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1
Introduccin a las tcnicas de
fluorescencia (2)
2
1. Un poco de historia..los inicios de la fluorescencia en
biologa
2. Ensayos de fluorescencia en cubeta (con ejemplos):
a. Caractersticas de los espectros de fluorescencia:
Regla de la imagen especular, corrimiento de stokes
b. Instrumentacin
c. Tiempo de vida.
Bibliografa general
1. Molecular Fluorescence: Principles and Applications. Bernard Valeur,
Wiley-VCH
2. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Joseph Lakowicz. Plenum Press,
New York
Temas de la clase pasada:
2
3
Temas de la clase de hoy:
a. anisotropa de fluorescencia
b. Quenching (desactivacin) de fluorescencia
c. FRET (Transferencia de energa por el mecanismo de
Frster)
4
Anisotropa: Momento de una transicin electrnica
fluorforos
Luz polarizada linealmente: el vector E oscila en un plano determinado
Momento de la transicin: durante una transicin electrnica los e
-
se
"desplazan": el momento dipolar del estado fundamental y el excitado puede ser
distinto, generando un momento dipolar transitorio, asociado a la transicin.
Para que se produzca la transicin el momento de la transicin debe tener
un componente paralelo al plano de la luz polarizada
Fotoseleccin
excitacin
3
5
Bagatolli y col. Biophys J 1999
Para pensar: porqu la intensidad de fluorescencia
no es homognea?
Giant unilamellar vesicles (GUVs) marcadas con una sonda fluorescente
lipdica que se intercala en la bicapa.
Se observan por microscopa de fluorescencia con excitacin por 2 fotones
(por ahora no nos importa). Se utiliza un lser (polarizado) y slo se detecta
fluorescencia de el anillo central de la vescula
6
Anisotropa de fluorescencia: Principios
Polarizador
de excitacin
Polarizador
de emisin
Molcula
fluorescente
Detector
4
7
Definicin de anisotropa de fluorescencia (r)

=
I I
I I
r
ll
ll
2
muestra
Polarizador de
excitacin
Polarizador de
emisin
-0.2 < r < 0.4 (para molculas
random)

+ = I I I
ll
total 2
A veces se usa tambin el parmetro polarizacin (P)

=
I I
I I
P
ll
ll
1
3
1 1
3
2

|
.
|

\
|
=
P
r
8
r
o
/
r
r
| t +
=
1
Ecuacin de Perrin
ro= anisotropa intrnseca
|
r
= tiempo de correlacin rotacional
t = tiempo de vida de la sonda
q= viscosidad
V= volumen de la partcula (esfrica)
k= constante de Boltzmann
T= temperatura
v
1
= volumen especfico del H
2
0 (1.0018 cm
3
/g)
v
2
= volumen especfico de la protena (0.73 ml/g)
o = grado de hidratacin
protenas esfricas
) (
kT
Mr
kT
V
r
1 2
ov + v
q
~
q
= |
5
9
Aplicaciones: Determinacin del volumen molecular
|
|
.
|

\
| t
q
+ =
|
|
.
|

\
|
|
t
+ =
V
k T
r r r
o r o
1
1
1
1 1
r
-1
T/q
r
o
-1
kt/V
10
La anisotropa puede sensar la dinmica local y/o
global de la molcula
Rotational Modalities
(a) overall dimer rotation
(b) movement of one C-domain relative to other domains
(c) movement of dye molecule around its point of
attachment
6
11
Otras aplicaciones de anisotropa de fluorescencia:
Determinacin del binding de calmodulina del pptido RS20
(la secuencia del pptido correspondiente a la regin de unin a
calmodulina de la myosin kight-chain kinasa)
* El pptido tiene un residuo Trp (Cam tiene slo 1 Tyr)
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Determinacin de anisotropa de fluorescencia (formato L)
Monocromador
de excitacin
muestra
Monocromador
de emisin
detector
Fuente de excitacin
Polarizador
de excitacin
Polarizador
de emisin
Esquema de
espectrofluormetro
7
14
hh
hv
vh
vv
vh
vv
I
I
G ,
GI I
GI I
r =
+

=
2

=
I I
I I
r
ll
ll
2
Los monocromadores transmiten con distinta
eficiencia luz polarizada vertical u horizontal.
Para el formato L:
Determinacin de anisotropa de fluorescencia
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Procesos intermoleculares que afectan a la
fluorescencia
F* + Q
k
products
8
16
Quencher (Q): molecule that provides a non-radiative path
for deactivation of the fluorophore
Quenching: 2 posibles (pero no nicos) mecanismos
F* + Q
kq
F + Q + heat collisional
F + Q
Ks
F-Q
static
no fluorescent
Como cambia la intensidad de fluorescencia en estos dos
procesos?
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Se puede explotar estos fenmenos para estudiar biomolculas
Ejemplos:
9
18
Quenching dinmico
] Q [ k
I
Io
o q
t + = 1
Stern-Volmer equation
Kd
F* + Q
kq
F + Q + heat
F*
kr
F + photon
F*
knr
F
Io, in the absence of quencher
19
Quenching dinmico
La constante de quenching va a depender de la
frecuencia y efectividad de los choques entre Q y F
ko f k
q q
=
eficiencia del
choque
R=radio de choque (Rf+Rq) [cm]
D
i
= coeficiente de difusion de i [cm
2
/s]
N = nro de Avogadro
ko = [M
-1
s
-1
]
10
20
Collisional Quenching: Applications
lipid vesicle
lisozyme
4 PC vesicle
7.8 buffer
Kd (M
-1
) condition
Gorbenko et al, Biophysical Journal 93:140-153 (2007)
acrylamide
21
Io, in the absence of quencher
Quenching esttico
] Q [ K
I
Io
s
+ = 1
Stern-Volmer equation
F*
kr
F + photon
F + Q
Ks
F-Q
no fluorescente
F*
knr
F
11
22
Diferencias entre quenching esttico y dinmico
1) Tiempo de vida
2) temperatura
3) alguna otra forma?
La forma de la curva es igual para dinmico y esttico..como
se pueden diferenciar?
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Mtodos radiomtricos: determinacin de [Cl
-
] por quenching
2 sondas en 1 molcula
aceptor de e-
(quenchea por Cl
-
)
dador de e- (no se
quenchea)
Jayaraman y col. Am J Physiol (1999)
12
25
Qu est pasando?
27
FRET (Frster resonance energy transfer)
A todos nos encanta FRET...por qu?
Sirve para ver asociaciones
Medir distancias en el rango de los
Determinar cambios conformacionales
y muchas cosas mas
En qu consiste FRET?
D*-A
k
t
D-A*
Es un mecanismo de quenching, con propiedades muy interesantes
Ojo! no hay emisin y reabsorcin de fotones! Es una interaccin dipolar
13
28
Porqu es tan lindo FRET?
6
1
(

=
t
r
R
kt
o
o
D
D* -A
k
t
D-A*
Agregamos esta reaccin a las anteriores y calculamos |t:
D*
kr
D + photon
D*
knr
D
Considerando una nica distancia fija r entre D y A
6 6
6
r R
R
o
o
T
+
= |
29
Resonance energy transfer
6
1
(

=
t
r
R
kt
o
o
D
6 6
6
r R
R
kr) (knr k
k
o
o
t
t
T
+
=
+ +
= |

1/t
o
D
D* + A
kt
D +A*
D* D + photon
kr
D*
D
knr
t
o
D
= donor lifetime, no acceptor
14
30
0 20 40 60
0.0
0.5
1.0
|
T
r ()
Ro
6 6
6
r R
R
o
o
T
+
= |
Resonance energy transfer
Ro = Frster distance
range of FRET: 10-100
El fenmeno de FRET ocurre a distancias moleculares
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Orientation
factor
Overlap integral
}

c
t
| k
=
0
4
4 4
2
6
128
10 9000
d ) ( ) ( I
n N
) (ln
R
A D
A
o
D
o
La distancia de Forster
15
32
}

c
0
4
d ) ( ) ( I
A D
Integral de solapamiento
F
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
e
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e

Para calcularla, normalizar el espectro de fluorescencia:


}

=
0
1 d ) ( I
D
33
Factor de orientacin
K
2
= factor de orientacin
K
2
= 4 (colineales)
K
2
= 2/3 (random)
K
2
= 0 (perpendicular)
K
2
= 1 (paralelos)
|
DA
=ngulo entre los dipolos de emisin de D y de absorcin de A (|
T
)
|
A(D)
= ngulo entre el dipolo del A(D) de la transicin y el vector de
separacin
Pregunta: cmo verificaran experimentalmente que K
2
=2/3?
16
34
0 20 40 60
0.0
0.5
1.0
|
T
r ()
Ro
6 6
6
r R
R
o
o
T
+
= |
Resonance energy transfer
Ro = Frster distance
range of FRET: 10-100
35
Consecuencias de FRET: estado estacionario
Donor
excitation
Acceptor
I

Fluorescence of the donor


Fluorescence of the acceptor (at
ex, donor
)
Qu pasa con el t del donor?
17
36
1. Fluorescencia del donor (evaluada a
D
)
2. Fluorescencia del aceptor (evaluada a
em
)
Estado estacionario
D
o
D
D
) A ( D
) D
( FLUO
) A , D (
FLUO
T
I
I
A
A
=
u
u
= | 1 1
en general A
D(A)
= A
D
|
|
.
|

\
|

= | 1
) em , ( I
) em , ( I
) ( A
) ( A
A
o
A
D
A
T
demostrar esa ecuacin
Pista:
|
.
|

\
|
+ = | | ) em , ( A ) em , ( A C ) em , ( I
D T A A A
Pregunta: cual es el problema del mtodo 2?
absorcin
fluorescencia
D A


em

D
37
Tiempo de vida del donor
0 10 20 30
0.0
0.5
1.0
R
e
l
a
t
i
v
e

i
n
t
e
n
s
i
t
y
time (ns)
D
A , D
t nr r
t
T
k k k
k
t
t
| =
+ +
=

1
with FRET
D*+ A
kt
D + A*
D* D + photon
kr
D*
D
knr
Preguntas:
1. Cambia el tiempo de vida del aceptor?
2. Cmo vara I
A
vs t?
18
38
Aplicaciones 1: FRET en sensores biolgicos
Kraynov y col, Science 2000
39
Aplicaciones 1: FRET en sensores biolgicos
clulas que se mueven
clula quieta
alto FRET o I
bajo FRET o I
Kraynov y col, Science 2000
19
40
Aplicaciones 2: mecanismo de ATP sintasa
donor
acceptor
ATP synthase
Zimmermann et al. EMBO J (2005)
ADP + Pi
ATP
H
+
H
+
donor (TMR)
aceptor (Cy5 bis)
41
Aplicaciones 3: mecanismo de ATP sintasa
ATP s ATP s ntesis ntesis
ATP hidrlisis
Zimmermann et al. EMBO J (2005)
20
42
Homo-FRET
fluorescena
Hay solapamiento entre los espectros de absorcin y emisin
de la misma sonda, si el valor de k
2
y r son los adecuados:
D + D* D* + D
43
Homo-FRET
Cmo se detecta homo-FRET?
Intensidad?
Tiempo de vida?
Anisotropa?
21
44
Deteccin de la dimerizacin de Myo-VI en endosomas por
Homo-FRET
Altman y col. Plos Biol 2007
endosomas

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