Bioqumica clnica Tema NMERO 1: Azoados

Pruebas que conforman el anlisis: Urea, creatina-creatinina y cido rico

Objetivos: * Describir la fuente, el metabolismo y el significado clnico de los analitos de nitrgeno no proteico. * Indicar los rangos de referencia aceptables para estos analitos. * Describir los principios y precauciones de los procedimientos que se utilizan para medir los analitos.

Urea:

La urea Es una sustancia con alto contenido en nitrgeno que se produce cuando el cuerpo metaboliza las protenas y aminocidos de la dieta. Se produce en el hgado y el rin es el encargado de eliminarlo del cuerpo a travs de la orina. Una cantidad pequea es excretada en el sudor y es degradada por las bacterias. Se filtra con facilidad por el glomrulo y se reabsorbe en un 40-50 % en el tbulo, aunque este porcentaje vara en funcin del grado de hidratacin y de la diuresis. Un adulto normal, con una dieta equilibrada elimina alrededor de 25 a 35gr de urea diarios por la orina, lo cual corresponde al 90% del nitrgeno total excretado por esta va.

Ciclo de la urea: El ciclo de la urea comienza en el interior de las mitocondrias de los hepatocitos.

Reacciones: 1. El primer grupo amino que ingresa al ciclo proviene del amonaco libre intramitocondrial. El amonaco producido en las mitocondrias, se utiliza junto con el bicarbonato (producto de la respiracin celular), para producir carbamoil-fosfato. Reaccin dependiente de ATP y catalizada por lacarbamoil-fosfato-sintetasa I. Enzima alostrica y modulada (+) por el N-acetilglutamato.

2. El carbamoil-fosfato cede su grupo carbamoilo a la ornitina, para formar citrulina y liberar Pi. Reaccin catalizada por la ornitina transcarbamoilasa. La citrulina se libera al citoplasma.

3. El segundo grupo amino procedente del aspartato (producido en la mitocondria por transaminacin y posteriormente exportado al citosol) se condensa con la citrulina para formar argininosuccinato. Reaccin catalizada por la argininosuccinato sintetasa citoplasmtica. Enzima que necesita ATP y produce como intermediario de la reaccin citrulil-AMP.

4. El argininosuccinato se hidroliza por la arginino succinato liasa, para formar arginina libre y fumarato.

5. El fumarato ingresa en el ciclo de Krebs y la arginina libre se hidroliza en el citoplasma, por la arginasa citoplasmtica para formar urea y ornitina.

6. La ornitina puede ser transportada a la mitocondria para iniciar otra vuelta del ciclo de la urea.

Muestra: Las muestras de eleccin son plasma y suero, aunque tambin se utiliza orina y la mayora de los lquidos biolgicos. Las muestras deben analizarse pocas horas tras su recoleccin o refrigerarse para evitar la prdida de la urea mediante la accin bacteriana. En el caso de la orina esta se debe de diluir a 1:20 a 1:50. El plasma debe obtenerse utilizando anticoagulantes libres de amonio, no utilizar fluoruro pues inhibe la accin de la enzima ureasa. Se recomienda la heparina como anticoagulante. Mtodos para la cuantificacin de urea: Mtodo de eleccin. Mtodo de BerthelotEl primer paso es hidrolizar la urea a carbonato de amonio utilizando ureasa.

+ 2H2O + H Ureasa (NH4)2CO 3 + H + 2NH4 + HCO 3NH4 +

OH NH3 + H2O

Consiste en aadir a la muestra NaOCL y fenol en medio alcalino con nitro prusiato de sodio como catalizador, para formar indofenol.

NH3 + NaOCL + 2 NaOH NA2FE(CN)5NO Hipoclorito de sodio Indofenol(Azul)

La intensidad del color formado es proporcional a la concentracin de urea en la muestra ensayada

Valores de referencia: Valores de referencia de la urea | Adultos | 20-40 mg/dl | Nios | 5 a 18 mg/dl |

Interpretacin: Aumenta en: * Enfermedades renales, * Fallo cardiaco, * Hemorragias gastrointestinales, * Obstrucciones renales (piedras, tumores). * Enfermedades febriles

* Ingieren grandes cantidades de protenas * Elevacin de hormonas tiroideas

Disminuye en: * Ingieren dietas con bajo contenido de protenas * Embarazo * Dieta pobre en protenas. * Fallo heptico.

Creatina: Es una pequea molcula parecida a los aminocidos que el cuerpo puede sintetizar o derivar de los alimentos. Los adultos necesitan sintetizar e ingerir en total unos 2 g diarios de creatina para compensar la excrecin urinaria de creatinina, que es un producto del metabolismo de este compuesto. Es sintetizada en el organismo y en los alimentos principalmente en la carne, en el organismo en el hgado y pncreas a travs de la arginina, glicina y metionina (aminocidos esenciales) despus se difunde hacia el sistema vascular dirigindose principalmente a las clulas musculares donde sufren un proceso de fosforilacin convirtindose en fosfato de creatina para producir energa en forma de ATP. Por ltimo (la creatina) se filtra en los glomrulos y se reabsorbe en el tbulo contorneado distal.

Significado clnico:

Cuando las concentraciones de creatina en suero o plasma o la excrecin de creatina en orina incrementan, se debe a la presencia de afecciones que provocan necrosis o atrofia muscular esqueltica. Es til para el diagnstico de infarto del miocardio y otras enfermedades como la rabdomilisis y la apopleja. Rabdomilisis.- Descomposicin de las fibras musculares que ocasiona la liberacin de los contenidos de dichas fibras (mioglobina) en el torrente sanguneo. Algunas de stas son txicas para el rin. Apopleja.- Muerte sbita e instantnea de clulas cerebrales tras una interrupcin de la circulacin de la sangre en el cerebro.

Creatinina: La creatinina es un producto de desperdicio que se deriva de la creatina y el fosfato de la creatina, que se forma cuando la creatina pierde una molcula de agua, la reaccin se produce espontneamente en el organismo. Se transporta desde los msculos por medio de la sangre hacia el rin.

La creatinina se retira del plasma casi en su totalidad tras la filtracin glomerular, no se produce resorcin en los tbulos renales. Los niveles de creatinina srica es til para analizar la funcin renal. El contenido de cretina es proporcional a la masa muscular, por tanto, la creatinina tambin es proporcional a la masa muscular, y que una persona con mucha masa muscular puede tener ms creatinina que la poblacin normal.

Muestra La creatinina es un compuesto relativamente inestable, por lo que se previene la degradacin congelando el suero ya separado.

Es posible analizar suero, plasma u orina diluida, este ltimo debe llevarse a una dilucin de 1:100, los anticoagulantes comunes (fluoruro, heparina) no causan interferencia, si bien la heparina que puede encontrarse como sal de amonio, debe ser evitada en mtodos enzimticos que miden la produccin de amoniaco.

Mtodos para la cuantificacin de creatinina

Mtodo Jaff En donde: * Reaccin de la creatinina con solucin alcalina de picrato de potasio. * Se formara el complejo rojo Janovski. * La absorbancia del complejo se mide a 510- 520mn

La reaccin se realiza a temperatura constante inferior a 30C, a temperaturas ms elevadas, la glucosa, acido rico y acido ascrbico pueden reducir el picrato a picramato cuyo mximo de absorbancia se encuentra en 482mn, lo que provoca una sobre valoracin. La reaccin no se lleva acabo a un pH regulado, pero se lleva a cabo en NaOH 0.1

M.

Jaff/Tierra de fuller Se lleva a cabo para aumentar la especificidad de la reaccin Jaff utilizando tierra fuller que adsorbe la creatinina presente en el filtrado libre de protenas, aislndola as de las posibles interferencias.

Jaff cintico Posee el mismo principio que la tcnica de Jaff, a diferencia que la primera lectura se realiza dentro de los primeros 30seg. Despus de la mezcla de reactivos. Las mediciones posteriores se hacen a los 90seg. , esto para evitar que sustancias interferentes ms lentas hayan reaccionado en forma significativa.

Jaff pH dual Se lleva a cabo el procedimiento del mtodo Jaff, a diferencia que se usa la reaccin a pH 9.65 empleando como buffer fosfato, para evitar posibles interferencias. La reaccin es de 45min a 37C.

Creatinina amidohidrolasa En esta se utiliza la creatinina amidohidrolasa que lleva acabo la hidrlisis de la creatinina que a su vez interviene en reacciones indicadoras por espectrofotometra a 340mn.

Creatinina iminohidrolasa

Se utiliza la creatinina iminohidrolasa, la cual interviene en la formacin de amoniaco a travs de la creatinina que puede ser determinado por espectrofotometra o electrometra. La mezcla debe estar libre de sustancias que liberan o consumen amoniaco.

Mtodo de eleccin: Para la eleccin de la metodologa implica varias consideraciones, como lo son confiabilidad en el resultado, precisin, exactitud la ms importante. El mtodo que cumple con los requisitos es Jaff cintico, adems de ser el ms utilizado. Este mtodo utiliza acido pcrico e hidrxido de sodio, los cuales se mezclan en volmenes iguales la estabilidad de esta muestra es de 10 das a 15-25 C los reactivos deben estar protegidos de la luz. Se realiza la mezcla de 1ml de solucin de trabajo con 100L de muestra, el patrn se prepara mezclando 1ml de sol. De trabajo y 100L de solucin patrn. Se debe realizar la lectura en el espectrofotmetro a los 30 y 90 segundos despus de la adicin de la mezcla. Valores de referencia: EDAD | CREATININA SERICA (mg/dL) | CREATININA URINARIA (mg/kg/ 24h) | Hombre adulto | 0.7-1.4 | 10-20 | Mujer adulta | 0.6-1.1 | 8-18 | Interpretacin: Disminuye en:

* Distrofia muscular. * Reduccin de la masa corporal. * En casos de miastenia graves. Aumenta en: * Insuficiencia renal crnica. * Rin poliqustico. * Nefroesclerosis. * Gota. * Drogas nefrotxicas. * c. Ascrbico. * c. Saliclico. cido rico: Su formula qumica es C5H4N4O3. Es un acido dbil el cual existe a pH de los lquidos corporales casi totalmente en forma del anin urato. Se genera en el hgado a partir de la degradacin de purinas y nucleoprotenas por accin de la enzima xantina oxidasa. Se excreta por va renal. Se forman 5 gr de purinas al da y solo 0.5 gr se convierte en cido rico. Va de la xantina oxidasa: A partir de la adenina se lleva a cabo una desasimilacin con ayuda de la enzima adenasa convirtindose en hipoxantina despus esta se oxida a xantina por medio de la enzima xantina oxidasa y esta oxidacin se vuelve a repetir utilizando la misma enzima (xantina oxidasa), convirtiendo la xantina en cido rico producto poco soluble a diferencia de la urea y creatinina. Los elevados niveles de cido rico en sangre se denominan hiperuricemia. Los humanos no contamos con la uricasa nica enzima que destruye el cido rico, por lo tanto se lleva acabo una uricolisis a nivel intestinal. El cido rico puede proceder de 3 orgenes:

* Catabolismo de nucleoprotenas ingeridas. * Catabolismo de nucleoprotenas endgenas. * Transformacin directa de los nucletidos endgenos de la purina, as como tambin de algunos medicamentos. Muestra: Se emplea suero o plasma. Debe evitarse el EDTA y el fluoruro como anticoagulante y conservador ya que interfieren en el anlisis. El cido rico es estable durante 3-5 das de 2 a 6C y por lo menos durante 6 meses a -20C. Tambin son tiles las alcuotas de orina de 24 h. Para evitar la precipitacin de los uratos agregar 100 ml de hidrxido de sodio al envase antes de la recoleccin de la muestra. Mtodos para la cuantificacin de cido rico: El cido rico se puede medir mediante mtodos qumicos o enzimticos. * Mtodos qumicos. En medio cido, el acido rico se descompone en aloxano y urea; en medio alcalino la oxidacin del urato produce alantona y perxido de hidrogeno. * Mtodos enzimticos: Se realizan por medio de la enzima uricasa. El H2O2 (producto de la reaccin uricasa-cido rico). Se une a otras reacciones enzimticas para dar un producto final de color, que se puede medir a 520nm. Ejemplo de mtodos enzimticos: Absorcin diferencial: Mtodo UV que se mide de 290-293 nm posee una mayor especificidad. Polarogrfico: basado en medir la velocidad del consumo de oxigeno, que es una medida de la velocidad de la oxidacin del cido rico catalizada por la uricasa. Poco usado posee algunas interferencias. Coulomtrico: Basado en la titulacin con yodo, es un mtodo instrumental no es fcilmente disponible. Otros mtodos:

Con cido fosfotngstico: Mtodo basado en la oxidacin del cido rico a alantona y CO2, al igual que se produce una reduccin de cido fosfotngstico a azul de tungsteno con una absorbancia de 700 nm. Es inespecfico. Cromatografa de lquidos de alto rendimiento: Es una cromatografa de fase inversa con deteccin espectrofotomtrica a 280 o 235 nm. Posee una mayor especificidad y sensibilidad. Propuesto como mtodo de eleccin pero es un mtodo muy caro. Mtodo de eleccin: Uricasa colorimtrico basado en la especificidad de la oxidacin del cido rico a alantona y perxido de hidrogeno, catalizada por la uricasa. Uricasa Acido rico Alantona + H2O2 + CO2 Originando un compuesto coloreado que se mide a 520 nm. Partiendo del H2O2 Peroxidasa H2O2 H2O + O2 Utilizando el cromgeno ( O2 + 3-metil-2-benzotiazolinona + N, Ndimetilanilina) Produciendo una coloracin azul indamina, cuya absorbancia se mide a 600nm. Valores de referencia: Valores de referencia del cido rico | Hombres | 3.5-7.0 mg/dl | mujeres | 2.5-6.0 mg/dl | Valores en orina: 250-750 mg/ dl | Interpretacin: Aumenta en:

* Alcoholismo * Diabetes * Gota * Hipoparatiroidismo * Intoxicacin con plomo * Leucemia * Nefrolitiasis * Insuficiencia renal * Toxemia del embarazo * Dieta rica en purinas * Ejercicio excesivo * Defectos enzimticos, por destruccin celular (casos cncer). Los niveles de cido rico por debajo de lo normal pueden deberse a: -Sndrome de Fanconi; Es un trastorno de los tbulos renales en el cual ciertas sustancias normalmente absorbidas en el torrente sanguneo por los riones son liberadas en su lugar en la orina. -Enfermedad de Wilson; Es un trastorno hereditario en el cual hay demasiado cobre en los tejidos corporales. El exceso de cobre causa dao al hgado y al sistema nervioso. -Sndrome de secrecin inadecuada de hormona antidiurtica (SIHAD); Es una afeccin metablica en la cual no hay suficiente sodio (sal) en los lquidos corporales por fuera de las clulas. -Dieta baja en purinas Bibliografa: Qumica Clnica (mtodos) Pesce/Kaplan Editorial Mdica Panamericana Qumica Clnica

Anderson-Cockayne Editorial Interamericana Mc Graw-hill