CONTROL DE CALIDAD BIOLOGIA MOLECULAR

EN

LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR

El laboratorio de Biologa Molecular es el encargado de realizar los ensayos de Determinacin de ADN contaminante en muestras del ingrediente farmacutico activo (IFA) y muestras de proceso de cada uno de los productos del Centro. Estos ensayos se realizan por modernas tcnicas de biologa molecular entre las que se encuentran la hibridacin de cidos nucleicos y la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Este laboratorio se encarga adems de realizar los anlisis de estabilidad de los Bancos de Clulas Primario (BCP) y los Bancos de Clulas de Trabajo (BCT) de todas las producciones del Centro y tambin responsable de la certificacin y custodia del BCP y de la certificacin del BCT. En este laboratorio se realiza la preparacin de los Bancos y chequeo de las cepas microbiolgicas que intervienen en las producciones del CIGB.

CONTROL DE CALIDAD
La Direccin de Control de la Calidad del CIGB, tiene como su principal recurso, a un colectivo de trabajadores dedicado a un conjunto de objetivos y tareas en funcin de lograr un Sistema de Control eficiente en nuestro Centro. El rea est comprometida con todos sus clientes (ya sean internos o externos) con respecto a la eficiencia y eficacia en los resultados de su trabajo, como va de mejoramiento continuo en todos sus procesos. La Direccin de Control de la Calidad se mantiene en bsqueda e investigacin constante con respecto a las normas y regulaciones aplicables a la industria biofarmacutica como necesidad imperiosa para la proyeccin de nuestro trabajo en funcin de lograr la calidad de los productos que oferta el CIGB as como la satisfaccin y confianza de los clientes. La calidad ser la imagen del CENTRO DE INGENIERA GENTICA Y BIOTECNOLOGA como organizacin comprometida con sus clientes y con la sociedad. La Direccion tiene entre sus funciones fundamentales las relacionadas con el muestreo, las especificaciones, los ensayos y la evaluacin de la calidad de los productos que se generan en la empresa. Adems debe comprobar y poner en prctica todos los procedimientos de control, evaluar, mantener y almacenar los materiales de referencia, asegurar que se controle la estabilidad de los ingredientes farmacuticos activos y los productos terminados. La Direccion de Control de la Calidad es el responsable de autorizar o rechazar las materias primas y los productos intermedios. Para acometer estas funciones, la Direccin est compuesta por dos Departamentos y tres grupos de trabajo:

Departamento de Biolgicos

En este Departamento es donde se ejecutan las tcnicas analticas relacionadas con la determinacin de la actividad biolgica in vivo e in vitro, cuantificacin e identificacin de protenas contaminantes y protenas de inters por mtodos inmunolgicos tipo ELISA, Western blot, Inmunodot, deteccin de ADN contaminante del hospedero por mtodos de hibridizacin, reacciones en cadena de la polimerasa (PCR), almacenamiento y control de los Bancos de Clulas Primarios. Adems cuenta con el laboratorio de microbiologa encargado de todo el control y monitoreo microbiolgico de los procesos, reas y sistemas auxiliares de las plantas de produccin. Departamento Fsico-Qumico En el Departamento Fsico-Qumica es donde se desarrollan los mtodos de identificacin y control de pureza mediante mtodos cromatogrficos de alta resolucin, cromatografas gaseosas y electroforticas. Mtodos espectrofotomtricos para la cuantificacin de protenas, aditivos y preservante en las preparaciones farmacuticas y para el control de las propiedades fsicas y qumicas de los sistemas auxiliares Aseguramiento Analtico El grupo de Aseguramiento analtico tiene diversas funciones dentro de la Direccion de Control de la Calidad. Tiene la funcin del seguimiento de las Buenas de Prcticos de Laboratorio segn el estado del arte y velar por el cumplimiento de las mismas mediante las auditorias internas a los laboratorios de control. Tiene la funcin de trazar la poltica relacionada con la validacin de los mtodos analticos, confeccin de los programas de validacin y revalidacin de las tecnicas, as como la aprobacin y discusin de los protocolos de validacin.

En este laboratorio se realizan adems otros ensayos moleculares como anlisis de restriccin, determinacin de la concentracin de ADN por D.O a 260 nm y la determinacin de RNA contaminante y % de supercoil por electroforsis de agarosa a productos de ADN. En el presente control se envi a los participantes un tubo con suero en el que el laboratorio de referencia detect la presencia del DNA virus de la hepatitis B (VHB) de forma cualitativa. La muestra se acompaaba de una historia clnica que corresponda a un paciente varn de 30 aos de edad, con antecedentes de adiccin a drogas por va parenteral y cuyo consumo negaba desde haca ocho aos. Tena anticuerpos frente al virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), pero no segua tratamiento porque sus niveles de clulas CD4+ eran elevados. Durante su poca de adiccin present un cuadro clnico de hepatitis B aguda que posteriormente evolucion a hepatitis crnica con marcadores serolgicos de replicacin activa. En el ltimo control se observ un ligero aumento de las transaminasas y se le plante el inicio del tratamiento frente al VHB, para lo que fue necesario conocer su situacin actual con respecto al VHB. Se solicit a los participantes que procesaran el suero y realizaran la deteccin cualitativa del DNA del VHB, as como la formulacin de los comentarios que considerasen oportunos.

ANLISIS DE LOS RESULTADOS DE LA DETECCIN DE DNA VHB El suero problema fue enviado a 69 laboratorios de los cuales 46 remitieron hoja de respuesta, lo que supone un porcentaje de participacin del 66,7%, inferior al de otros controles. Se aceptaron como vlidas para el anlisis de los resultados las respuestas que realizaron la deteccin cualitativa o cuantitativa del VHB. El nmero de resultados analizados fue de 43 (91,5%), ya que cuatro laboratorios no realizaron dichas pruebas, tres de ellos por no disponer de la tcnica y uno por no realizar tcnicas de biologa molecular (lo que sorprende al estar inscrito en este control); por el contrario, un laboratorio llev a cabo dos detecciones (cualitativa y cuantitativa). De estos 43 anlisis, 39 fueron positivos, mientras que en los restantes casos no se detect el genoma del VHB (tabla 1). En el caso de los laboratorios que realizaron la deteccin cuantitativa, la mayora inform del nmero de copias de DNA del VHB, aunque este

aspecto no se analiza en el presente control, ya que la muestra haba sido liofilizada y, por lo tanto, exista variacin de un vial a otro en el nmero de copias.

Tabla 1. Resultados de la deteccin de DNA del VHB. Deteccin DNA Nme Porcentaje sobre de VHB ro Tcnica Participa s ntes Positiva 39 90,7 90,4 Negativa 4 9,3 9,6 Total 43 100,0 100,0 La PCR fue el mtodo ms usado y, dentro de este grupo, una tcnica de PCR anidada (Cobas-Amplicor, Roche), informada por el 60,5%. Le sigue en frecuencia un mtodo de desarrollo propio (16,3%). Como mtodo cualitativo los participantes utilizaron la hibridacin, siendo el segundo mtodo ms frecuente (7 participantes) e informndose las marcas: Bayer (4,6%), DiaSorin (4,6%) y Digene (7,0%). Por ltimo, en una ocasin se realiz una PCR en tiempo real de Roche (2,3%). El resto de los resultados se especifican en la tabla 2. Tabla 2. Mtodos y marcas utilizados en la deteccin del VHB Nme Mtodo Marca % ro b-DNA, 2 4,6 Bayer Hibridacin DiaSorin 2 4,6 Digene 3 7,0 Desarrollo 7 16,3 propio Cobas26 60,5 PCR Amplicor Need 1 2,3 No 1 2,3 informada PCR en Roche 1 2,3 tiempo real Total 43 100,0 Por lo que respecta a los laboratorios que obtuvieron resultados negativos, en dos ocasiones utilizaron la PCR anidada Roched CobasAmplicor, en otra una hibridacin de Digene y en la otra una de DiaSorin.

COMENTARIOS DE LOS PARTICIPANTES

En el presente control se analizaron slo 14 hojas de respuesta de participantes que efectuaban algn tipo de comentario, en una ocasin dos, por lo que el nmero total de comentarios fue de 15. En general, no fueron muy extensos pero hubo que sintetizar alguno por parte del Programa de Control de Calidad. Se han agrupado en la tabla 3. El comentario ms frecuente realizado por los participantes se refiere al tipo de tcnica de deteccin del DNA del VHB; la mayora de los laboratorios no realizan la deteccin cualitativa que era lo que se solicitaba, sino la cuantitativa ya que segn afirman algunos participantes, sta es ms sensible. En varias ocasiones los comentarios se refieren a la ampliacin de los marcadores de hepatitis B o de otras infecciones relacionadas con el antecedente personal de drogadiccin, existiendo varias posibilidades que se detallan en la tabla 3. En una ocasin un participante confirma la hepatitis crnica activa por VHB tras realizar dichos marcadores serolgicos en la muestra remitida. Por ltimo, un participante comenta que el tratamiento del paciente se debe realizar con interfern a o con lamivudina y otro que una vez instaurado se debe hacer un seguimiento a los tres meses mediante una PCR cuantitativa. Tabla 3. Comentarios microbiolgicos realizados por los participantes. Comentario Nmero %a Slo realizamos deteccin cuantitativa y no 3 20,0 cualitativa La PCR cuantitativa es ms sensible que la 2 13,3 cualitativa Hibridacin en el lmite bajo y PCR in house 1 6,7 positiva Marcadores HBsAg y HBeAg negativos 1 6,7 Marcadores HBsAg y HBeAg positivos con IgM 1 6,7 VHB negativa Infeccin crnica activa VHB confirmada 2 13,3 Descartar VHC, VIH y superinfeccin por VHD al 2 13,3 ser ex ADVP Antes del tratamiento hacer HBeAg, anti-HBe y 1 6,7

cuantificar DNA Tratamiento y seguimiento de la PCR a los 3 meses Tratamiento con interfern a o lamivudina Total comentarios a Sobre las 14 hojas con comentarios.

1 1 15

6,7 6,7 107,1

UTILIZACIN DE LABORATORIO EXTERNO

Por lo que respecta a la necesidad de utilizar un laboratorio externo para la deteccin del DNA del VHB, por parte de los laboratorios que informaron algn resultado (42), obtenemos los siguientes datos: 32 (76,2%) dicen no utilizarlo, ocho lo hacen (19,0%) y dos (4,8%) no ofrecen informacin acerca de este dato. Fuente: http://www.seimc.org/control/infdef2003/bmol103.htm

Control de calidad Sistema informatico:

El sistema informatico permite llevar una correcta administracin de la informacin y de los resultados manejando la totalidad de los procesos administrativos y analiticos. Consta de una red integral de computacin (nt-windows) provista de un server con pantalla y teclado y nueve puestos de trabajo con cpu, teclado, pantalla y mouse con conexin a internet por red a travs de banda ancha fibertel con ip fija, cinco impresoras blanco y negro y color, dos impresoras laser y un centro de copiado (fotocopias, scanner e impresora ) blanco , negro y color. Con los siguientes software : windows 2000 , office 2000 , dos , internet microsoft outlook y un programa de gestion de centros de diagnostico datatech versin windows 2004 con atencin a distancia via internet que cubre las areas:

Recepcin y atencin al publico:

Normativas de las obras sociales. Costo de los estudios . Instrucciones tanto para el paciente como para el tcnico. Confeccion de planilla de trabajo. Impresin del informe con los datos obtenidos. Sistemas de alarmas para validacin de datos. Controles internos . Calculo de presupuestos. Obtencin de duplicados. Consulta alfabetica de pacientes . Antecedentes y evolucion . Historias clinicas. Procesos administrativos: Sistemas de facturacin por nomenclador o por listas de precios. Modalidad de prestacin , permitiendo el uso conjunto de varios nomencladores simultneamente. Archivo de instituciones con datos y forma operativa de cada una de ellas.

Emisin de rendiciones y facturaciones de acuerdo a las normas impositivas vigentes. Cuentas corrientes . Caja . Listados de profesionales. Operadores y tcnicos: Identificacin de cada uno de los operadores autorizados . Visualizacion de tareas . Stock de reactivos . Estadsticas de determinaciones . Perfiles.

CONTROL DE CALIDAD:

PEEC: PROGRAMA DE EVALUACIN EXTERNA DE CALIDAD DE FABA PREVECAL: EXTERNAL QUALITY ASSESSMENT SCHEME INTERNACIONAL NORMAS: EL PRESENTE MANUAL RESPONDE A LAS NORMAS: ISO 25: EVALUACIN DE LABORATORIOS REQUICITOS GENERALES PARA LA COMPETENCIA DE LABORATORIOS DE CALIBRACIN Y ANLISIS. ISO 15.189: GESTION DE LA CALIDAD DEN LABORATORIOS CLINICOS ISO 9001: SISTEMAS DE GESTION DE LA CALIDAD ISO 10.013: MANUAL DE LA CALIDAD . AUDITORIA INTERNA ISO 80.058: TRANSPORTE DE MATERIAL BIOLOGICO

BIOLOGA MOLECULAR

El laboratorio BIO LAB siempre a la vanguardia en el desarrollo e implementacin de nuevas tecnologas para el diagnostico y teniendo en cuenta los avances de la ciencia creo el rea de biologa molecular con el objetivo de abordar las nuevas metodologas de diagnostico. El descubrimiento de la estructura y funcin del ADN, la identificacin del cdigo gentico y la comprensin del proceso de sntesis proteica , generaron un importante adelanto en el campo biomdico durante la dcada pasada. El desarrollo de la tecnologa del ADN recombinante, donde se unen diversas tcnicas de laboratorio con aplicaciones informticas, brindan hoy un amplio espectro de posibilidades para la obtencin de datos tanto para los fines diagnsticos como para el desarrollo y la investigacin. Los patrones clnicos de diferentes patologas estn basados en cambios detectables en el cdigo gentico que se traducen tanto en estructuras anmalas como funcionamiento errneo de las protenas involucradas en los procesos de sntesis.

Tienen ahora explicaciones basadas en cambios detectables en el cdigo gentico que se traducen en estructuras anormales y funcionamiento errneo de las protenas involucradas. El proyecto genoma humano que involucra la secuenciacin completa de los tres mil millones de nucletidos que forman el ADN constituye una enorme base de datos utilizados para el diagnostico medico y los tratamientos futuros. Esto genera un nuevo campo en la de la bioqumica clnica : el diagnostico biomolecular aplicado a la deteccin y monitoreo teraputico de enfermedades infecciosas , oncolgicas genticas , neurolgicas, metablicas y autoinmunes. Esto requiere la utilizacin de instrumental diferente al de la practica bioqumica cotidiana y personal altamente especializado para la implementacin de tcnicas que requieren rigurosos procesos de control y validacin.

Normas de bioseguridad

El correcto manejo y eliminacin de material descartable y de residuos patogenicos se realiza segn las normas legales vigentes y de acuerdo al manual de procedimientos de seguiridad e higiene del laboratorio . Las normas de seguridad en el laboratorio molecular son equivalentes al laboratorio clinico en lo que se refiere a manejo y decontaminacion como asi tambien a los cuidados orientados a preservar la integridad de los operadores y el medio ambiente. A efectos de evitar contaminaciones con material gentico que alteraran los resultados obtenidos se pauta una circulacin unidireccional para el procesamiento evitando los fenmenos de carry-over. Fuente: http://www.biolab01.com.ar/Calidad.pdf