimilacin de las protenas de la leche y de los productos lcteos es ms elevada en comparacin con las protenas de productos de origen vegetal. Es bueno sealar que con un trabajo adecuada para crear condiciones satisfactorias de alimentacin en el ganado vacuno no slo se aumenta la cantidad de leche en el ordeo, sino que tambin el contenido de grasa y protenas de la leche. El contenido de protenas en la leche es variable y depende de factores genticos y externos. Elevado contenido en protenas poseen las razas Holstein, Brown Swiss con 3.9% ; 3,7% ; 3.6% . Otras tan slo alcanzan a 3.3 y 3.2% . El contenido de protena en la leche vara segn el perodo de lactancia. En el primer da (calostro) alcanza a 15.5%, hacia el quinto da baja hasta 3.6 % y luego hasta el tercer mes disminuye un poco, pero al final de la lactancia la cantidad de protena en la leche vuelve a aumentar.

En la leche las protenas se encuentran en estado coloidal. Sus partculas son 10 veces ms pequeas que los glbulos de grasa, slo se pueden observar en un ultramicroscopio. Las protenas de la leche se forman de los aminocidos, polipptidos y protenas de la sangre de la vaca, para la formacin de los cuales se utilizan sustancias nitrogenadas del alimento del ganado. Si esto mejora en racin alimenticia aumentar la protena en la leche. Las principales protenas de la leche son: la casena, la albmina y la globulina. Estas se diferencian por sus propiedades qumicas fisiolgicas y por su valor biolgico La casena es el 80% de todas las protenas, o el 2,7 - 2,8 % de la masa total de la leche. Son conocidas algunas fracciones de la casena: , , , que se diferencian por su contenido en nitrgeno, fsforo y azufre. La casena se utiliza para la elaboracin de quesos, requesn y otros. Su principal caracterstica es el de coagularse por accin del cuajo, sin embargo esta vara: as - casena se coagula bien, - casena en menor grado y - casena no se coagula. Por eso la calidad de la leche para la elaboracin de quesos no ser igual a pesar de las mismas condiciones externas. Durante el calentamiento de la leche la casena no se coagula, pero si se agrega cidos o si se forman durante la conservacin de la leche la casena se coagular. Esta propiedad de la casena se utiliza para la elaboracin de productos cido - lcticos. Un esquema simple del complejo calcio - casena es el sgte. : (COOH)4 NH2 --- R (COO)2 Ca

Los grupos carboxlicos (cidos) en la casena son mayores que los grupos aminos, por eso su reaccin en sustancias de sales neutras es cida. Para neutralizar 1 gramo de casena es necesario 9 ml. de 0,1N de una solucin de soda. En esto se basa el mtodo de determinacin de casena en la leche mediante el mtodo de titulacin. La albmina viene a ser el 15% de todas las protenas o el 0,4% de la masa total de la leche. Se diferencia de la casena porque no contiene fsforo, pero el azufre en ella es 2,5 veces mayor. Durante el calentamiento de la leche la albmina se coagula y cae como precipitado. En el proceso de elaboracin de quesos la albmina pasa al suero. En ella existen gran cantidad de aminocidos esenciales, se utiliza la albmina para la elaboracin consistencia delicada, suave. En menor cantidad en la leche se encuentra la globulina (0,1 % del total de la leche), pero esta protena tiene gran importancia porque posee sustancias inmunolgicas que tienen la propiedad de eliminar y evitar el desarrollo de Mos. Patgenos. Adems de estas protenas, un rol fisiolgico importante poseen las protenas de la envoltura de los glbulos de grasa. De 100 gr. de grasa se obtiene 0,1 gr. de estas protenas, de alto valor biolgico. Estn relacionadas a las lipoprotenas ya que en ellas se encuentra la sustancia lecitina, necesaria para la buena marcha de los procesos fisiolgicos en el organismo. En la produccin de mantequilla los glbulos grasos pierden su envoltura lipoproteca la cual pasa al suero. Por esto el suero de la mantequilla no slo es nutritivo sino posee propiedades que pueden mejorar la salud. de requesones, pastas, cremas de

El mtodo que se utilizar para determinar la cantidad total de protena ser el de Titulacin con formalina, ste mtodo se basa en que, una solucin acuosa neutra de aminocidos en presencia de formalina neutra es capaz de aumentar su acidez con la formacin de compuestos, en los cuales ambos tomos de hidrgeno del grupo amino son reemplazados por un grupo metlico. H R CH COOH + O C ------NH2 H NH2 grupo metlico RCHCOOH + H2O

Grupo amino

El grupo libre COOH se titula con solucin NaOH. R CH COOH + NaOH --------N=CH2 RCHCOONa + H2O N=CH2

El segundo mtodo es refractomtrico y se basa en establecer la diferencia de los ndices de refraccin del rayo de luz que pasa a travs de la leche y del suero (despus de precipitar la casena con el cloruro de Calcio). Las casenas (fosfoprotenas) representan el 80% de las protenas de la leche de vaca; el resto est constituido por Beta-lactoglobulina (alrededor del 10% de las protenas totales), Alfa-lactoalbmina (en torno al 2% de las protenas totales) y pequeas cantidades de diversas protenas (enzimas, inmunoglobulinas, etc.). Cuando se coagulan las casenas, quedan en solucin las otras protenas; conjuntamente con la lactosa y sales minerales para constituir el llamado lactosuero.

La fraccin casenica Comprende varios tipos de molculas de las cuales el 50% aproximadamente es de alfa-casenas, 30% de beta-casena, 15% de k-casena y 5% de gama-casena. separarse por ultracentrifugacin, Estos compuestos pueden la fraccin casenica total se

precipita por descenso del pH de la leche hasta 4,7 aproximadamente. A pH 7 y aisladamente, la alfa-casena est bajo la forma de pequeos polmeros, la beta-casena al estado de monmero y la k-casena al estado de polmeros mayores. A pH 7 y 37C, el agregado de iones Ca ++ no afecta a la k-casena, en cambio la beta-casena precipita y la alfa-casena coagula. Los complejos de alfa y k se asocian con la casena para formar micelas. Durante el cuajado de la leche, el cuajo ataca a la casena k, escindiendo el enlace peptdico fenilalanina-metionina. La paracasena k as formada ya no estabiliza ms el complejo con la casena alfa, y en presencia de calcio, los conjuntos micelares coagulan, formando un gel, la cuajada, que expulsa al lquido llamado lactosuero, por sinresis. La velocidad de coagulacin y sinresis aumentan cuanto mayor sean los contenidos de casenas, calcio y acidez de la leche. Beta-lactoglobulina No se encuentra en la leche humana. Es la protena ms abundante en el lactosuero de la leche de vaca. La composicin en aminocidos es bien conocida y se sabe que hay por lo menos 4 variantes genticas, que se distinguen por la sustitucin de ciertos aminocidos en la cadena proteica. Incide en los tratamientos tecnolgicos de la leche, en efecto, su desnaturalizacin por calentamiento reduce el riesgo de coagulacin de la leche durante la esterilizacin. Alfa-lactoalbmina Es una de las protenas del sistema lactosa-sintetasa, presente en las clulas de las glndulas mamarias.

En conjunto provocan la unin de la glucosa con la galactosa, asegurando la sntesis de la lactosa. Es insoluble a pH entre 4 y 5,5, a un lado y a otro lado de esta zona, la molcula sufre modificaciones de conformacin, rpida o lenta, reversibles o no, que conducen a diversas formas polimerizadas. Lactoferrina, la protena roja de la leche Esta protena tiene como principal propiedad la de unir fuertemente al hierro, que es el que le da su color rojo. En condiciones fisiolgicas tiene muy poco hierro unido, y es capaz de fijar el que se encuentra en el medio, de tal forma, que los microorganismos no disponen de l para su proliferacin. Tambin se ha comprobado que puede tener un efecto bactericida al interaccionar con la pared de los microorganismos, desestabilizndola y causando su muerte. A travs de estos dos mecanismos, la lactoferrina puede desempear un papel esencial en la proteccin del recin nacido frente a infecciones gastrointestinales. Lactoperoxidasa, la importancia del H2O2 La lactoperoxidasa es una enzima muy abundante en la leche de vaca, pero su presencia es casi indetectable en la leche humana. Forma parte de un sistema defensivo que permite la formacin, en la propia leche o en el tuvo digestivo, de sustancias con gran poder antimicrobiano. La lactoperoxidasa cataliza la formacin de estas sustancias en presencia de trazas de H2O2. Esta H2O2 es incluso formada por los propios microorganismos, que luego sufrirn los efectos de los productos formados por la lactoperoxidasa. Esta enzima, al igual que la lactoferrina puede ser aislada del lactosuero para su aplicacin como conservante natural de algunos productos alimenticios.

La digestibilidad real de las protenas de la leche es muy alta en adultos (0.97 igual a las del huevo) y algo menor en los nios, segn sus edades entre 0.90 y 0.93. Tiene gran riqueza de aminocidos esenciales, y su NPU (utilizacin neta proteica) para nios de 3 a 7 aos, cuando forma el 3% de la energa total de la dieta, es de 0.81. La leche es el alimento de todos los mamferos durante las primeras etapas del nacimiento. Su composicin resulta muy notable, ya que la mayora de sus componentes se sintetiza especialmente para formar parte de ella, y no se encuentra en ninguna parte del organismo. As, la lactosa no se halla en cantidades significativas en ningn otro tejido animal o vegetal. Por lo que respecta a las protenas, sucede lo mismo; las ms abundantes son tambin exclusivas de la leche. PROPIEDADES FSICAS DE LAS PROTENAS DE LA LECHE: 1. Solubilidad y estabilidad de las soluciones: Todas las protenas contienen grupos polares que poseen una gran atraccin por las molculas de agua, pero no todas son igualmente solubles en sta. Aparte de la proporcin relativa de los grupos polares y de los grupos no polares, intervienen en la solubilidad de las protenas la fuerza de los enlaces intramoleculares y las posibilidades de enlace con los cationes y los aniones. La afinidad de las protenas por el agua depende mucho de las condiciones fisicoqumicas. Sus soluciones no poseen la estabilidad de las soluciones de sustancias de molculas pequeas, como la lactosa. El pH tiene una gran influencia; en el punto isoelctrico cesa la repulsin de las molculas, con tendencia a agregarse y a flocular. En las condiciones de concentracin en que se hallan las protenas y las sales de la leche, solamente las protenas que forman la casena precipitan por un cambio de pH, hacia 4,6. Las sales aadidas a las soluciones de protenas tienen efectos variables segn su naturaleza y concentracin. Si la concentracin es dbil, las sales no desnaturalizantes se disocian

en iones, que se ligan a la molcula proteica, aumentndose as su afinidad por el agua. Por el contrario, una fuerte concentracin de sal cuyo anin se encuentra fuertemente cargado (sulfato, cloruro) orienta las molculas de agua; de ello resulta una competicin entre estos iones y los grupos polares de las protenas, lo que provoca la floculacin. La floculacin puede lograrse tambin por la adicin de un solvente miscible con el agua (alcohol, acetona) pues disminuye la constante dielctrica y reduce la atraccin de los grupos polares por el agua. Estas propiedades se utilizan para separar y purificar las protenas de la leche. 2. Densidad : La densidad de las protenas de la leche es cercana a 1,3. Debido a la carga de las molculas, hay una contraccin de volumen en el curso de la disolucin, que vara del 5 al 8%. Para la casena, el volumen especfico pasa de 0,774 a 0,731; lo que corresponde a densidades de 1,292(slida) y 1,367(solucin). Para la beta -lactoglobulina el volumen especfico pasa de 0,802 a 0,751 y la densidad de 1,247 a 1,331. El volumen especfico de una protena se encuentra en relacin con su composicin en aminocidos. 3. ndice de Refraccin: El ndice de refraccin de una protena pura se deduce de las determinaciones del ndice de sus soluciones; pero se puede calcular tambin segn su composicin en aminocidos, ya que es un valor caracterstico. Las diferentes protenas de la leche no tienen el mismo ndice de refraccin( es ms elevado cuanto ms bajo es el volumen especfico). En solucin el ndice de refraccin vara proporcionalmente a la concentracin, pero el incremento difiere muy poco de una protena a otra.

4. Propiedades espectrofotomtricas: Las protenas de la leche no muestran bandas de adsorcin en el espectro visible ya que son incoloras, salvo un componente menor, la lactoferrina. Por el contrario, originan bandas caractersticas en los espectros ultravioletas e infrarrojo. Una de las ms interesantes es aquella cuyo punto mximo se sita hacia 280 mu, y se debe a los aminocidos de la serie aromtica, tirosina y triptfano. Esta propiedad permite valorar las protenas por espectrofotometra en el ultravioleta; pero es preciso anotar que el coeficiente de extincin vara segn la composicin en aminocidos. Por la misma razn (presencia de aminocidos aromticos) las protenas de la leche son fluorescentes; con una activacin a 280mu. III. MATERIALES Y REACTIVOS: Muestra de leche Bureta de 10 ml Soporte universal Dos matraces erlenmeyer 100 ml. Solucin de hidrxido de Na 0,1 N. Fenolftalena al 1%( solucin alcohlica). Formalina neutra. Solucin de cloruro de calcio al 4%. Cocinilla elctrica. Vaso de precipitado. Pipeta. Refractmetro ABBE.

IV. PROCEDIMIENTO Determinacin de Protena total y casena en la leche mediante el mtodo de Titulacin con formalina: - Preparacin de formalina neutra: a 5 ml. de formaldehdo (C= 35 40%) se agrega 0.1ml de fenolftalena y se titula con NaOH 1N hasta rosado claro bajo (no debe desaparecer). - Usando una pipeta se tomo 10ml leche, ms 12 gotas de fenolftalena y se neutraliz con NaOH 0,1N. - Luego se midi 2ml de la primera titulacin que es formalina neutra, y se agreg al segundo titulado. - El color rosado desapareci debido a que el grupo amino reaccion con la formalina. - Luego se volvi a titular hasta rosado claro tomando nota del gasto de soda utilizado. - Despus se determina la cantidad de solucin de NaOH 0,1 N que pas en la segunda titulacin despus de haber agregado la formalina. - El gasto de NaOH fue de 1,8ml - Este valor se multiplica por el coeficiente 1,92, y se determina el contenido total de protenas en la leche en %. Y para hallar el % de casena se multiplica por 1,51. Determinacin de protena en la leche por el mtodo refractomtrico: En el refractmetro se miden los slidos de la leche no grasos. Anotar (S L). Se prepara el suero de la siguiente manera: En un vaso de precipitado grande se vierten 60 ml de leche y se agregan 60 gotas de solucin de cloruro de calcio al 4%. Luego se calienta en una cocinilla por 10 minutos. Al calentarse la leche con cloruro de calcio las protenas precipitan.

Se enfra el recipiente y luego se extraen unas cuantas gotas de suero con ayuda de una pipeta. En el refractmetro se miden los slidos del suero no grasos. Anotar (S S). Para hallar el % de protenas, se realiza la siguiente resta: S L - SS . Factores que influyen en la exactitud del anlisis: - Limpieza de los prismas. - Precipitacin incompleta de la protena. - Condiciones iguales al medir los slidos de la leche y del suero. - El tiempo entre las 2 mediciones debe ser lo ms corto posible. Determinacin aproximada de protena en la leche por frmula Se puede utilizar la siguiente frmula utilizando una relacin estable entre la grasa y la protena en al leche.
Pr otena % = 1,0 + (0,65 x grasa %)

V. RESULTADOS:

Muestra: leche fresca Gasto: 1.4ml Factor de protena: 1.92 Factor de casena: 1.51 %Protena total = Gasto x Factor %Protena total = 1.4 x 1.92 %Protena total = 2,688 % %Casena = %Protena total x Factor %Casena = 2,688x 1.51 %Casena = 4,059%

VI. CONCLUSIONES: La casena (y todas las sustancias nitrogenadas) se hallan en la leche en forma de micelas, dispersas en suspensin coloidal. Cuando el grupo amino reaccion con la formalina el color de la titulacin rosada cambi a un color blanco,(esto quiere decir entonces que otra vez se volvi {cida). El calcio favorece la formacin de micelas cuando esta presente en pequeas proporciones como en la leche. Las propiedades fsicoqumicas ms importantes de presencia de protenas. El anlisis de determinacin de protenas es fundamental para la elaboracin de quesos y otros productos lcteos. Una leche con bajo porcentaje de protenas indica adulteracin. Trabajar con muestras de leche fresca. Verificar el estado de los reactivos que se van a utilizar., al igual que los equipos. VII. BIBLIOGRAFA: Charles Alais; Ciencia de la leche, Editorial reverte S.A, Mxico 1988. la leche,

especialmente las relacionadas con su estabilidad, derivan de la

ALAN H. VARMANN, JANE P. SUTHERLAND, Leche y Productos Lcteos Tecnologa Qumica y Microbiolgica, Editorial ACRIBIA S.A., Espaa, 1995.

UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

FACULTAD DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

INFORME DE LABORATORIO

TEMA

DETERMINACIN DE PROTENA CASENA EN LA LECHE

TOTAL

DE

CURSO

TECNOLOGIA DE LACTEOS

DOCENTE

ING. AMELIA CASTRO

ESTUDIANTE

EDER J. RODRIGUEZ LUQUE

02 - 23102

AO

QUINTO

TACNA PER 2009