1.1.4.

Cultivos celulares
El cultivo celular o cultivo de tejidos, como tambin se le llama, tiene su origen en el siglo XIX, como un mtodo para el estudio del comportamiento de las clulas animales libres de las variaciones sistmicas ocurridas dentro del organismo durante su normal homeostasis y bajo el estrs de un experimento. Estas tcnicas iniciaron con el cultivo de fragmentos no disgregados de tejidos, los cuales restringan la mitosis de las clulas cultivadas y por tanto su crecimiento. Despus se realizaron cultivos con fragmentos disgregados de tejidos, los cuales aumentaban el crecimiento celular en cultivo ya que se utilizaban clulas dispersas; esto fue un gran avance y provoc una explosiva expansin en esta rea desde los aos 50s (Morgan, 1995). EVOLUCION DE LOS CULTIVOS CELULARES El cultivo de clulas tuvo su origen en el siglo XIX. Rechlinhausen en 1866, mantuvo vivas clulas sanguneas de anfibio, pero fue la utilizacin de bloques de agar con plasma coagulado (soporte y alimento) el inicio del cultivo de clulas in vitro (Freshney, 1987). El desarrollo del cultivo de clulas de vertebrados se inici con las observaciones de Roux (1885) en cultivos de clulas de embrin de pollo; posteriormente Harrison (1907) cultiv tejido nervioso de rana el cual ms adelante fue reemplazada por plasma de pollo (Burrows, 1910); posteriormente, se aplic esta tcnica para el estudio en animales de sangre caliente (Carrel, 1912). Una serie de innovaciones como el desarrollo de medios de cultivo (Eagle, 1955), el uso de antibiticos, las tcnicas de tripsinizacin para el pasaje de clulas (Moscona y Moscona, 1952) y la suplementacin del medio con suero fetal bovino, permitieron el desarrollo y aplicabilidad de los cultivos de clulas de origen vertebrado. El empleo de tcnicas de fusin celular (Barski, 1960; Littlefield, 1964) estableci las bases de la gentica de clulas somticas para el anlisis de especies animales (incluyendo al hombre); igualmente la tcnica de anticuerpos monoclonales (Kohler y Milstein, 1975) ha permitido estudios en inmunologa y su aplicacin a nivel teraputico.

En la actualidad, pueden cultivarse en el laboratorio clulas procedentes de una amplia gama de tejidos y organismos diferentes. En un principio, el objetivo principal era el estudio de las propias clulas, cmo crecen, qu necesitan para su crecimiento, cmo y cuando dejan de crecer. Este tipo de estudios tiene hoy un gran inters cientfico, por ejemplo, en relacin con investigaciones sobre el ciclo celular, el control del crecimiento de clulas tumorales y la modulacin de la expresin gentica. Otra rea de gran inters se centra en la biologa del desarrollo. Los esfuerzos para explicar cmo el gran nmero de clulas presentes en organismo maduro derivan de una sola clula a partir de la fertilizacin han llevado a la bsqueda de modelos experimentales. El cultivo celular es muy adecuado como modelo para el estudio del desarrollo y la diferenciacin, por lo que las lneas celulares que conservan la capacidad de diferenciarse in vitro son objeto de un intenso estudio. Por ltimo, hay cierto tipo de investigaciones que no pueden realizarse sin el cultivo de clulas, por ejemplo, el trabajo con animales transgnicos, conduce a que organismos maduros expresen genes nuevos, se basa totalmente en las tcnicas de cultivo celular para la insercin de genes extraos en las clulas receptoras. As mismo, la tecnologa de la fusin celular y los ensayos de citotoxicidad son tcnicas de cultivo celular que, en cierto modo, han sido diseadas para sustituir a la metodologa in vivo (Cohen, 1995).

Definicin: TECNICA DE CRECIMIENTO DE CLULAS in vitro, QUE PERMITE REPRODUCIR LAS CONDICIONES EXISTENTES in vivo. 1.1.4.1. Biologa del cultivo celular
La validez de un cultivo celular como modelo de funcin fisiolgica in vivo ha sido criticado, ya que se presentan problemas de caracterizacin por la alteracin del desarrollo celular; la proliferacin in vitro no se presenta de igual manera a la de in vivo, debido a la reduccin de la relacin clula-clula y la interaccin matrizclula por la no presencia de la heterogeneidad y la estructura tridimensional de las clulas hallada in vivo, adems porque el medio hormonal y nutricional se ve alterado. Esto crea un ambiente que favorece la difusin, migracin y proliferacin de clulas no especializadas, pero no a la expresin de funciones diferenciadas. La provisin de un ambiente apropiado, nutriente, hormonas y sustratos son fundamentales para la expresin de funciones especializadas (Brand, et al., 1997). En un cultivo celular la mayora de las clulas crecidas a partir de un tejido slido disgregado o de un subcultivo tienen la capacidad de adherirse en monocapa, transformarse o anclarse independientemente. Esta adherencia celular es mediada

por receptores celulares especficos de superficie en la matriz extracelular y la dispersin celular podra ser precedida por la secrecin de protenas de matriz extracelular y proteoglicanos por parte de la clula. Las clulas se pueden anclar y difundir en el vidrio donde se cultivan por medio de ligeras cargas negativas y al plstico, como el poliestireno, si tienen una propiedad o tratamiento con descargas elctricas o con radiacin ionizante de alta energa. El cultivo en vidrio o plstico provee condiciones favorables para el crecimiento y anclaje celular (Freshney, 1995). El crecimiento de las clulas en un cultivo celular primario depende de la supervivencia de stas a las diferentes tcnicas de disgregacin y a la capacidad de adherirse al sustrato o de sobrevivir en suspensin. Si el cultivo primario es mantenido por pocas horas podra ocurrir un paso de seleccin futuro. Las clulas capaces de proliferar podran aumentar, otros tipos de clulas podran sobrevivir pero no aumentar y otras podran ser capaces de sobrevivir en condiciones especiales. Adems el crecimiento celular va ligado al espacio del cultivo, ya que unas clulas detienen su crecimiento, mientras que otras lo incrementan (Freshney, 1995). Se cultivan clulas de plantas, animales y humanos en un caldo de cultivo en el laboratorio. Las clulas de humanos y tejidos se pueden obtener de biopsias, postmortem, placentas o de procedimientos quirrgicos. Se pueden cultivar una amplia variedad de cultivos de clulas, as como clulas de cncer y sangre humanas para investigar cmo los virus provocan infecciones; las clulas de la placenta humana se pueden utilizar para probar si los medicamentos pueden atravesar la placenta, o clulas de las articulaciones humanas para estudiar medicamentos contra el reuma. Los cultivos de clulas y tejidos pueden ser altamente sensibles a las sustancias qumicas y permitir a los investigadores estudiar partes del cuerpo especficamente identificadas. Se han utilizado cultivos de clulas en investigaciones para el cncer, el Parkinson, SIDA, desarrollo de medicamentos, toxicidad y Alzheimer. Son el producto de la coleccin de clulas vegetales o animales de diferentes rganos, colocadas en condiciones especiales propicias para su sobrevivencia y multiplicacin, manteniendo para esto todas sus funciones metablicas de una manera semejante a las que tena en el husped. Los cultivos de clulas animales se han clasificado de acuerdo a su capacidad de anclaje (adherencia), y as han sido aisladas recientemente de un rgano determinado o si provienen de clulas que han sufrido modificacin. De acuerdo a su capacidad de adherencia o no a una superficie determinada pueden crecer formando monocapa o en suspensin respectivamente, lo que est muy asociado con el tipo de clula de la cual derivan: por lo general las clulas provenientes de rganos, crecen en monocapa; igualmente existen clulas que pueden crecer indistintamente tanto en monocapa como en suspensin, ejemplo son las clulas HeLa que son clulas transformadas derivadas de cultivos en monocapa. Cuando el cultivo proviene de clulas que han sido disgregadas de un tejido original tomado de un rgano de un animal recin sacrificado, reciben el nombre de Cultivo Primario. Cuando ste cultivo primario es sometido a procesos de transformacin que le confiere capacidad ilimitada de multiplicacin, reciben el nombre de Lneas Celulares. Cuando de un cultivo primario genera otro tipo de clulas que se pueden separar recibe el nombre de Cultivos Secundarios.

Cuando en el cultivo coexisten dos tipos de clulas de linajes diferentes que se pueden separar recibe el nombre de Cocultivo.

1.1.4.2. Tipos de cultivo celular

CULTIVOS EN MONOCAPA Las clulas exhiben una variedad de "comportamientos sociales", permitiendo la formacin de una monocapa que cubrir la correspondiente superficie de crecimiento (confluencia), lo que hace que su multiplicacin sea inhibida cuando establecen contacto entre s (quiescencia). Las clulas provenientes de cultivos primarios son las que mejor crecen en sta condicin, dada su estabilidad gentica y su naturaleza diploide normal. Los recipientes para el cultivo de clulas estacionarias son cajas de Petri, frascos para el cultivo de tejido (Roux), entre otros, que pueden ser de material de plstico o de vidrio previamente tratado y su desprendimiento para transferirlas a superficies mayores se realizan con agentes proteolticos como la tripsina. CULTIVOS EN SUSPENSION Las Lneas celulares que provienen de cultivos primarios con requerimiento de anclaje a superficies, tienen la propiedad de crecer de manera estacionaria o en suspensin despus de un perodo de adaptacin Existe evidencia experimental que los sistemas en suspensin tambin requieren de matrices que son macromolculas, que sirven de protectores a la superficie celular; stas macromolculas se encuentran en el suero, el cual contribuye igualmente con el medio de cultivo, proporcionando un sistema balanceado de nutrientes. Dentro de stas matrices est el Methocel, esencial para el crecimiento de cultivos en suspensin. Aunque el cultivo estacionario es ideal cuando se busca la elaboracin de productos extracelulares, el cultivo en suspensin es deseable cuando los productos son intracelulares o cuando se presentan problemas con la capacidad de anclaje de un determinado tipo de clula. El proceso de cultivo continuo ofrece factores econmicos decisivos (utilizacin de mejores equipos, reducida manipulacin) cuando se trata de producir cultivos a una mayor escala de operacin. CULTIVOS PRIMARIOS Los cultivos primarios tienen caractersticas especiales que los diferencian de las lneas celulares: conservan la morfologa de las clulas del rgano del que fueron aisladas, sus cromosomas tienen un nmero diploide (2n), su crecimiento in vitro es limitado y hay inhibicin por contacto. El estar ms cercanas a las clulas que las originaron, se ve reflejado en una mejor actividad y funcionalidad similar a su ambiente natural, por lo que en aislamientos primarios de cepas virales stas tienen mayor sensibilidad que una Lnea Celular ya establecida. Igualmente para la produccin de vacunas los cultivos primarios son recomendables por tener una baja probabilidad de que se transformen en malignos.

Dentro de las desventajas est la de una mayor probabilidad de presentar virus adventicios o latentes, lo que implica el desarrollo de la adecuada tecnologa para el control de calidad. LINEAS CELULARES Las Lneas Celulares continuas estn formadas por clulas que se diferencian gentica y morfolgicamente de las clulas de las cuales se originaron. Pueden provenir de clulas que se derivan de tumores o de un proceso de transformacin de un cultivo primario mediante transfeccin con oncogenes o con tratamiento con carcinogenticos, lo que les confiere un nuevo fenotipo. Este tipo de cultivo tiene la caracterstica de no tener inhibicin por contacto y de crecer de manera indefinida. El paso de un cultivo primario a lnea se denomina transformacin. Una transformacin puede inducirse fisiolgicamente (interaccin celular, polaridad) a travs de hormonas como la hidrocortizona o utilizando inductores no fisiolgicos como el DMS. CULTIVOS TRIDIMENSIONALES Son aquellos que buscan mantener la caracterstica o arquitectura del tejido in vivo. Los sistemas tridimensionales permiten estudiar la proliferacin y morfologa epitelial y su interaccin con otras clulas como son las del tejido conectivo; igualmente con ellos se puede evaluar el efecto de sustancias que pueden influenciar en tales interacciones intercelulares. Actualmente se producen Kits drmicos comerciales con base en cultivos, que permiten evaluar la citotoxicidad de componentes qumicos presentes en lociones, preservativos, detergentes, perfumes, shampoos y solventes entre otros. Los intentos de produccin de ste tipo de cultivo van desde el uso de telaraa (Harrison, 1914), pasando por el crecimiento de explantes en esponja de celulosa, (Leighton, 1951), as como la utilizacin de fibras de slica (Curtis y Varde, 1964) o de mallas de colgeno hidratado (Elsdale y Bard, 1972). El mtodo desarrollado por Bergenholtz (1977) es uno de los que mayor informacin han dado en cuanto a visualizacin de morfologa celular. Mediante ste sistema, se colocan trocitos de superficie epitelial sobre una membrana de Millipore, sistema que se deposita sobre una plataforma y sta en una caja de Petri con medio de cultivo. El cultivo in vitro de tejidos vegetales ha sido visto como la opcin para producir metabolitos secundarios (Balandrn et al., 1985). Sin embargo, con excepcin de contados casos, la desdiferenciacin de los tejidos vegetales, para producir callos o clulas en suspensin, se ve acompaada de una disminucin en su capacidad para producir estos compuestos (Barz et al., 1977, Aird et al., 1988). No obstante esta dificultad, los cultivos de clulas y rganos derivados de plantas productoras de metabolitos secundarios son cada vez ms utilizados como modelos para estudiar la biosntesis de compuestos con actividad farmacolgica, as como los mecanismos que regulan su sntesis (Kutchan et al., 1991). El cultivo de rganos permite la ampliacin de un cultivo de clulas de tejido no disgregadas a un cultivo tridimensional que muestre en algo o en todo las caractersticas histolgicas de los tejidos in vivo, para esto se utiliza un medio con interfase lquido gaseosa.

El cultivo de cortes de tejido el cual utiliza fragmentos de tejidos colocados en vasos de vidrio o plstico con un medio con interfase lquida que va a promover la migracin de las clulas cultivadas hacia un plano slido provisto de un sustrato especfico para cada clula (Freshney, 1995). El cultivo de clulas dispersas en suspensin se refiere al cultivo de clulas tomadas del tejido original, de cultivos primarios de clulas o de una lnea o cadena celular por disgregacin enzimtica, mecnica o qumica, este cultivo necesita de una monocapa adherente o un sustrato slido que le provea a las clulas un medio adecuado para desarrollarse. Se realiza tambin el cultivo primario en el cual las clulas han sido reasociadas para recrear la estructura tridimensional del tejido; esto realizado por perfusin y por el crecimiento de una monocapa, la reagregacin en suspensin, o la infiltracin de una matriz tridimensional como el colgeno. Derivado del cultivo anterior encontramos el cultivo secundario en el cual se cultivan diferentes provenientes de una misma, es el caso de los cultivos de astrocitos donde se puede obtener, en un mismo cultivo, crecimiento de los tipos I y II de stas clulas. En la actualidad se estn realizando cultivos que permiten la recombinacin de clulas de diferentes linajes como los queratinocitos de la epidermis en combinacin con los fibroblastos de la dermis; a estos cultivos se les denomina cocultivos (Frashney, 1995). Dentro de estos cultivos encontramos los cultivos de neuronas y astrocitos en conjunto, en los cuales se ha confirmado el ciclo de la glutamina-glutamato por medio de anlisis de los istopos del glutamato y la glutamina, donde la glutamina es producto de los astrocitos y el glutamato y el aspartato producto de las neuronas. Adems, se ha estudiado el acetato en estas clulas, el cual es metabolizado por ambas clulas, neuronas y astrocitos (Brand, 1997). El cultivo de clulas transformadas generalmente se obtiene por la inyeccin de un carcingeno, despus de una serie de cultivos alternados y pasaje por animales (Benda, et al., 1968; McMorris, et al., 1973). Estas lneas celulares son capaces de desempear sus funciones rgano especficas generalmente durante el perodo de un ao. La forma de estas clulas depende en gran parte, de las condiciones del cultivo utilizadas. Las clulas que crecen en cultivos en suspensin son casi siempre redondas con pocas prolongaciones. Sin embargo, cuando las clulas de origen cerebral crecen sobre superficies planas muestran una diversidad morfolgica notable, con prolongaciones celulares y neuritas, que se forman con facilidad, mientras que los cuerpos celulares adoptan una forma alargada (ATCC, 1992; Benda, et al., 1968).

1.1.4.3.

Ventajas

del

cultivo

celular

Las dos principales ventajas cuando se utilizan los cultivos celulares son: el control del medio fisicoqumico, a saber, pH, temperatura, presin osmtica, tensin de oxgeno (O2) y gas carbnico (CO2) de las clulas cultivadas y, las condiciones fisiolgicas que deben ser constantes. La mayora de las lneas celulares

requieren para su buen desarrollo de suplementos en el medio en que se cultivan, ejemplo de esto es el suero, el cual provee infinidad de elementos como hormonas y otras sustancias reguladoras (Borg, et al., 1985). El control del medio fisicoqumico y de las condiciones fisiolgicas permiten el cultivo de clulas especficas. Los cultivos de clulas permiten someter a las mismas a una baja y definida concentracin de reactivos asegurando un acceso directo en ellas, lo que ahorra en un 90% lo requerido para la inyeccin del reactivo in vivo, su excrecin y su posterior distribucin a los tejidos en estudio. Aunque los estudios in vivo resulten ms econmicos que los in vitro son descartados porque el uso de la experimentacin en animales resulta cuestionado en aspectos legales, morales y ticos (Freshney, 1995). Permiten el estudio del transporte y la utilizacin de metabolitos.

1.1.4.4. Desventajas del cultivo celular

Las tcnicas de cultivo celular necesitan unas estrictas condiciones de asepsia porque las clulas animales crecen menos rpido que la mayora de los contaminantes comunes como las bacterias, los mohos y las levaduras. Adems las clulas precedentes de animales no pueden desarrollarse en medios de cultivo, por lo que es necesario agregar a los medios suplementos como suero, plasma y fluidos intersticiales, entre otros para de una manera u otra proveer a las clulas cultivadas un medio semejante al in vivo (Freshney, 1995). Una mayor limitacin en el cultivo de clulas es el gasto de esfuerzo y materiales para la produccin de una pequea cantidad de clulas o de tejido. Los costos de producir clulas en cultivo son diez veces ms que el uso de tejido animal, ya que se invierte bastante en ensayos o procedimientos preparativos que pueden ayudar en la estandarizacin del proceso reduciendo tiempo de manipulacin, volmenes de muestra, tiempos de centrifugacin, etc. (Brand, et al., 1997). En los cultivos celulares se dificulta relacionar las clulas cultivadas con las clulas funcionales ubicadas en el tejido del cual son derivadas, esto por que en la mayora de los casos presentan propiedades muy diferentes; para esto es necesario utilizar marcadores de clulas los cuales van a ser de gran ayuda en el momento de caracterizarlas en cultivo porque van a garantizar que las clulas crecidas en cultivo son las mismas que se sembraron y no otras. Adems, suelen presentarse problemas de inestabilidad gentica cuando se realizan varios pases de cultivos de clulas no transformadas, lo que va a originar una gran heterogeneidad en el crecimiento de las clulas y en su diferenciacin (Driscoll, et al., 1993).

Usos

de

los

cultivos

celulares

Para el estudio de clulas especficas, cmo crecen, qu necesitan para su crecimiento, cmo y cuando dejan de crecer, como es su bioqumica. Para investigaciones sobre el ciclo celular, el control del crecimiento de clulas tumorales y la modulacin de la expresin gentica. Para la bsqueda de modelos experimentales para estudios de la biologa del desarrollo y la diferenciacin celular. Tcnicas de cultivo celular para la insercin de genes extraos en las clulas receptoras (animales transgnicos). La tecnologa de la fusin celular y los ensayos de citotoxicidad son tcnicas de cultivo celular.

SELECCIN

DE

LA

ESPECIE

Especie: Ratas albinas Parametros de control biotico: Ejemplo: Neonatos, 1 da Parametros de control abiotico: libitum).

Wistar. Exocriadas o endocriadas. Tiempo de desarrollo (gestacin), sexo y peso. de vida postnatal (5.830.05 g, n=132). luz-oscuridad, humedad, temperatura y dieta (ad

Niveles

normas

de

seguridad
(ATCC)

American Type Culture Collection http://www.atcc.org/SearchCatalogs/AllCollections.cfm

Nivel 1. No presentan peligros reconocidos cuando se utilizan en condiciones normales. Nivel 2. Se emplean para materiales de origen primario humano que no se conoce el riesgo de infeccin o que tienen la posibilidad de que en las muestras contengan VIH, TBC, hepatitis B u otros patgenos. Nivel 3. Su manejo pueden Nivel 4. Extremadamente peligrosos. EN presentar un riesgo potencial.

QUE CONSISTE UN LABORATORIO DE CULTIVOS CELULARES Un laboratorio de cultivo celular debe contar con una infraestructura bsica en la cual se disponga de reas independientes para llevar a cabo la preparacin y esterilizacin de medios y reactivos, un espacio independiente para el proceso de lavado y preparacin de material y un rea propiamente destinada al trabajo con cultivos celulares. Dentro de la infraestructura fsica bsica se debe contar con sistemas de refrigeracin y congelacin, incubadoras, centrfugas, balanzas, microscopios y cabinas de flujo laminar.

Adicionalmente, se debe disponer de un buen suplemento de material plstico y de vidrio y con sistemas de esterilizacin apropiados para los diferentes tipos de reactivos y material utilizados. Desde el punto de vista de los sistemas de esterilizacin se pueden citar los siguientes: Calor Hmedo: Mediante el empleo de autoclaves los cuales proporcionan una temperatura de 121oC y una presin de 15 lb. Utilizados para la esterilizacin de soluciones cuyos componentes no se degradan por ste mtodo, material plstico y de vidrio y equipos de filtracin. Calor Seco: Lo constituye el uso de hornos a temperatura de 200C por espacio de 3 horas. Es empleado para la esterilizacin de material de vidrio particularmente. Filtracin: A travs del uso de equipos con membrana de nitrocelulosa o acetato de celulosa con poro de 0.22 0.1 mm de dimetro, mediante la aplicacin de presin positiva o negativa. Por ste sistema se esterilizan la mayor parte de los medios de cultivo, suero, solucin de antibitico-antimictico y suplementos.

Contaje

celular

Para la siembra de las clulas se deben tener en cuenta los siguientes clculos: Porcentaje de viabilidad (%) = Nmero de clulas vivas/Nmero de clulas totales *100 (>85-90% se siembra). *Nmero de clulas vivas/ml = Clulas contadas vivas x factor de dilucin x 104 *Nmero de clulas necesarias = Nmero de placas x la mitad del volumen de cada placa x clulas viables (1.350.000 para neuronas). Nota: Hemocitmetro o cmara de Neubauer, aparato para hacer contajes en el microscopio. El papel del suero, especialmente fetal bovino en el establecimiento y mantenimiento de lneas y cultivos celulares, es fundamental; cuando estos se han establecido en medios libres de suero, el crecimiento celular requiere, la suplementacin con hormonas y otros factores de crecimiento que estn involucrados en transporte de nutrientes, mantenimiento de balance de energa celular, control de sntesis de macromolculas y factores que estimulan la formacin del producto deseado. Para un experimento de cultivos con antelacin se debe tener en cuenta dos aspectos importantes: PROGRAMACION TIEMPOS Debido a la extensin de un cultivo, en cultivos primarios se debe programar el tiempo de un experimento desde el momento en que se cruzan los animales para obtener el tejido necesario para los experimentos. PROGRAMACION TAMAO DE MUESTRA Los cultivos celulares son realizados con diferentes replicaciones para permitir la conversin de experimentos heterogneos, cuando se realiza un solo cultivo, en experimentos homogneos o uniformes, cuando se realizan varios cultivos (replicaciones) cada uno con muestra y caractersticas de cultivos idnticos.

Cuando las replicaciones experimentales sean virtualmente idnticas, la necesidad del anlisis de varianza como estadstica se reduce (Cohen, 1995).

Comparacin de dos grupos (medias).