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Corso Integrato di BIOCHIMICA E BIOLOGIA 2012/13 Modulo di BIOCHIMICA Lezione 2

Alessandro Fanzani fanzani@med.unibs.it Sezione di Biochimica

Argomenti Lezione 2
Aminoacidi (aa) Aa essenziali e non Gli aa sono precursori di molte molecole biologiche Chiralita degli aa Punto isoelettrico degli aa Curva di titolazione degli aa Le scale di idropatia Il legame peptidico Il legame peptidico un punto di rigidit della catena Proteine semplici e coniugate Forma e funzione Livelli strutturali La struttura primaria La struttura secondaria Solo determinate coppie di angoli sono ammesse in una conformazione stabile L' eliche Le alfa eliche possono essere amfipatiche, con un lato polare e uno non polare Le strutture Foglietti paralleli e antiparalleli Ripiegamenti e anse Lelemento di struttura pi semplice il beta turn (loop) Struttura terziaria Le proteine ripiegate sono stabilizzate prevalentemente da interazioni deboli non covalenti Struttura delle proteine di membrana

Gli aminoacidi sono precursori di molte molecole biologiche

Chiralita degli aminoacidi

Il legame peptidico
Una coppia di amminoacidi pu legarsi attraverso una reazione di condensazione (eliminazione di una molecola di acqua) fra il gruppo carbossilico di un amminoacido e il gruppo amminico dell'altro, in modo da formare un dipeptide.

Il legame peptidico un legame ammidico, come quello che si forma fra un acido carbossilico e una ammina primaria

Il legame peptidico

Il legame peptidico un punto di rigidit della catena

Studi

di

diffrazione

ai

raggi

hanno

mostrato che nel gruppo peptidico il legame C-N pi breve (1.33 ) di un normale legame C-N (1.46 ) e che il legame C=O leggermente pi lungo (1.24 ) di un normale doppio legame C=O (1.20 ). Ci significa che il legame peptidico ha parziali caratteristiche di doppio legame (oltre il 40%), mentre il doppio legame C=O si comporta in parte (40%) come un legame singolo. Tutto ci trova giustificazione nel fenomeno della risonanza di del gruppo legame peptidico fra due strutture limite: le parziali caratteristiche doppio impediscono la libera rotazione attorno al legame peptidico, C-N, che costituisce cos un punto di rigidit della catena polipeptidica.

La catena polipeptidica quindi costituita da un rigido scheletro lineare, nella cui successione troviamo un NH, un C, e un C "ammidico" (C'), e cos via, di seguito. Nella rappresentazione della sequenza amminoacidica di una proteina, si usa la convenzione di scrivere a sinistra il gruppo amminico terminale e a destra il gruppo carbossilico terminale: NH2--->COOH Nonostante la rigidit imposta dal legame pepidico, i piani in successione che contengono i vari gruppi peptidici sono liberi di ruotare intorno ai vertici costituiti dai C, che rappresentano cos una sorta di "snodo". In questo modo, ogni piano delle unit peptidiche ha due rotazioni possibili: una intorno al legame C-C' (angolo di rotazione , psi), ed una intorno al legame N-C (angolo di rotazione , phi).

Un'ulteriore conseguenza della risonanza che interessa il legame peptidico che gli atomi che compongono il cosiddetto gruppo peptidico (i due atomi, C ed N, del legame stesso e i 4 atomi ad essi legati: O, H e i due carboni ) giacciono tutti su uno stesso piano. La configurazione preferenziale del gruppo peptidico quella in cui i due C sono in posizione trans, in modo che i gruppi R consecutivi sono alla massima distanza l'uno dall'altro (minor ingombro sterico).

La stabilit del legame peptidico soprattutto dovuta alla risonanza, ovvero la delocalizzazione di elettroni su diversi atomi. La risonanza ha due importanti conseguenze; la prima che aumenta la polarit del legame peptidico, per cui i momenti di dipolo indotto stabilizzano il ripiegamento delle proteine. La seconda conseguenza che, a causa della risonanza, il legame peptidico ha un parziale carattere di doppio legame, il che significa che i tre atomi che costituiscono il legame sono complanari e che la libera rotazione attorno al legame limitata. Gli altri due legami N-C e C-C' sono legami singoli di torsione e attorno ad essi permessa la rotazione a patto che non ci sia interferenza sterica tra le catene laterali.

Una proteina quindi un eteropolimero con legami covalenti che possono ruotare alternati a legami planari rigidi. Questa combinazione restringe notevolmente il numero di possibili conformazioni che la catena peptidica pu adottare.

Il legame peptidico rigido e planare. Il legame peptidico ha le caratteristiche di un parziale doppio legame perch gli elettroni formano sono condivisi tra ossigeno, carbonio e azoto, con lossigeno che porta una perziale carica negativa (elemento pi elettronegativo) e lazoto ammidico che presenta invece un residuo di carica positiva. Questa distribuzione elettronica nota come risonanza. Gli atomi di ossigeno e didrogeno sono sui lati apposti del legame C-N.

La rotazione limitata attorno ai legami covalenti di una catena polipeptidica

Il legame C-N, che corrisponde ad un terzo circa di tutto lo scheletro della proteina, non permette rotazione (struttura rigida e planare, evidenziata dal rettangolo azzurro). I restanti due legami, quelli tra il C=O e il C e quello tra il gruppo N-H e il C dellamminoacido seguente, possono ruotare ma anche in questo caso vi sono limitazioni imposte

Esempio di conformazione proibita. In questo caso abbiamo la sovrapposizione tra lossigeno carbonilico e un idrogeno del gruppo ammidico di un amminoacido adiacente.

Proteine

Livelli strutturali
Affinch una proteina possa svolgere la propria funzione biologica, la catena polipeptidica deve ripiegarsi in modo da assumere una struttura tridimensionale stabile, ben precisa. Questa particolare organizzazione viene definita conformazione nativa. Nella struttura 3D di una proteina possibile riconoscere pi livelli di organizzazione che, in base a un criterio essenzialmente gerarchico, possono essere suddivisi in quattro distinte tipologie, come mostrato nella figura che segue.

I quattro livelli di organizzazione strutturale delle proteine

La struttura primaria
La struttura primaria di una proteina non altro che l'ordine con cui gli amminoacidi si susseguono nella catena polipeptidica . In breve, la struttura primaria si identifica con la sequenza amminoacidica. L'ordine con cui gli amminoacidi si susseguono nella catena non casuale, ma rigorosamente immutabile per ogni particolare proteina di un organismo. Cos ad esempio l'albumina (una proteina serica presente in numerosi organismi animali), ha in ogni individuo appartenente alla stessa specie, sempre la stessa composizione in amminoacidi, i quali sono legati l'uno all'altro sempre con lo stesso ordine.

Il meccanismo della biosintesi proteica (che avviene sui ribosomi) assicura che la proteina sia costruita secondo le precise istruzioni contenute in una porzione di DNA, il gene. Nei geni, le informazioni sono codificate in triplette di basi, ognuna delle quali corrisponde ad un particolare amminoacido. Il cosiddetto "dogma centrale" ci ricorda che il flusso dell'informazione procede dal DNA all'RNA messaggero ed infine alla proteina, in cui l'informazione si concretizza in una entit funzionale. Le proteine sono infatti quelle molecole che realizzano gli obiettivi codificati nel "progetto dell'organismo", cio nei geni del DNA cromosomico.

La struttura secondaria
Si definisce in questo modo la conformazione locale che assumono tratti pi o meno lunghi della catena polipeptidica. Come abbiamo gi osservato, la conformazione della catena fortemente condizionata dalle restrizioni cui devono sottostare le coppie di angoli diedrici, e , che definiscono la reciproca angolazione di due piani peptidici consecutivi. quindi intuitivo comprendere come la struttura secondaria sia in buona parte correlata con la sequenza amminoacidica (struttura primaria) della proteina. Un altro contributo determinante alla organizzazione conformazionale della catena deriva dalla tendenza a generare ripiegamenti che consentano di ottimizzare la formazione di legami a ponte di idrogeno intracatena. I legami a H hanno di fatto un ruolo fondamentale nella genesi di conformazioni della massima stabilit. In sintesi, sono quindi due i fattori che determinano la struttura secondaria di una proteina e che hanno l'effetto di rendere minima l'energia potenziale della molecola:

minimizzazione dell'ingombro sterico fra i gruppi R ottimizzazione della formazione di legami H intracatena

Il risultato di queste restrizioni fa s che gli elementi di struttura secondaria si possano ricondurre sostanzialmente a tre sole diverse tipologie stabili:

-elica strutture anse o ripiegamenti (loop) Diagrammi topologici: stata molto utile, ai fini di una rapida e chiara "lettura" delle strutture 3D delle proteine, la rappresentazione schematica introdotta per indicare gli elementi di struttura secondaria: eliche = cilindri o spirali, filamenti = frecce NC, loop = nastri. Tutto ci ha favorito anche l'identificazione di strutture supersecondarie e di motivi strutturali ricorrenti nelle proteine.

Solo determinate coppie di angoli e fsono ammesse in una conformazione stabile


Per motivi di reciproco ingombro sterico dei grossi gruppi laterali R e affinch sia ottimizzata la stabilizzazione del peptide attraverso la formazione di legami H intracatena, gli angoli e possono assumere solo determinati valori. La conformazione della catena polipeptidica definita da questi valori.
Riportando in un grafico in funzione del corrispondente , si ottiene il cosiddetto grafico di Ramachandran (dal nome del biofisico indiano che effettu i calcoli sui valori consentiti delle coppie degli angoli di rotazione), in cui si individuano 3 regioni ben definite corrispondenti alle coppie di valori consentiti. Le regioni sono definite , e L e corrispondono rispettivamente a strutture , -eliche destrorse e -eliche sinistrorse. In queste restrizioni non rientra la glicina che, avendo un H come gruppo R, e quindi un limitato ingombro sterico, pu assumere angoli non consentiti ad altri amminoacidi. La glicina pu cos avere un ruolo importante nella struttura proteica, potendo far assumere alla catena angolazioni "insolite".

L' elica
Nelle proteine possono esistere diverse conformazioni a elica, ma quella alfa di gran lunga la pi rappresentativa. L'-elica il risultato del ripiegamento probabilmente pi "naturale" che una catena peptidica possa assumere. Lo dimostra il fatto che l'-elica l'elemento di struttura secondaria pi comune nelle proteine.
L'-elica una struttura regolare, caratterizzata da parametri metrici ben precisi. Si forma quando un certo numero di coppie successive di angoli diedrici, e , hanno valori compresi fra -60 e -50. In questo modo i piani peptidici si dispongono in maniera elicoidale intorno ad un asse longitudinale. L' -elica ha un passo di 5.4 e ogni spira dell'elica costituita da 3.6 residui amminoacidici. L'eccezionale stabilit di questa conformazione dipende dal fatto che tutti gli NH e i C=O dei gruppi peptidici sono impegnati in legami a ponte di idrogeno. Ogni legame a H si forma fra l'idrogeno dell' NH di un residuo e l'ossigeno del C=O del quarto residuo successivo. La direzione dei legami a H pressoch parallela all'asse dell'elica. L' -elica presente nelle proteine quasi sempre destrorsa (l'andamento quello della filettatura di una vite tradizionale). Ci dovuto al fatto che gli amminoacidi proteici sono tutti nella configurazione "L" e in un'elica sinistrorsa i gruppi laterali R risulterebbero troppo vicini ai gruppi C=O, destabilizzando l'elica. Le catene laterali R dei residui amminoacidici sono tutte rivolte verso l'esterno dell'elica. La polarit di questi gruppi influenzer il modo in cui le strutture ad -elica si disporranno a costituire la struttura terziaria della proteina. Alcuni amminoacidi sono considerati "buoni formatori" di -eliche, altri, quali la prolina e la glicina, possono invece destabilizzare l'elica provocandone un ripiegamento. La prolina, ad esempio, avendo il gruppo R richiuso ad anello sull'N imminico, non ha un NH che possa formare un legame a H e a causa dell'anomalo ingombro sterico del proprio gruppo laterale, costringe il piano peptidico ad assumere angoli diedrici non idonei alla formazione dell'-elica.

Lalfa elica solitamente destrorsa essendo composta da L-amminoacidi. I singoli dipoli dellelica si sommano a formare un elica polarizzata positivamente allestremit N-terminale e positivamente a quella C-terminale.

Le alfa eliche possono essere amfipatiche, con un lato polare e uno non polare

Lalfa elica ha 3,6 residui per giro, corrispondenti a una rotazione di 100 per residuo. Le catene laterali separate da 4 residui in sequenza tendono a raggrupparsi sullo stesso lato dellelica. In questo modo residui idrofilici e idrofobici spaziati di 3-4 posizioni formeranno unelica con un lato idrofilico e uno idrofobico, unelica amfipatica. Queste eliche si trovano spesso sulla superficie delle proteine, dove i lati polari sono a contatto con lacqua mentre quelli apolari sono disposti verso interfacce idrofobiche.

Struttura secondaria delle proteine: motivo ad a -elica


Modelli di strutture secondarie ad elica. Lelica rappresentata destrorsa. La catena polipeptidica si avvolge attorno ad un asse, conferendo al tutto una notevole stabilit. La struttura stabilizzata da numerosi ponti idrogeno che sono orientati perellelamente allasse maggiore. I gruppi convolti sono il C=O e il N-H del legame peptidico. In particolare, tra lidrogeno legato allazoto di ciascun legame peptidico e lossigeno elettronegativo del carbonio carbonilico del quarto amminoacido verso lestremit Nterminale dellelica.

(c)Visione di una struttura secondaria -elica da una estremit, lungo il suo asse maggiore. Notare la posizione delle catena laterali R, rappresentate in viola. (d)Visione laterale di una struttura -elica in cui cli amminoacidi sono rappresentati con i modelli pieni, che mostrano il raggio di van der Waals. Notare, anche in questo caso, la posizione esterna

Porzione extracellulare

Porzione transmembrana

Porzione intracellulare

Anche il secondo elemento di struttura secondaria caratterizzato da una conformazione assai regolare. I tratti della catena peptidica a conformazione sono distesi in una struttura con andamento a zig-zag dei piani peptidici. I residui laterali sono diretti perpendicolarmente al piano mediano della struttura, orientandosi in maniera alternata da un lato o dall'altro del piano.

Le strutture

Molto spesso nelle proteine, due o pi filamenti beta (-strands) tendono ad affiancarsi lateralmente e, formando legami a ponte di idrogeno fra di loro, generano strutture estese, pieghettate, dette foglietti . Nelle strutture , i legami a H si formano quindi fra tratti di catene affiancate, anzich fra residui vicini del medesimo tratto, come nell'-elica. Normalmente i foglietti non sono planari, ma tendono ad assumere nell'insieme una forma incurvata e lievemente "avvitata".

Nei foglietti , i filamenti possono essere orientati reciprocamente in senso antiparallelo, parallelo o misto. In quest'ultimo caso, i foglietti sono meno stabili e si incontrano pertanto pi raramente nella struttura delle proteine.

Foglietti paralleli e antiparalleli

Diagramma topologico di un foglietto antiparallelo

La "geometria" dei legami a idrogeno diversa a seconda che questi uniscano filamenti con orientamento antiparallelo o parallelo. Nel primo caso sono perpendicolari all'asse dei filamenti (e risultano quindi ottimali per direzionalit) e pi corti.

Possibile diagramma di un foglietto parallelo

Come la alfa eliche anche i filamenti beta possono essere amfipatici. Quasi tutti i legami peptidici sono trans, cio i gruppi C=O e N-H puntano in direzioni opposte per evitare collisioni, quindi un tratto con residui alternativamente idrofobici e idrofilici potrebbe avere un lato idrofobico e uno idrofilico.

Struttura secondaria delle proteine: motivo a foglietto b

Anche in questo tipo di struttura secondaria a foglietto o a foglietto ripiegato, la stabilizzazione data dai legami idrogeno tra lidrogeno del gruppo amidico di un legame peptidico e lossigeno del carbonile presente in un foglietto in via di formazione adiacente al primo. Notare, anche in questo caso, la caratteristica distribuzione delle catene laterali R, sopra e sotto il piano individuato dal

Una proteina con struttura terziaria (o quaternaria) pu avere diverse porzioni con strutture -elica e foglietto (paralleli e antiparalleli), raccordate da zone ad andamento apparentemente casuale.

Ripiegamenti e anse
Oltre ai due elementi regolari di struttura secondaria appena descritti, nelle proteine sono presenti tratti di catena apparentemente disorganizzati, di lunghezza anche molto variabile e pi o meno convoluti. Questi tratti, definiti loop, fanno da collegamento fra eliche o filamenti ed hanno un ruolo assai importante nella organizzazione 3D della catena peptidica. Sono relativamente flessibili e, soprattutto, consentono cambi di direzione, anche repentini, alle sequenze a conformazione e . Molto comuni sono i brevi loop di 3-5 residui che collegano due filamenti consecutivi, orientati in modo antiparallelo (-turns). Inoltre, i loop partecipano spesso alla formazione di siti di legame (vedi loop "a forcina" degli anticorpi) o del sito attivo degli enzimi. Nelle regioni loop quasi costante la presenza degli amminoacidi glicina o prolina, dei cui effetti sulla conformazione della catena abbiamo gi parlato .

Lelemento di struttura pi semplice il beta turn (loop)

Lelemento di struttura pi semplice il beta turn che coinvolge solitamente 4 residui, ma talvolta ne richiede 3. Consiste in un legame H tra lO carbonilico di un residuo (n) e il gruppo ammidico del residuo n+3, invertendo il percorso della catena. Questo piccolo elemento di struttura chiamato beta turn, turn inverso o turn a forcina. I beta turn ricorrono spesso sulla superficie delle proteine ripiegate a contatto con lacqua e invertendo la direzione limitano la dimensione della molecola mantenendola compatta.

Riassumendo

Struttura terziaria
Per struttura terziaria, si intende il modo in cui l'intera catena polipeptidica ripiegata nella struttura tridimensionale propria della proteina. In pratica, la struttura terziaria definisce le coordinate spaziali di tutti gli atomi del polipeptide.

I ripiegamenti della catena fanno s che elementi di struttura secondaria vengano a trovarsi vicini l'uno all'altro, in modo che le catene laterali R dei residui amminoacidici possano interagire fra loro formando legami deboli (interazioni di van der Waals e legami a ponte di H), che contribuiscono a stabilizzare la conformazione 3D della proteina.

Le proteine ripiegate sono stabilizzate prevalentemente da interazioni deboli non covalenti

I legami ammidici della catena polipeptidica sono gli unici legami covalenti a tenere legati gli aa. Eppure una struttura proteica ripiegata stabilizzata soprattutto da migliaia di interazioni deboli dovute principalmente a: Interazioni di van der Waals Si hanno quando le nuvole elettroniche di un atomo o di un gruppo di atomi si depolarizzano inducendo dipoli temporanei, risultando cos in una interazione elettrostatica debole. Leffetto maggiore per i gruppi pi polarizzabili, come i gruppi metile o metilene delle catene laterali idrofobiche, per es. di leucina o valina. Legami ionici Legami tra gruppi carichi elettrostaticamente Legami idrogeno Si formano quando un atomo di H legato ad un atomo pi elettronegativo attratto da un atomo vicino con una significativa carica negativa parziale.

In alcuni casi, oltre a queste interazioni di natura essenzialmente elettrostatica, possono formarsi legami covalenti (ponti disolfuro, S-S) fra due catene laterali di residui di cisteina che, sia pur lontani nella sequenza amminoacidica, vengano a trovarsi in prossimit a causa dei ripiegamenti della catena. Questi legami, essendo legami covalenti forti, danno un contributo notevole alla stabilit della struttura terziaria.

Un altro fattore che determina la conformazione tridimensionale stabile di una proteina, sono le interazioni delle catene laterali con il solvente (l'acqua). Le catene laterali apolari dei residui amminoacidici tendono infatti a disporsi verso l'interno della proteina, a costituire un "core" di natura idrofoba inaccessibile al solvente, mentre i gruppi R polari (idrofili) tendono a rimanere esposti alla superficie, dove possono formare legami a H con l'acqua del mezzo.

Struttura delle proteine di membrana


Non tutte le proteine della cellula si trovano in ambiente acquoso. Le proteine di membrana sono inserite nella parte idrofobica del doppio strato lipidico. Questo doppio strato formato da una porzione centrale idrofobica costituita dalle catene aciliche lipidiche, mentre le teste polari protrudono ai lati del sandwich perch esposte allambiente extra e intracellulare.

Porzione extracellulare

Porzione transmembrana

Porzione intracellulare

In una proteina di membrana le catene laterali degli aa che formano i segmenti transmembrana sono di solito idrofobici, per cui possono essere accolti nel bilayer lipidico senza costi energetici. Al contrario, i gruppi carbonilici e ammidici polari dello scheletro daranno luogo a interazioni sfavorevoli con le code lipidiche. Questi gruppi avranno la forte tendenza a formare legami H tra di loro, cos come avviene nella parte interna idrofobica di una proteina solubile quando si ripiega in acqua. La formazione di elementi di struttura secondaria come alfa eliche e beta foglietti quindi fortemente favorita nella parte interna delle membrane. Poich i legami H in un ambiente completamente apolare sono considerati pi forti di quanto lo siano se esposti al solvente, unalfa elica isolata pu esistere stabilmente in una membrana, mentre eliche che non interagiscono tra di loro sono rare nelle proteine solubili in acqua. Le alfa eliche sono lelemento di struttura secondaria pi comune nelle proteine di membrana.

Anche i foglietti beta ricorrono nelle proteine di membrana, ma sono pi difficili da riconoscere nella sequenza. I foglietti beta trovati fino ad ora nelle proteine di membrana formano foglietti antiparalleli con brevi turn polari. Poich i filamenti alle estremit di un foglietto beta inserito in membrana avrebbero nel loro scheletro molti gruppi donatori e accettori di legami H non soddisfatti, tutti questi foglietti esaminati finora formano barili chiusi con il primo e ultimo filamento impegnati in legami H luno con laltro. Questi foglietti beta avranno le catene laterali idrofobiche sulla loro superficie esterna, mentre possono avere le catene laterali polari o cariche nella parte interna del barile. Sembra infatti che questi barili siano usati principalmente come canali per permettere agli ioni o allacqua di diffondere attraverso la membrana. Ovviamente esistono anche canali costituiti da alfa eliche.

Un capello un aggregato di molti filamenti di a -cheratina. La resistenza delle proteine fibrose aumentata da legami covalenti crociati tra catene polipeptidiche adiacenti. Nelle a -cheratine questi legami sono i ponti disolfuro.

(a)La -cheratina dei capelli una lunga aelica destrorsa con diversi ispessimenti alle estremit N- e C-terminali. Queste strutture di base si avvolgono con andamento sinistrorso formando i cosiddetti avvolgimenti avvolti (coiled-coil). Le zone di contatto tra le catene sono ricche di aa idrofobici (Ala, Val, Leu, Met e Phe), le cui catene laterali R si interdigitano con andamento regolare. Queste a loro

La permanente unoperazione di ingegneria biochimica

STRUTTURA DEL COLLAGENO Il collageno (Mr = 300 000) una molecola a forma di bastoncino, lunga circa 300 nm e con uno spessore di 150 nm. I tre polipeptidi avvolti a formare la superelica contengono circa 1000 residui amminoacidici. Le fibre sono costituite da molecole di collageno allineate con una caratteristica sfasatura e unite da legami crociati che ne aumentano la resistenza alla trazione. Questo particolare allineamento e il contenuto di legami crociati sono tessuto specifici e portano alle tipiche striature visibili al microscopio elettronico. Le catene a nella molecola di collageno e le molecole in una fibra sono unite da insoliti legami crociati che coinvolgono residui di

La catena a del collageno ha una struttura secondaria ripetitiva molto caratteristica. Il tripeptide Gly-X-Pro oppure Gly-X-HyPro assume una struttura elicoidale sinistrorsa con tre residui per giro. Il modello rappresentato ha la sequenza Gly-Pro-HyPro. Modello spaziale della singola catena a del collageno (a, b). Tre eliche sinistrorse si arrotolano a formare una superelica ad andamento destrorso (c) Rappresentazione della superelica destrorsa vista dallalto ( d). I residui di Gly sono in rosso. Tali residui, per le piccole dimensioni delle catena laterale R (-H), sono necessari per conferire compattezza alla tripla elica, consentendo la formazione di forti giunzioni nei punti in cui le tre catene entrano in contatto. Nel collageno la Gly rappresenta il 35% dei residui totali.