2007/2008

ndice
Tcnica Assptica...3 Exame a Fresco...5 Coloraes..6 Colorao de Gram..8 Colorao da cpsula..11 Colorao de Ziehl-Neelsen protocolos..13 Meios de Cultura..15 Isolamento de bactrias.16 Meio de MacConkey....17 Meio de Cled...18 Meio de Manitol....19 Meios de Gelose....20 Metabolizao de acares (glucose) Meio de OF21 Meio de MR-VP..22 Caldo Glucosado / Caldo Lactosado23 Provas Bioqumicas Catalase..24 Coagulase..25 Oxidase...25 DNase..26 Hemlise.26 Kligler..27 Teste de ONPG28 Meio de SIM.29 APP31 gua de Peptona32 Meio de Citrato de Simmons33 Caldo de Nitratos34 Meio de Urease35 Caldo de ODC e Caldo de LDC36 API37 Conjugao.39

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Tcnica Assptica
Se a tcnica assptica no for respeitada existem fortes possibilidades de contaminao do manipulador e/ou das culturas em estudo (facto que conduzir a falsos resultados).

Quando se trabalham com microrganismos devem respeitar-se as seguintes regras: Todo o material e meios de cultura que contactarem com a cultura devero estar estreis (indicador de esterilidade); No tocar na cultura com a ansa (ou fio) sem previamente a ter esterilizado; Flamejar sempre a boca do tubo, antes de introduzir a ansa (ou fio) e antes de o voltar a fechar; No tocar na tampa do tubo (ou algodo), que contacta com o bocal do tubo, com as mos, nem deixar que estes toquem a mesa ou outro material no estril; Deixar aberto o material estril apenas o tempo necessrio; No falar ou tossir sempre que estejam a trabalhar com meios de cultura (u outro material estril) abertos; Esterilizar a ansa correctamente antes e aps a sua utilizao; Os materiais contaminados devero ser imediatamente rejeitados em recipientes adequados.

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Exame a Fresco
Exame frequentemente realizado no laboratrio de Microbiologia e com ele podemos observar:

A forma (estudada melhor com as tcnicas de colorao);

Agrupamento (estudado melhor as tcnicas de colorao);

Principalmente a mobilidade:

Bactrias imveis Observar os movimentos brownianos ou de agitao molecular (distinguir da verdadeira mobilidade bacteriana) Ex: Staphylococcus aureus

Bactrias mveis Movimento pertrico (movimento ondulante com cambalhotas sobre si mesmos) Ex: Bacillus cereus

Movimento polar (movimento rpido e rectilneo) Ex: Pseudomonas aeruginosa

Os movimentos bacterianos so devidos aos flagelos, que so projeces especializadas provenientes do citoplasma que atravessam a parede celular. Notas: prefervel utilizar a pipeta de Pasteur.

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Tcnica de colorao
I. PREPARAO DO ESFREGAO

II. FIXAO DO ESFREGAO Fixao pelo calor Fixao pelo metanol

III. COLORAO Corantes - so sais que em soluo sofre a dissociao resultando um io orgnico positivamente carregado (catio) e um io inorgnico negativamente carregado (anio). A parte corada de um corante designada de grupo cromforo. Se o grupo cromforo um catio, ento o corante designado de corante bsico; se o grupo cromforo um anio, ento o corante designado de corante cido.

Corante bsico liga-se superfcie da clula que carregada negativamente. Nas clulas mortas o corante penetra a membrana celular e cora as estruturas internas negativamente carregadas (Ex: cristal violeta, azul de metileno, fucsina).

Corantes acdicos Repelido pela superfcie da clula negativamente carregada (Ex: tinta da China):

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Os processos de colorao microbiolgica so agrupados de acordo com a sua funo:

Colorao simples usa apenas um corante Colorao diferencial usa uma combinao de corantes, Ex.:

colorao de Gram, colorao de Ziehl-Neelsen Coloraes estruturais coram, preferencialmente, uma s parte da

clula, tornando possvel testar a presena ou a ausncia de tais estruturas, Ex.: colorao dos esporos, colorao das granulaes lipdicas, colorao da cpsula.

No microscpio:
A 10x diafragma fechado e condensador em baixo. A 100x diafragma aberto e condensador em cima.

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Colorao de Gram
Objectivo:
Morfologia bacteriana Agrupamento Principalmente com uma finalidade taxonmica: permite dividir as bactrias em 2 grandes grupos: As positivas ao Gram ou Gram positivas As negativas ao Gram ou Gram negativas

Colorao diferencial:
Corante primrio (cristal violeta) Corante secundrio (fucsina diluda)

Parede celular e colorao de Gram:

O diferente comportamento das bactrias em relao colorao de Gram deve-se ao facto dos dois grupos bacterianos apresentarem uma parede celular qumica e estruturalmente distinta.

As diferenas mais relevantes residem: a parede celular das bactrias Gram positivas no apresentam lpidos, enquanto que a das Gram negativas apresentam um elevado teor lipdico. a parede celular das bactrias Gram positivas apresentam um elevado teor em peptideoglicano (50-60%), enquanto que a das Gram negativas apresentam uma baixa percentagem deste componente.

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 Aquando da adio do cristal violeta (corante primrio) ao esfregao, este retido pelas bactrias de Gram positivo e de Gram negativo.

Aquando da adio da Soluo de Lugol (= Soluo iodo-iodeto) (mordente), este forma uma laca com o corante primrio, dando-se uma espcie de precipitao dentro da clula. O mordente tem como funo reforar a ligao do corante clula.

Quando se aplica a Soluo de acetona-iodada (descorante), esta passa livremente atravs da parede das bactrias Gram negativas, por dissoluo dos lpidos da parede, dissolvendo o complexo corado formado anteriormente. O descorante no consegue remover o corante primrio nas bactrias Gram positivas.

Quando se aplica a Fucsina diluda (corante secundrio ou contrastante) coram-se as bactrias de Gram negativo que foram anteriormente descoradas pelo diferenciador. As bactrias que retiverem o corante primrio so positivas ao Gram (coram de roxo) e as que retiverem o corante secundrio so negativas ao Gram (coram de vermelho).

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Tcnica de colorao de Gram

Preparar o esfregao e fix-lo pelo calor; Cobrir o esfregao com a soluo de cristal violeta e deixar actuar durante 30 segundos; Retirar o corante e lavar com soluo de Lugol. Cobrir com uma nova poro de Lugol e deixar actuar durante 30 segundos; Remover a soluo de Lugol e lavar com acetona-iodada / lcool durante 5 segundos; Lavar com gua; Cobrir o esfregao com fucsina diluda e deixar actuar durante 30 segundos; Lavar com gua e secar; Observar com objectiva de imerso e registar os resultados obtidos.

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Colorao da cpsula
A cpsula uma estrutura extracelular, geralmente de natureza polissacardica, produzida por certas bactrias, como o Streptococcus pneumoniae e a

Klebsiella, sendo uma estrutura bem organizada justaposta externamente

parede celular.

Esta estrutura mobiliza uma grande quantidade de gua, tendo um papel muito importante na proteco da bactria contra a dissecao. As bactrias capsuladas so geralmente muito virulentas para o Homem, dadas as propriedades antifagocitrias da cpsula bacteriana.

Por esta tcnica de colorao, a cpsula vai aparecer sob a forma de um halo claro, entre o meio circundante (corado pela nigrosina) e o corpo da bactria corado com um corante bsico (cristal violeta).

Na execuo da tcnica: Devemos secar a preparao temperatura ambiente, sem aplicar o calor, para no quebrar a camada de nigrosina e para no destruir a cpsula. Lavar com sulfato de cobre e no com gua para que a gua no dissolva a cpsula.

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Tcnica de colorao da cpsula

Colocar uma gota de nigrosina na extremidade duma lmina de vidro; Suspender a cultura na gota de nigrosina; Fazer um esfregao; Secar ao ar; Fixar com metanol (colocar uma gota na extremidade da preparao e deixar invadir a preparao); Corar com cristal violeta durante 2 minutos; Lavar o esfregao, removendo o corante com uma soluo de sulfato de cobre a 20%; Observar com a objectiva de imerso e registar os resultados obtidos.

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Colorao de Ziehl-Neelsen
Esta tcnica usada na colorao de bactrias lcool-cido resistentes. Bactrias lcool-cido resistentes so aquelas que possuem uma parede celular com uma elevada quantidade de lpidos, que incluem ceras, tendo caracteristicamente cidos miclicos com cadeias longas e ramificadas. Resistentes colorao por variados corantes para forar o corante a atravessar a parede celular: Utilizar um corante concentrado com aplicao de calor fragilizar a cera! Difcil remover uma vez coradas resistem descolorao por mtodos especiais

solues cido-lcolicas, sendo-lhes por isso atribudas a designao de bactrias lcool-cido-resistentes. As bactrias lcool-cido-resistentes aparecem coradas de vermelho e a flora associada (no lcool-cido resistente) aparece corada de azul.

Importncia clnica desta colorao: As bactrias com caractersticas lcool-cido resistentes pertencem ao Gnero

Mycobacterium e dentro deste gnero temos duas espcies muito

importantes: -

Mycobacterium tuberculosis agente da tuberculose, tb designado

de Bacilo de Koch (BK)

Mycobacterium leprae agente da lepra, tb designado de Bacilo de

Hansen

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Tcnica de colorao de Ziehl-Neelsen

Preparar um esfregao comprido da cultura a analisar; Fix-lo pelo calor (suavemente); Cobrir o esfregao com fucsina fenolada de Ziehl e aquecer at emisso de fumos brancos, durante 15 minutos (manter sempre a preparao coberta com corante); Lavar com gua corrente; Descorar com soluto de Ebner alternando com gua at no sair corante; Lavar com gua; Cobrir o esfregao com soluo de azul de metileno, durante 60 segundos; Lavar com gua; Observar com objectiva de imerso e registar os resultados obtidos.

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Meios de Cultura
As bactrias e os fungos so capazes de crescer in vitro em meios de cultura (que devem ser estreis) contendo essencialmente fontes de carbono, azoto, fsforo e gua. Os nutrientes essenciais para o crescimento variam entre os microrganismos, havendo microrganismos nutricionalmente exigentes. Os meios de cultura em bacteriologia tm geralmente pH ligeiramente alcalino. essencial no s que os meios de cultura possuam um pH dentro de determinados limites, mas tambm, que o valor deste no sofra grandes variaes durante o crescimento bacteriano.

Quanto finalidade o meio de cultura pode ser: Enriquecido: contm substncias nutritivas para as bactrias mais exigentes (gelose de sangue e gelose de chocolate); Selectivo: contm substncias que inibem o crescimento de algumas bactrias em detrimento de outras (Manitol e MacConkey); Diferencial: que nos do a visualizao das actividades metablicas da bactria (fermentadoras ou no fermentadoras da lactose no meio de Cled).

Esterilizao: Preparao de um meio de cultura 1. Pesar o p 2. Adicionar gua e dissolver a quente 3. Esterilizar (papel indicador) 4. Autoclavar Hmida autoclave com fita amarela que fica preta (121 C 15min) material de plstico Seca estufas com fita verde (180-200 C) material de vidro

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Isolamento
Tcnica das estrias em 4 quadrantes

1: cultura na placa. 2: esterilizar a ansa; estrias a sair do 1 quadrante. 3: esterilizar a ansa; estrias a sair do 2 quadrante. 4: sem esterilizar, fazer estrias ocupando o espao que resta.

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Meio de MacConkey
Composio:
Peptonas.............. 17 g Fonte de C e N Lactose................ 10 Fonte energtica de C Sais biliares......... 1,5g Inibidor NaCl.................... 5,0g Equilbrio inico Gelose.................. 13,5g Cristal violeta....... 0,01g Inibidor Vermelho neutro ... 0,03g Indicador de pH

(A) Colnias vermelhas pH cido. As bactrias fermentaram a lactose: LACTOSE + (B) Colnias incolores pH neutro ou bsico. As bactrias no fermentaram a lactose: LACTOSE Neste meio, o cristal violeta e os sais biliares no permitem o crescimento de bactrias Gram positivo e de fungos meio selectivo. As bactrias de Gram negativo so diferenciadas neste meio pela capacidade de fermentar a lactose. Os fermentadores da lactose do colnias vermelhas e os no fermentadores do colnias incolores, devido ao indicador vermelho neutro.

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Meio de Cled
Composio:
Peptonas Extracto de carne Lactose L-cisteina Azul de bromotimol Agar pH 7,3

A gelose CLED permite diferenciar as bactrias que fermentam a lactose das que no fermentam (indicador azul de bromotimol). As bactrias lactose (+) produzem colnias amarelas plidas ou amarelas, por acidificao do meio. As bactrias que no fermentam a lactose produzem colnias verdes, azuis ou incolores. A composio do meio (fraco contedo em electrlitos) previne a invaso pelo

Proteus.

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Meio de Manitol
Composio:
Peptonas.........10g Extracto carne.. 1g D Manitol 10 g NaCl............... 75g V. Fenol........... 0,025g Agar............... 15g gua destilada 1 L pH = 7,4

A elevada concentrao em NaCl no permite o crescimento de bactrias Gram negativo meio selectivo. O Staphylococcus aureus produz, neste meio, colnias amarelas, devido fermentao do manitol e presena do indicador vermelho de fenol que amarelo na zona cida.

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Meios de Gelose
So meios de isolamento especialmente designados para facilitar o crescimento de microrganismos fastidiosos, bactrias Gram positivo e todas as espcies encontradas nas amostras clnicas, contendo uma mistura de peptonas particularmente adaptadas cultura destes microrganismos. Gelose simples: crescimento de bactrias no muito exigentes

nutricionalmente. Gelose de sangue: no selectivo, mas diferencial permite distinguir bactrias com diferentes hemolisinas. Gelose de chocolate: no selectivo nem diferencial; contm sangue como a gelose de sangue mas neste o sangue foi aquecido, da a cor de chocolate.

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Meio de OF
Responde a que via que a bactria recorre para a degradao da glucose, se a fermentativa ou se a oxidativa. um meio semi-slido de cor verde, uma vez que o seu indicador o azul de bromotimol, e deve ser inoculado por picada central (utilizando o fio e no a ansa). Ateno: antes de os 2 tubos serem inoculados devem ser regenerados por fervura, a fim de expulsar o O2 incorporado no meio. Um dos tubos tapado com parafina a fim de criar um ambiente de anaerobiose num dos tubos.

A. No houve reaco. B. Aerbio facultativo (fermentao no 1 tubo e eventual oxidao no 2 tubo) C. Aerbio estrito (oxidao no 2 tubo) D. Poderia haver um 3 caso em que obteramos o tubo tapado com parafino amarelo e o sem parafina verde, tratar-se-ia de um anaerbio estrio.

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Caldo de MR-VP
Com este caldo pretende-se responder qual a via fermentativa da glucose: cidos fortes ou cidos fracos. Dividir o contedo em dois tubos para fazer os dois diferentes testes, o teste do MR e o teste do VP.

O vermelho de metilo, indicador utilizado, tem uma zona de viragem a pH = 4, ou seja, a viragem d-se apenas na presena de cidos fortes. O teste do MR positivo quando o indicador vira para vermelho, o que significa que a fermentao da glucose se faz com produo de cidos fortes.

No teste do VP, na presena de KOH, adicionam-se umas gotas de

-naftol

que vai reagir com o cido formado. No caso da formao de um cido fraco, a acetona, vai-se formar diacetil e creatina (um composto de cor vermelha). Ento, podemos obter os seguintes resultados: o MR+ e VP- : cidos fortes! o MR- e VP+ : cidos fracos!

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Caldo Glucosado / Caldo Lactosado

Caldos de acar servem para averiguar se determinado acar fermentado pela bactria em estudo e se, nesse caso, fermenta com produo (ou no) de gases. Como o prprio nome indica, o caldo glucosado possui glucose como fonte de carbono e o caldo lactosado lactose. O primeiro caldo a ser testado o glucosado, uma vez que se este der negativo no testamos o caldo lactosado, pois se a bactria no fermenta glucose no fermenta mais nenhum acar. Estes caldos so meios lquidos de cor alaranjada devido ao indicador v. de fenol (por ser meio lquido que alaranjado e no vermelho). Este indicador amarelo na zona cida e vermelho na zona alcalina. Os tubos contendo estes caldos tm no seu interior um pequeno tubo de vidro (tubo de Durhan) que deve estar sem ar no seu interior antes de se inocular (agitar se necessrio para retirar o ar do seu interior).

Resultados:
I. Houve fermentao do acar com produo de gases (CO2 e H2). II. No houve fermentao do acar. Nota: no faz sentido um resultado negativo para a fermentao do acar e positivo para a produo de CO2 e H2.

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Prova da Catalase
Muitas bactrias durante o seu metabolismo produzem H2O2 e radicais livres de oxignio, nocivos para a integridade celular. As bactrias aerbias estritas e anaerbias facultativas produzem superxido dismutase e catalase que levam destruio desses composto.

A deteco da catalase faz-se mergulhando clulas bacterianas numa gota de gua oxigenada a 3% (10 volumes), ocorrendo a libertao gasosa de O2.

Interpretao:
o Formao de bolhas: bactria catalase + o Sem formao de bolhas: bactria catalase

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Prova da Coagulase

As coagulases so enzimas que coagulam o plasma do sangue por um mecanismo semelhante ao da coagulao normal. A formao de um cogulo de fibrina protege a bactria da fagocitose. A coagulase um bom indicador da patogenicidade da bactria.

Plasma + suspenso bacteriana

incubar!

Prova da Oxidase
Nas bactrias aerbias obrigatrias, o aceitador final de electres o oxignio. A enzima citocromo c oxidase cataliza uma das reaces da cadeia respiratria.

No entanto a reaco que se testa nesta prova no esta, mas sim uma reaco indirecta:

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Prova da DNase
Algumas bactrias possuem uma enzima, a DNase, que degrada o DNA das clulas hospedeiras. A presena desta enzima est relacionada com a patogenicidade da bactria e a sua pesquisa importante na identificao das bactrias pertencentes ao gnero Staphylococcus. Semear a bactria em estudo numa placa de meio com DNA Incubar Adicionar umas gotas de HCl 1N

Interpretao:
o Halo transparente: bactria DNase + (DNA degradado e no ocorre pp com HCl) o Sem halo transparente: bactria DNase (DNA intacto pp com HCl)

Prova da Hemlise
As hemolisinas so enzimas que lisam os eritrcitos. Algumas bactrias do gnero Streptococcus possuem hemolisinas sendo o tipo de hemlise estudado para posterior identificao das distintas espcies.

Interpretao:
o Bactria -hemoltica (hemlise completa): halo transparente redor das colnias o Bactria -hemoltica (hemlise halo esverdeado redor das colnias parcial):

o Bactria -hemoltica (sem hemlise): sem halo em redor das colnias

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Prova de Kligler
Composio:
Peptonas fonte de carbono e cistena (dissulfurase da cistena?) Da ser um meio diferencial

Lactose................... 10g Glucose................... 1g NaCl Citrato ferro amoniacal Tiossulfato sdio V.fenol Gelose

reage com H2S originando pp preto de FeS fonte de enxofre (produo de H2S)

Meio de cultura slido em rampa em que a inoculao se faz por picada central e estria superfcie da rampa (nico meio inoculado desta maneira). Esta prova permite-nos observar: Fermentao de aucares glucose l-se na parte de baixo do tubo e a lactose na rampa, pela mudana de cor do indicador; Produo de H2S pp preto de sulfureto de ferro; Produo de CO2 e H2 meio quebra e levanta no fundo (hidrogenoliase frmia +). I. Tubo por inocular II. Fermenta glucose e no fermenta lactose III. Fermenta glucose e lactose e produz CO2 e H2 IV. Fermenta glucose e no fermenta lactose com produo de H2S e CO2 e H 2. V. No fermenta nenhum dos acares. No caso II, a bactria aps esgotar a glucose, como no degrada a lactose, passa a degradar aminocidos (desaminao aerbia alcalinizao do meio cor vermelha superfcie). TEMOS de fazer o teste do ONPG.

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Teste de ONPG
Existem estirpes bacterianas fermentadoras da lactose que no manifestam o fentipo Lac
+

por falta de uma permease, embora produzam a enzima -

galactosidase. A presena de -galactosidase averiguada pelo teste do ONPG, uma vez que este possui ligaes (1 - 4) como a lactose mas no entanto uma molcula mais simples, permitindo -galactosidase degrad-lo sem a necessidade da permease. Este teste requer que a bactria seja oriunda de um meio lactosado visto que esta enzima indutvel e a lactose funciona como indutor.

Da quebra do ONPG resulta o ortonitrofenol (composto amarelo), que confirma a presena da -galactosidase.

Nota: fazer a suspenso em gua e nunca em soro.

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Meio de SIM

Composio:

O meio de SIM um meio semi-slido de cor amarelada e inoculado por picada central, usado para observar: S produo de sulfureto de hidrognio, H2S; I produo de Indol; M mobilidade. Produo de H2S:

Produo de indol:

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Mobilidade:

I. Bactria mvel. II. Bactria imvel com

produo de indol. III e IV. Produo de H2S.

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Prova da fenilalanina desaminase (APP)

As bactrias possuidoras de fenilalanina desaminase produzem cido

fenilpirvico (APP) e amnia a partir da fenilalanina do meio. A adio de uma soluo frrica em meio cido sobre as colnias produz uma cor verde, devido ao complexo formado entre o io frrico e o APP. O APP meio slido em rampa de cor amarelada e a inoculao feita por estria superfcie (na rampa). Inocular Incubar Adicionar cloreto de ferro e esperar

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gua de Peptona
A gua de peptona um meio lquido usado para avaliar a produo de indol.

Inocular por suspenso Incubar Adicionar reagente de Erlich insolvel na gua de peptona.

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Meio de Citrato de Simmons

Algumas bactrias tm a capacidade de utilizar o citrato como fonte de carbono. Para que seja possvel a utilizao desta molcula orgnica, a clula deve possuir a enzima citrato permease e a citrase. A prova do citrato pe em evidncia a presena da citrase. O meio de citrato um meio slido em rampa de cor verde (devido ao indicador que o azul de bromotimol) inoculado por estria superfcie, pois ao metabolismo do citrato necessrio O2.

A cor azul forte deve-se ao excesso de citrato de sdio (Na) que reage com o CO2 na presena de H2O levando formao de produtos alcalinos (Na2CO3), o que alcaliniza o meio de cultura (pH ).

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Caldo de Nitratos
Algumas bactrias aerbias e anaerbias facultativas podem em condies de anaerobiose realizar respirao anaerbia tendo como aceitador final de electres o anio nitrato. O anio nitrato reduzido a produtos como: azoto molecular, nitritos e amnia. Nitratos Inocular por suspenso Incubar Adicionar reagente A e reagente B Se der negativo, adicionar p de zinco (agente redutor) Nitritos N2

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Meio de urease
Algumas bactrias possuem uma enzima capaz de degradar a ureia em amnia e CO2, a urease. A prova da ureia em meio slido em rampa evidncia a presena desta enzima. Ateno! Este meio no contm glucose para evitar falsos negativos: se a bactria possusse urease e fosse fermentadora da glucose ir-se-ia observar uma cor amarela (devido aos cidos produtos da fermentao) que iria mascarar o resultado positivo urease.

Inocular por estria superfcie Incubar

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Caldo de ODC e LDC

Os aminocidos so usados geralmente como fonte de N para o crescimento bacteriano. Estes podem ser metabolizados por desaminao ou por descarboxilao. As descarboxilases so enzimas bacterianas que removem o grupo carboxilo dos aminocidos (piridoxal, constituinte destes caldos, uma coenzima que aumenta a actividade das descarboxilases), sendo este um passo no metabolismo anaerbio dos aminocidos. ODC: ornitina descarboxilase LDC: lisina descarboxilase Inocular o meio por suspenso Adicionar parafina lquida para promover a fermentao da glucose na ausncia de O2 Incubar

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API 20 E
uma miniturizao de 20 provas bioqumicas frequentemente utilizado na identificao de enterobactrias e outras Gram negativas.

O sistema consiste: Num suporte inferior tabuleiro de incubao Tira de API Tampa. Poos: Cpula Tubo

Procedimento: I. Colocar gua no local apropriado no tabuleiro de incubao. Identificar com nome e data. II. Com tcnica assptica, fazer suspenso de bactria em soro fisiolgico 5mL. III. Colocar tira de API no tabuleiro de incubao ligeiramente inclinado. IV. Com pipeta esterilizada colocar suspenso nos tubos API: o Encher tubos dos testes sem marcas; o No encher completamente os dos tubos sublinhados, para depois encher com parafina; o Encher tubos e cpulas de testes com .

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Leitura do API: Segundo uma tabela dada Provas agrupadas 3 a 3 e cada prova tem uma cotao (1, 2 ou 4) O teste vai dar um cdigo de 7 algarismos para a bactria em estudo, que vai ser introduzido num computador com software adequado dizendo-nos de que bactria se trata, se possvel (se os resultados so minimamente concordantes). Por exemplo: 1 ONPG + 2 ADH + 1+2+4=7 Cdigo: 7 1 _ _ _ _ _ 4 LDC + | 1 ODC + 2 CIT 1+0+0=1 4 H2S -

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Conjugao
Conjugao a transferncia de DNA plasmdico de uma bactria dadora para uma bactria receptora.

Mating: contacto fsico entre a bactria dadora e a bactria receptora.

Bactria receptora: Estirpe 999: Klebsiela Pneumoneae Resistente a AMX (amoxicilina) resistncia codificada por DNA plasmdico Fermentadora de lactose (lac+)

Bactria receptora: Estirpe K802: E. coli Resistente ao cido Nalidcico resistncia codificada por mutao no DNA cromossmico (no alvo de actuao deste antibitico, que a topoisomerase II) No fermenta a lactose (lac-)

Na prtica Com tcnica assptica, na placa de GEL, colocar no centro da placa uma gota de bactria dadora e por cima uma gota de bactria receptora (no importa a ordem).

Transconjugantes:

Resistentes a ambos os antibiticos; possuem todo o fentipo das bactrias receptoras (lac-). 39

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Placas de conjugao Vamos encontrar: bactrias dadoras, receptoras e transconjugantes. Fazemos uma diluio em soro

fisiolgico, com tcnica assptica, e espalhamos (espalhamento com pipeta de vidro dobrada na ponta dobras feitas chama do bico de Bunsen) numa placa de seleco que contenha os dois antibiticos , crescendo apenas as bactrias transconjugantes neste meio. Aps isolarmos em MacConkey com ambos os antibiticos encontramos colnias: Amarelas Vermelhas Amarelas a mudar para vermelho As colnias de bactrias transconjugantes deveriam dar colnias amarelas no meio de MacConkey, uma vez que possuem todo o fentipo das bactrias receptoras (lac-).

Colnias vermelhas?
Verdadeiras transconjugantes que mudaram de cor devido acidificao do meio de cultura porque o prprio antibitico ao se degradar origina produtos cidos. Dadoras que conseguiram crescer: sofreram mutao espontnea na topoisomerase II no local de aco do cido nalidcico. Como verificar?? Fazer um isolamento em meio de MacConkey mas sem antibiticos j no h acidificao do meio por degradao de antibitico, logo as transconjugantes j no vo mudar de cor. Microbiologia Geral Laboratorial 3 ano 2007/2008

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 Colnias vermelhas: dadoras mutadas Colnias amarelas: transconjugantes.

Colnias amarelas??
Verdadeiras transconjugantes Receptoras: a degradao progressiva da amoxicilina pelas Blactamases vai provocando nveis cada vez mais baixos do antibitico, to baixos que as receptoras acabam por conseguir crescer. Estas crescem volta das verdadeiras transconjugantes, denominando-se de colnias satlite (receptoras). Como verificar?? Fazer um isolamento em meio de cultura com amoxicilina. S crescem as verdadeiras transconjugantes.

Microbiologia Geral Laboratorial 3 ano 2007/2008

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