II.

Enzimologa
Tema 4: Catlisis enzimtica.

D-Glucosa

Enzimas: conceptos generales

Hexoquinasa

1.-Unidades funcionales del metabolismo celular. Catalizadores de las reacciones biolgicas que no alteran la constante de equilibrio de las reacciones que catalizan. 2.-Protenas compuestas slo por aas, o tambin protenas con cofactores. 3.-Gran poder cataltico: reducen en rdenes de magnitud el tiempo necesario para que tenga lugar la reaccin.

D-Glucosa

Enzimas: conceptos generales

Hexoquinasa

4.-Presentan un alto grado de estereoespecificidad por el sustrato, lo cual deriva en ausencia de subproductos (alta eficacia de reaccin). 5.-Actan en soluciones acuosas en condiciones suaves de temperatura y pH: entorno fisiolgico. 6.-Su actividad puede regularse por varios mecanismos (nivel de sustrato, pH, Temperatura, reguladores alostricos, etc).

D-Glucosa

Importancia de los Enzimas en aplicaciones especficas

Hexoquinasa

1.-La medida de la actividad enzimtica en fluidos biolgicos o tejidos es importante para el diagnstico de muchas enfermedades. 2.-Muchos frmacos son inhibidores o moduladores de la actividad enzimtica. 3.-Importancia en la industria alimentaria, en la agricultura, en biorremediacin, etc.

D-Glucosa

Historia de los Enzimas

Louis Pasteur Eduard Buchner Hexoquinasa

1850. Estudios de Pasteur sobre fermentos de levadura que generan alcohol a partir de azcar. 1897. Buchner asla estos fermentos del organismo vivo, manteniendo actividad en forma soluble. 1907. Henri postula la existencia del complejo Enzima-Sustrato (ES), fundamental para la accin enzimtica. 1913. Michaelis y Menten proponen la Teora General de la Cintica Enzimtica. 1926. Summer cristaliza la ureasa, demostrando que los enzimas son protenas. 1930. Northop obtiene cristales de Tripsina y Pepsina. A partir de la segunda mitad del siglo XX se purifican y caracterizan millares de enzimas, lo que ha permitido conocer su mecanismo de accin.

Centro activo (sitio de unin + sitio cataltico)

Unin del sustrato por puentes de hidrgeno, interacciones hidrofbicas, puentes salinos, incluso enlaces covalentes transitorios Centro activo
D-Glucosa

Antes de la unin de glucosa

Despus de la unin de glucosa

Dimensiones relativas de una molcula de enzima de tamao medio (hexoquinasa, aprox. 100.000 Da, 7 nm de dimetro) y de una molcula de sustrato (D-glucosa, 180.2 g/mol, 0.8 nm de longitud)

Enzima no alostrico: Centro activo (sitio de unin + sitio cataltico)

Enzima alostrico: Centro activo y centro regulador

Modelos de unin E-S

S + E
k1 k -1

ES

Modelo de Llave y Cerradura (Fischer)

k2

P+E
Velocidad, Estereoespecificidad y Ausencia de subproductos

Modelo de Ajuste Inducido (Koshland)

Modelos de unin Enzima-Sustrato

Modelo de Llave y Cerradura (Fischer) 1894 Modelo de Ajuste Inducido (Koshland) 1958

Grupos funcionales en los sitios catalticos

D-Glucosa

Estructura de los Enzimas

Hexoquinasa

Grupo Prosttico (unin fuerte) Holoenzima: Apoenzima (parte proteica ) + Cofactor (unin dbil) Carcter inorgnico (iones metlicos) Cofactor: Carcter orgnico (NADH, FAD, Vitaminas, etc): Coenzimas Si un enzima precisa de cofactor, no puede desarrollar su funcin hasta que no une el cofactor, es decir, que sin cofactor el enzima NO ES FUNCIONAL

Cofactores inorgnicos: elementos traza

Coenzimas (Cofactores orgnicos)

De origen vitamnico (hidro/liposolubles): 1.-transporte de grupos: cido pantotnico o coA (acilos), Biotina (carboxilos), pirofosfato de tiamina (aldehidos), fosfato de piridoxal (aminos), cobalamina B12 (metilos), cido flico (fragmentos monocarbonados), Biocitina (CO2). 2.-transporte electrnico: Nucletidos de flavina, niacina, vitamina C cido ascrbico. Coenzimas:

De origen no vitamnico: 1.-transporte de grupos: trifosfatos de nuclesidos (fosforilo), ATP y UTP (adenina y uridina), CDP (Diacilgliceroles y aminoalcoholes activados), S-adenosil meteonina (metilos), etc. 2.-transporte electrnico: Ubiquinona (CoQ), cido dihidrolipoico, etc.

Ejemplos de coenzimas de origen vitamnico

NADH

FADH2

Ejemplos de coenzimas de origen no vitamnico

Ubiquinona

Adenosin trifosfato (ATP)

S-Adenosilmeteonina (SAM)

Ejemplo de catlisis enzimtica con cofactor

Activacin por Zn2+ de la proteasa carboxipeptidasa A

Carboxipeptidasa A: Hidrlisis de aas con grupos carboxilo libres

Nomenclatura vulgar:
SUSTRATO + TIPO DE REACCION + ASA

Nomenclatura Sistemtica (Enzimatic Comission)

D-Glucosa

Ejemplo de clasificacin: Hexoquinasa

Hexoquinasa

Reaccin que cataliza: ATP + D-Glucosa ---> ADP + D-Glucosa-6-fosfato. Nombre sistemtico: ATP:Glucosa Fosfotransferasa. Nombre trivial: Hexoquinasa. N E.C.: 2.7.1.1. 2: Transferasas. 7: Fostfotransferasas. 1: Fosfotransferasas con un grupo hidroxilo como aceptor. 1: D-Glucosa como aceptor del grupo fosfato.

Para toda reaccin qumica, catalizada o no, ha de cumplirse:

1.- Los sustratos deben colisionar. 2.- La colisin molecular debe ser en la orientacin adecuada. 3.-Los sustratos deben poseer suficiente energa para que se produzca la reaccin (Energa de Activacin) La energa de activacin es la energa expresada en caloras necesaria a una temperatura determinada, para llevar un mol de reactivos al estado de transicin. Es la diferencia de energa entre estado inicial y de transicin de la reaccin; A mayor energa de activacin, menor velocidad de la reaccin. El estado de transicin es aqul estado energtico de la reaccin en el cual todas las molculas del mol de reactivos tienen la misma probabilidad de experimentar la reaccin.

Energa de Activacin y Estado de Transicin

K equil.

- GES = - (HS-ES) + TSS-ES

Cintica enzimtica Estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas enzimticamente

v = [Producto] / t v = - [Sustrato] / t Para t determinado, v = Kprop[S]t

S + E
k1 k -1

Orden de la reaccin enzimtica

(a [Enzima] constante, estudios de [S] iniciales y v iniciales: primer 10% de la reaccin)

ES
v es independiente[S]

k2
V es dependiente [S]

P+E

Cintica enzimtica: Modelo Michaelis-Menten

Leonor Michaelis Maud Menten

Hiptesis I: Enzima, Sustrato y complejo ES estn en equilibrio.

(Paso limitante)

(KS = Kte disociacin complejo ES)

(Kcat = Kte catlisis)

Cintica enzimtica: Modelo Michaelis-Menten

Hiptesis II: Complejo ES se encuentra en estado estacionario.

(1)

(2)
= k1 [E] [S] k2[ES] k-1 [ES]

(3) Asumiendo que:

kcat es equivalente a k2 [Etotal] = [Elibre] + [ES] V max = k2[Etotal] a [S] saturante

(4) Obtenemos:

Cintica enzimtica: Modelo Michaelis-Menten

ES se encuentra en estado estacionario.

Cintica enzimtica: Modelo Michaelis-Menten ; ,

Hiperblica

Si [Sustrato] >>> KM, reaccin de orden cero (v es mxima) si [Sustrato] es <<< KM, reaccin de orden uno

Cintica enzimtica: Modelo Michaelis-Menten = VM max

K 1 [S]

+ V = aX +b = Y max

Inversos o Lineweaver-Burk (transformacin algebraica)

Cintica enzimtica: definicin de KM y grficas ; ,

El valor de la KM es caracterstico para cada enzima y mide la afinidad de sta por su sustrato

Hiperblica

Inversos o Lineweaver-Burk

Interpretaciones de Km
Relacin entre la constante de equilibrio del complejo ES y la constante cataltica. Concentracin de sustrato para la cual la velocidad de reaccin es semimxima. Concentracin de semisaturacin del enzima: medida de la afinidad del enzima por el sustrato. Concentracion que define el punto lmite entre reaccin de orden uno y de orden cero. Correspondencia con la concentracin fisiolgica de sustrato: modulacin de actividad por pequeas variaciones de la concentracin de sustrato (orden uno a menos sustrato y orden cero a ms sustrato).

Cintica enzimtica: Modelo Michaelis-Menten

Hiptesis III: Formacin de un intermediario covalente ES.

La forma de la ecuacin de velocidad no implica nada acerca del mecanismo enzimtico: mecanismos enzimticos distintos pueden ser cinticamente indistinguibles.

Efecto de pH y Temperatura
Valor Q10 Reaccin con act de 12 Kcal/mol incrementa en 2X su velocidad cuando se pasa de 25 C a 35 C. El incremento es 3X si la reaccin tiene una Eact de 20 Kcal/mol. Para las reacciones catalizadas enzimticamente, Q10 vara entre valores de 1.7 y 2.5

Curvas de pH-actividad de dos enzimas. (a) pepsina (pH-act ptimo 1-2). (b) Glucosa-6-fosfatasa (pH-act ptimo 7.2)

Definiciones de actividad enzimtica

La unidad de actividad enzimtica se define como la cantidad de enzima que transforma un micromol de sustrato en producto por minuto en condiciones estndar (pH 7.0, T 25 C, 1 atm de presin, 1 mol de sustrato). La actividad especfica de un enzima se define como el nmero de unidades de enzima por miligramo de protena (medida de pureza enzimtica). El nmero de recambio de un enzima es el nmero de molculas de sustrato transformadas por unidad de tiempo por cada molcula de enzima (o por cada centro cataltico).