Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata

Bioqumica III - 2008

Trabajo Prctico Nro 3 Transformacin de plsmidos INTRODUCCIN
Transformacin

La transformacin es el proceso mediante el cual las bacterias captan DNA exgeno. Existen otros mecanismos que permiten la incorporacin de DNA, pero dependiendo del tipo de DNA (procedencia) y del mtodo de incorporacin se denominan en forma diferente. La conjugacin, implica el pasaje de DNA de una bacteria a otra. La transduccin se produce cuando el DNA forneo es inyectado por un virus. Finalmente, la transformacin, involucra la transferencia del DNA presente en el medio hacia las bacterias. De esta forma, la transformacin se puede definir como la variacin hereditaria de una clula bacteriana susceptible, originada por la captacin de ADN desnudo libre en el medio. Tras la transformacin, la clula que ha recibido el ADN se suele denominar transformante. En la naturaleza, existen ciertas especies bacterianas que son capaces de captar el DNA exgeno naturalmente (Neisseria, Haemophilus, por ejemplo). Pero este no es el caso para la mayora de las bacterias, en consecuencia, las mismas deben tratarse artificialmente de forma tal de modificar su estructura externa y tornarlas competentes. Este estado de competencia, permite que la clula se vuelva susceptible a la incorporacin de DNA (el DNA es una molcula hidroflica y la membrana plasmtica est formada por una bicapa lipdica hidrofbica). Tcnicas que permiten tornar las bacterias competentes Mtodo de Cl2Ca La obtencin de clulas competentes en E. coli consiste en ir concentrando un cultivo recogido en fase logartmica, mediante lavados sucesivos en una solucin fra (4C) de Cl2Ca, tras lo cual la mezcla de clulas y ADN se someten unos 2 min. a 42C (choque por calor). Este tratamiento altera las envolturas (sobre todo la membrana externa) y aumenta su permeabilidad al ADN. Los plsmidos entran a la clula como molculas de cadena doble intactas, mientras que los ADN lineales, que entran de la misma forma, son degradados por nucleasas citoplsmicas (RecBCD). Los transformantes se suelen seleccionar en base a la resistencia a algn o algunos antibiticos conferidos por los plsmidos artificiales usados en Ingeniera Gentica. El shock trmico, la inclusin de iones monovalentes, el crecimiento en medios con elevada concentracin de Mg+2, etc. son tratamientos que permiten elevar la frecuencia de transformacin considerablemente. Preparacin de clulas electrocompetentes

Este mtodo se basa en la obtencin de clulas libres de iones. Para ello un cultivo en fase logartmica (OD entre 0.5 y 0.7) se lava sucesivas veces con H2O (tipo MiliQ) o con una solucin de glicerol al 10%, aproximadamente 4-5 veces. Posteriormente la mezcla ADN/clulas se somete a cortos pulsos de corriente elctrica de alto voltaje, lo cual altera las envolturas y permite la captacin de ADN en una amplia variedad de bacterias, tanto Gram-

positivas como Gram-negativas. Este mtodo es ms eficiente para la incorporacin de ADN dentro de las clulas. Aplicaciones En los ltimos aos se han logrado desarrollar sistemas artificiales para producir "clulas competentes" (como Escherichia coli, Salmonella typhimurium y algunas especies de Pseudomonas), lo cual ha hecho avanzar los estudios genticos, especialmente mediante manipulaciones in vitro., La transformacin artificial de E. coli con ADN plasmdico es una de los mtodos bsicos de la Ingeniera Gentica. Los plsmidos de inters son incorporados a las bacterias con el fin de estudiar la expresin de un gen en particular, la evaluacin de la capacidad promotora, la generacin de una protena heterloga, etc. Los plsmidos que son utilizados como sustrato para la incorporacin de un fragmento a estudiar (ORF, promotor, fragmento genmico, etc) contienen una o varias resistencias a antibiticos, genes indicadores como la protena fluorescente verde (GFP), etc. De esta manera, una vez que las bacterias han sido transformadas con el plsmido de inters, hay que aislar a las clulas que lo contienen dentro de un pool de bacterias que no han tomado el plsmido. Para este fin, las clulas se hacen crecer en un medio de cultivo slido que contenga algn agente de seleccin para el cual el plsmido confiere resistencia, como por ejemplo un antibitico. Dado que existe la posibilidad, aunque muy baja, de que las bacterias desarrollen resistencia al azar, y se observen colonias que no contienen el plsmido deseado, es necesario corroborar la presencia del mismo antes de proseguir con un experimento. Para ello, primero debe extraerse el plsmido mediante una miniprep, y posteriormente chequear su identidad mediante perfiles de restriccin (trabajo realizado en el TP n 2). Hay que recordar que la identidad del plsmido slo puede ser establecida con certeza por el secuenciado de todas sus bases. Por otro lado, hay que tener en cuenta que las tcnicas que permiten la entrada del plsmido a la clula, si bien deben realizarse cuidadosamente para obtener los mejores resultados, causan la prdida de una pequea poblacin de bacterias dentro del pool de competentes. Es por esto que luego de someterlas al proceso de transformacin, las bacterias tambin deben hacerse crecer en medio de cultivo slido sin antibitico, para calcular la viabilidad celular. Eficiencia de la transformacin.

Se define como eficiencia de transformacin al n de bacterias transformantes (que han adquirido el plsmido) por g de DNA presente en el medio de transformacin. Marco terico Si se incuban en experimentos separados cantidades crecientes de DNA con la misma concentracin de clulas y luego se miden la cantidad de transformantes se obtiene una curva como la mostrada en la figura.

Se observa que a bajas concentraciones de ADN, la cantidad de transformantes es proporcional a la cantidad de DNA dador, lo que demuestra que cada transformacin es la consecuencia de la interaccin entre una clula receptora con una sola molcula de DNA dador (si se necesitaran dos o ms molculas, el nmero de transformantes sera proporcional a la segunda potencia o ms de la cantidad de DNA dador). Este hecho permite la seleccin individual de cada clon recombinante a partir de una genoteca.

Tambin se observa en la figura que por encima de una cierta concentracin de DNA (generalmente en el rango de los nanogramos) la cantidad de transformantes se mantiene constante. Este fenmeno de saturacin se debe a que se ha alcanzado el nmero mximo de clulas capaces de incorporar el DNA exgeno. Por lo tanto la ordenada correspondiente a la meseta de una curva de transformantes en funcin de la cantidad de DNA dador indica la concentracin de clulas competentes presentes en la mezcla de transformacin. En el caso de la figura la concentracin de clulas en todos los experimentos fue 109 clulas/ml, lo que indica que slo una pequea proporcin de las clulas tratadas adquiere el estado de competencia. Teniendo en cuenta que, de las bacterias competentes una pequea fraccin de ellas se pierden como consecuencia del proceso de transformacin utilizado, se define la frecuencia de la transformacin como el n de colonias transformantes respecto del n de colonias viables multiplicado por cien. Obsrvese que de acuerdo a la curva mostrada, la cantidad de 1 g de DNA, a la que hace referencia la definicin de eficiencia, supera en varios rdenes de magnitud la mxima cantidad de DNA que se puede incorporar antes de la saturacin. Por ello el clculo de la eficiencia se debe realizar en el rango de linealidad de la curva y, tal como se indica en el protocolo a continuacin, nunca se emplean cantidades de DNA transformante que superen los 50 ng.

ET=

N de colonias transformantes g de DNA dador N de colonias transformantes X100 N de colonias viables

FT%=

OBJETIVO DEL TP
Transformar bacterias E.coli qumicamente con diferentes diluciones de un plsmido de concentracin conocida. Esto permitir: calcular la eficiencia y la frecuencia de transformacin, la viabilidad celular luego de someterlas a un shock tmico y evaluar el trabajo realizado en condiciones de esterilidad.

ORGANIZACIN GENERAL
Dentro de cada una de las comisiones, se generarn 6 grupos de trabajo. A cada uno de los grupos se le asignar realizar una dilucin de plsmido en particular con la cual realizarn la transformacin. De manera tal de poder obtener una variedad de resultados que permitirn posteriormente discutir los conceptos de frecuencia, eficiencia, viabilidad. El 2do da del TP, las comisiones realizarn los recuentos que correspondan y se discutirn los resultados obtenidos.

TCNICAS EXPERIMENTALES A) Preparacin de Bacterias Competentes

(se proveer a los alumnos de las bacterias competentes) 1) Picar un stock de bacterias guardado a -70C (sin que se descongele) con un hansa y hacer estras en una placa de Agar SIN NINGN ANTIBITICO. Crecer toda la noche a 37C. 2) Transferir una colonia a 50 ml de medio lquido SIN NINGN ANTIBITICO y crecer a 37C con agitacin hasta alcanzar una DO600 entre 0,3 y 0,5. 3) Aspticamente transferir las clulas a un tubo de centrfuga estril y dejar en hielo durante 10 minutos.

4) Centrifugar las clulas a 4000 rpm durante 10 min a 4C. Decantar el sobrenadante e invertir el tubo sobre un papel absorbente durante 1 min. 5) Resuspender las clulas en 5 ml de solucin 0,1M de CaCl2 estril enfriado en hielo. Centrifugar a 4000 rpm durante 10 min a 4C. Decantar el sobrenadante e invertir el tubo sobre un papel absorbente durante 1 min. 6) Resuspender el pellet en 1 ml de solucin 0,1M de CaCl2 estril. Dejar a 4C entre 12 y 24 hs. 7) Para almacenar, mezclar 800 l de la suspensin de bacterias con 200 l de Glicerol estril y alicuotar en tubos de 500 l estriles de a 200 l. Congelar inmediatamente en bao de Alcohol y Hielo Seco o en N2 lquido y guardar a 70C.

B) Transformacin de Plsmidos
1) Preparar la dilucin de plsmido correspondiente (no ms de 50 ng en un volumen no mayor a 10 ul). Cada grupo realizar una dilucin de acuerdo a la siguiente tabla, para posteriormente poder comparar los resultados.

Grupo 1 2 3 4 5 6

Concentracin ng/l 1 2 3 4 5 0.5

2) Sacar un stock de 200 l de bacterias competentes del freezer de -70C por cada transformacin a realizar y dejar en hielo 5 min. Adicionar a 200 l de suspensin de bacterias competentes el DNA plasmdico. Mezclar bien y dejar en hielo durante 30 min. 3) Repetir el procedimiento para un control negativo (sin plsmido) y un control positivo (con un plsmido conocido). 4) Transferir los tubos de microcentrfuga a un bao de agua a 42C y mantenerlo sin agitar durante 90 seg. Inmediatamente devolver los tubos al hielo y agregarle 800 l de medio fresco a cada uno. Incubar 1 hora a 37C con agitacin. 5) Mientras tanto, preparar placas de medio con Agar que contengan Ampicilina (100g/ml de medio) para la seleccin de las colonias que contengan el plsmido. Tambin se necesitarn placas sin antibitico para sembrar el control negativo. Dejar secar las placas por lo menos 20 min. (Las placas sin y con Ampicilina ya estarn disponibles). 6) Cerca de un mechero, tomar una alcuota de 50 l y una de 200 l de la suspensin de bacterias transformadas y esparcir cada una sobre la superficie de una placa (con ampicilina) con la ayuda de una esptula empapada en etanol 70% y esterilizada al fuego (dejar enfriar un instante). Repetir para cada muestra, incluyendo los controles. 7) Hacer una dilucin 1/1000 y 1/10000 (1/10 de la anterior) del tubo con el control negativo y plaquear alcuotas de 50 l de cada dilucin en placas SIN AMPICILINA para realizar el recuento de clulas sobrevivientes.

8) Dejar la placa durante 10 a 30 min a temperatura ambiente boca arriba. Luego incubarlas invertidas en la estufa a 37C para que las colonias crezcan. 9) Al da siguiente se sacan las placas de la estufa y se realiza el recuento de colonias de los controles para el clculo de la Eficiencia y Frecuencia de Transformacin. 10) Las placas se guardan invertidas y selladas con parafilm a 4C hasta el momento de ser usadas (NO ms de 15 das).

C) Recuentos (2do da) PREGUNTAS

Para el aprovechamiento del trabajo experimental es imprescindible saber exactamente qu se est haciendo en cada momento y por qu. Recuerde que la experiencia de laboratorio es intransferible y no la encontrar en ningn libro; por lo tanto las oportunidades desaprovechadas durante el trabajo experimental en el laboratorio difcilmente puedan recuperarse con posterioridad en la carrera. Es por ello que sugerimos resolver el siguiente cuestionario antes de venir al trabajo experimental. Por favor, consulte y despeje cualquier duda al respecto con los docentes. 1) Qu funcin cumple cada una de las soluciones utilizadas en el TP? 2) Qu procedimientos puede emplear para cuantificar el ADN plasmdico? 3) Qu diferencia hay entre eficiencia de transformacin y frecuencia de transformacin? Cmo se mide cada una? 4) Qu son las clulas competentes? 5) Por qu se realiza una incubacin sin antibitico selectivo inmediatamente despus de transformar? 6) Cmo se hace para obtener colonias aisladas luego de la transformacin? 7) Calcular la Eficiencia y Frecuencia de Transformacin si hubiera trabajado en paralelo durante el TP con un plsmido control para el cual se obtuvieron 83 colonias al sembrar una alcuota de 50 l de 1000 l finales. Considere que emple 50 ng para transformar 200 l de bacterias competentes y que el recuento del control negativo dio 235 colonias al sembrar 50 l de una dilucin 1/10000 y ninguna colonia al sembralo en una placa con Ampicilina. BIBLIOGRAFA Griffiths, A., Miller, J., Suzuki, D., Lewontin, R. and Gelbart, W. 1996. An Introduction to Genetic Analysis. Sixth Edition. W. H. Freeman and Company. New York. U.S.A. Murray, P, Kobayashi, G. Pfaller, M. and Rosenthal, K. 1997. Microbiologa Mdica. Segunda edicin. Harcourt Brace de Espaa, S.A. Madrid, Espaa. Snyder, L. and Champness, W. 1997. Molecular Genetics of bacteria. American Society for Microbiology Press. Washington, U.S.A. STANIER y otros: Microbiologa-2 edicin (Ed. Revert). pginas 276-282 del captulo 11 sobre transferencia gentica. SUZUKI y otros: Gentica (4 edicin) (Ed. Interamericana-McGraw Hill, Madrid, 1992). Vase cap.10, pgs. 243244.