Introduccin a la Biologa Molecular y Celular Trabajo Prctico N 2 Preparacin de ADN plasmdico de Escherichia coli Introduccin Un plsmido es una molcula

de ADN circular de doble cadena que no forma parte del genoma del organismo en el que se halla. Este organismo puede ser una bacteria, en el cual se encuentra superenrollado y es de tamao variable, o en algunas clulas eucariotas. Los efectos de un plsmido son variados: algunos confieren a la clula caractersticas adicionales que de otro modo la misma no poseera, otros son nocivos para ella. Si bien la replicacin de los plsmidos es autnoma respecto de la del ADN genmico, depende de muchos factores de su hospedador para llevarse a cabo, tales como las enzimas ADN girasa y ADN polimerasa. Durante la divisin celular segregan azarosamente a las clulas hijas, lo que hace que su frecuencia en las sucesivas generaciones de clulas flucte con el tiempo. Adems, el nmero de rplicas est regulado por un represor que est codificado en el mismo plsmido. Dos plsmidos son incompatibles si, en ausencia de una presin selectiva, no pueden coexistir debido a la competencia por la maquinaria replicativa y el mecanismo represivo. Uno de los dos conseguir desplazar al otro y permanecer en la clula. La utilidad que se les da en la biologa molecular tiene que ver con la clonacin y el control de expresin de genes bacterianos. Objetivo El propsito del experimento llevado a cabo en clase fue la obtencin de ADN plasmdico (especficamente, pBluescript II de alto nmero de copia) proveniente de una cepa de bacterias de Escherichia coli. Fundamento del procedimiento Para poder aislar el ADN plasmdico de los dems componentes dentro de la bacteria, en primer lugar se nos entreg una cepa de bacterias suspendida en una solucin (1) de un sistema buffer, para mantener un pH constante, y un quelante, para secuestrar los cofactores de las enzimas que ms adelante podran degradar el ADN que se busca conservar. Simultneamente recibimos otras dos soluciones (2 y 3). La segunda solucin era alcalina y contena un detergente inico. La tercera solucin era cida. Primero mezclamos volmenes iguales de las soluciones 1 y 2, lo que caus la lisis de las bacterias, la desnaturalizacin de protenas y cidos nucleicos y la liberacin de lpidos, glcidos y dems componentes celulares, debido al aumento de pH en el medio. El propsito del detergente era solubilizar los lpidos y contribuir a la desnaturalizacin proteica, facilitando el futuro acceso al ADN plasmdico. Lo siguiente, luego de cinco minutos de incubacin a temperatura ambiente, fue mezclar este sistema resultante con un volumen de la solucin 3 igual a los volmenes de las dos primeras. Esto baj el pH del medio y ocasion la renaturalizacin total del ADN plasmdico (que no se fragmenta gracias a su

pequeo tamao, a diferencia de las grandes molculas de ADN genmico) y parcial del resto de los cidos nucleicos y las protenas, que formaron una malla blanca entre s. Con el objetivo de separar el ADN plasmdico del resto de las molculas sometimos la muestra a centrifugacin durante quince minutos. Como consecuencia obtuvimos un pellet y una capa superior de residuos y, por otro lado, un sobrenadante con el ADN deseado, ARN celular y algunas sales. ste fue trasladado a otro tubo de Eppendorf al cual aadimos isopropanol que, al ser un alcohol con polaridad menor que el agua, disminuy la solubilidad del soluto, lo que hara ms fcil la precipitacin en la prxima centrifugacin. De la misma se obtiene el pellet de ADN plasmidico y ARN y un sobrenadante que se descarta. Luego, se procede a lavar el pellet resultante con etanol 70%, alcohol que, debido a su polaridad intermedia permite disolver muchas sales de esta solucin sin disolver el ADN y garantizar una mayor pureza en la muestra. Realizamos una ltima centrifugacin, extrajimos con una pipeta el exceso de etanol y dejamos secar el pellet dentro del Eppendorf con la tapa abierta. Para conservar la muestra, ya que en un futuro la usaremos para la segunda parte del experimento, la disolvimos en 20 ml de agua MilliQ que, en nuestro caso, contena 1l de RNasa 10mg/ml, que degradar el ARN completando el aislamiento del ADN plasmdico. Esta ltima solucin se guarda a -20 C. Respuestas al cuestionario 1. En condiciones normales los plsmidos no son indispensables para la vida del organismo (bacterias y algunos eucariotas) en el cual se encuentran. Sin embargo, en algunos casos pueden cumplir funciones importantes o favorables para la vida del mismo en caso de conferirle a la clula caractersticas necesarias para la supervivencia en el determinado medio donde se hallen. 2. La incompatibilidad plasmdica es un fenmeno en el cual dos plsmidos, en ausencia de una presin selectiva, se ven imposibilitados de coexistir dentro de una misma clula. Al compartir los mecanismos de replicacin, por ejemplo el ORI, comparten a su vez los mecanismos de represin. De esta manera, existe naturalmente una competencia entre ambos plsmidos para permanecer, al cabo de sucesivas generaciones, dentro de la clula, siendo el restante excluido de la misma. 3. En biologa molecular, los plsmidos son frecuentemente utilizados para ser clonados (vectores de clonado), o bien para expresar un gen determinado (vectores de expresin). En el primer caso, son incorporadas en los plsmidos las secuencias de ADN genmico que se quieren clonar y amplificar. De esta manera, al cultivar esta bacteria en medio slido, se obtendrn colonias provenientes de un nico organismo y al multiplicarse el nmero de plsmidos, tambin lo hace el numero de bacterias. En el segundo caso, adems de colocarse en los plsmidos los insertos de ADN correspondiente, se incorporan secuencias regulatorias y/o promotoras para controlar la expresin de dicho gen. 4. ORI: es el origen de replicacin, la secuencia que da lugar a la rplica de la totalidad de la molcula. Es de alto numero de copias, es decir presenta entre 20 y 200 copias del plsmido por clula. Gen bla(APr): segmento del plsmido que codifica para una enzima (lactamasa) que, degradando la ampicilina, le permite a la bacteria sobrevivir en

un medio en presencia de este antibitico. MCS (o polylinker): en esta porcin existen secuencias nicas en todo el plsmido que pueden ser reconocidas por diversas enzimas de restriccin. Promotores (Pt3 y Pt7): provenientes de los fagos T3 Y T7, respectivamente, permiten disear primers especficos al ser conocida su secuencia. Por otro lado, permiten dirigir la transcripcin del plsmido en ambos sentidos bajo las condiciones adecuadas. Lac Z: seccin del plsmido que codifica para una enzima (-galaxtosidasa) degradadora de lactosa que, en presencia de un sustrato (X-gal) reacciona generando un producto de color azul (normalmente, los productos son blancos). Esto permite distinguir las bacterias que fueron transformadas o no con plsmidos recombinantes. F1: origen de replicacin viral para obtener ADN simple cadena. 5. Electroforesis en gel: es un mtodo de laboratorio que permite separar molculas segn su peso. El material del gel vara segn las molculas a estudiar, por ejemplo: las muestras de ADN y ARN se aplican a un gel de agarosa, mientras que las protenas se analizan en un gel de poliacrilamida. Lisis alcalina: mtodo explicado en el informe. 6. Para separar el ADN de las protenas y lpidos se solubiliza a los ltimos con detergentes y se recurre a la centrifugacin, y para separar el ARN del ADN, una solucin con RNasa o DNasa, dependiendo de lo que se quiera aislar. 7. El pellet que obtendremos en el paso 9 ser ms grande y por lo tanto ms fcil de ver y manipular, ya que el fin del experimento es obtener la mayor cantidad de ADN plasmdico. 8. La solucin 1 es utilizada para suspender a las bacterias y disminuir su actividad enzimtica y metablica. La solucin 2 tiene como funcin lisar definitivamente a las mismas y liberar todos sus componentes al medio para luego ser separados. La solucin 3 es cida y equilibra el pH permitiendo la renaturalizacin total del ADN plasmdico y, en parte, de las dems molculas. 9. Para aumentar la pureza de la preparacin se agrega una solucin alcalina que desnaturalice tanto el ADN como las protenas, para luego, utilizando una solucin cida, el ADN plasmdico se renaturalice totalmente y las protenas no en su totalidad. Lo siguiente es la centrifugacin. Si la solucin, adems tiene un alto contenido salino es posible lavar el pellet de ADN con etanol 70%, el cual, al tener una polaridad intermedia entre otros alcoholes y el agua, es capaz de disolver muchas sales sin disolver el ADN. Tambin debe ser secado para que no queden restos de alcohol.