CONSERVACION IN VITRO DE CINCO ESPECIES DE CACTACEAS EN PELIGRO DE EXTINCION DE GUATEMALA, DISTRIBUDAS EN LOS DEPARTAMENTOS DE EL PROGRESO Y ZACAPA.

Informe de Avance Ing. Agr. Luis Gerardo Molina Monterroso Ing. Agr. MSc. Hctor Alfredo Sagastume Mena Licda. MSc. Aura Elena Suchini Farfn 1. PALABRAS CLAVE Conservacin, in vitro, biodiversidad, cactaceae, Cephalocereus maxonii, Melocactus ruestii, Myrtillocactus eichlamii, Nyctocereus guatemalensis, Stenocereus eichlamii. 2. RESUMEN Las cactceas se encuentran en el ndice 2 de la Lista Roja de Flora Silvestre que public el Consejo Nacional de Areas Protegidas en enero del ao 2002 y en el apndice II de CITES. El propsito de este proyecto fue encontrar los medios de cultivo apropiados para la propagacin y la conservacin in vitro de cinco diferentes especies de cactceas en peligro de extincin, distribudas en los departamentos de El Progreso y Zacapa. Este proyecto sera el inicio para la creacin de un banco de germoplasma de especies de cactaceas con potencial ornamental, alimenticio y/o de exportacin en peligro de extincin en el pas. 3. INTRODUCCION El crecimiento de las poblaciones rurales y su alto ndice de marginalidad, la oportunidad de tener acceso a recursos limitados a travs de la venta de ejemplares colectados en los ecosistemas naturales y el cambio de uso del suelo, son las principales causas de presin sobre las especies que consideramos amenazadas o en peligro de extincin. Poco podemos hacer por medio de la legislacin para la conservacin de los recursos biticos, porque la presin para la explotacin est asociada a la marginalidad, al crecimiento de la poblacin y al desinters por los recursos naturales. En diversas partes del mundo existe aficin por el cultivo de cactceas, aficin que radica en su diversidad de formas, como en la belleza de sus flores efmeras. Las cactceas no slo tienen importancia econmica por sus cualidades como plantas ornamentales, las hay tambin alimenticias, forrajeras e industriales. Aparte de la importancia comercial que puedan tener, tanto para el desarrollo econmico de las regiones donde abundan, es importante considerar el rol ecolgico que desempean. En los ecosistemas de las regiones ridas y semiridas del continente americano, las cactceas son cruciales en la estabilidad de los mismos, por lo que se hace necesario investigar y desarrollar tecnologas que permitan su preservacin, pues debido a sus caractersticas fisiolgicas especiales, las cactceas son susceptibles a la extincin cuando ocurren cambios bruscos en su medio. Con stas tecnologas se puede proteger su diversidad y as preservar el recurso para su aprovechamiento.
-1-

Investigador Principal Investigador Asociado Investigadora Asociada

Conservar especies vegetales requiere de mecanismos ex situ. Uno de los ms exitosos es la propagacin artificial; tanto por los medios tradicionales, por semilla y vegetativos, as como por las tcnicas de cultivo in vitro o micropropagacin. Las tcnicas de propagacin vegetativa inclusive por cultivo in vitro permiten incrementar rpidamente el numero de individuos pero disminuye la variabilidad. Recurrir a la tcnica de cultivo in vitro o micropropagacin ha mostrado que disminuye el tiempo que requiere la planta para alcanzar una talla comercial o para que pueda sobrevivir al transplante en su medio original. Cualquier planta de este planeta posee diferencias de todo tipo que se perdern al extinguirse, por esto cualquier planta en peligro o endmica, debe protejerse, estudiarse y reproducirse en sus hbitats. Actualmente existen muchas especies de cactus en peligro de extincin, en los listados CITES (organismo compilador de especies en peligro) aparecen de todos los desiertos del planeta. Algunas que no estaban en riesgo hace unos aos, lo estn actualmente y dichos listados aumentan con los aos. La conservacin in vitro tiene muchas ventajas: permite el almacenamiento de gran nmero de especies en un espacio reducido, se elimina el riesgo de daos por plagas y enfermedades, es posible producir y mantener plantas libres de virus con altas tasas de multiplicacin y todo esto independiente de las condiciones climticas. Con este proyecto no slo se estarn conservando, a mediano plazo, especies en peligro de extincin del pas, como las cactceas, sino que tambin se estar generando informacin valiosa para aquellas personas que quieran dedicarse a su cultivo y exportacin, evitando con ello la extincin de especies. Adems, este proyecto dar inicio a la formacin de un banco de germoplasma de especies en peligro de extincin del pais. 4. OBJETIVOS 4.1. General Contribuir a la conservacin de cinco especies de cactceas en peligro de extincin existentes en los departamentos de El Progreso y Zacapa.

4.2. Especficos Determinar la influencia de diferentes concentraciones de auxinas y citocininas sobre el desarrollo de callos en las cinco especies de cactceas. Determinar el medio de cultivo ms adecuado para la regeneracin de plntulas a partir de callo en las cinco especies de cactceas. Determinar el medio ms adecuado para la conservacin in vitro a mediano plazo de las cinco especies de cactceas estudiadas.

-2-

5. METODOLOGIA 5.1. Colecta de especies. Se realizaron cuatro viajes de colecta, de tres das cada uno, a los departamentos de El Progreso y Zacapa, sitios reportados con presencia de cactceas en Guatemala por la Flora de Guatemala. Los viajes se realizaron en los meses de marzo, abril y mayo del ao 2004. Para la toma de los datos de altitud, latitud y longitud se utiliz un altmetro y un posicionador geogrfico GPS. 5.2. Tratamiento de plantas vivas. Las plantas se trasladaron al Instituto de Ciencia y Tecnologa Agrcolas ICTA- para su determinacin taxonmica, posteriormente los brotes se sembraron en macetas conteniendo tierra abonada y arena, en proporcin 1:1, previamente esterilizadas con agua hirviendo. Las plantas se colocaron en el invernadero del laboratorio de Biotecnologa del ICTA, donde se trataron dos veces por semana con una solucin 2.5% v/v del funguicida Derosal 50 SC (Metil-2-benzimidazol-carbamato 50%) y con una solucin 0.5 g/L de Agrymicin 16.5 WP (Estreptomicina sulfato 15%, Oxitetraciclina 1.5%, 0.5 g/l) durante dos meses. 5.3. Determinacin taxonmica de plantas colectadas. Para determinar taxonmicamente las especies de cactceas colectadas se utiliz la clave dicotmica de la Flora de Guatemala con el auxilio de estereoscopio y pinzas. 5.4. Desinfeccin de explantes. Se extrajeron las semillas contenidas en los frutos colectados y se desinfectaron de la siguiente manera: inicialmente se lavaron con jabn desinfectante y agua de chorro en movimiento, posteriormente se colocaron en una solucin 0.1 % v/v de Derosal (Metil-2-benzimidazol-carbamato 50%) por 20 minutos, seguidamente se colocaron en alcohol al 70% durante un minuto, por ltimo se desinfectaron en una solucin de hipoclorito de calcio al 10%, durante 30 minutos. Finalmente, se trasladaron a la cmara de flujo laminar donde, luego de tres lavados con agua esterilizada, se procedi a la siembra. 5.5. Siembra de semillas. Las semillas de las diferentes especies se sembraron en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) para su germinacin. Se mantuvieron en el cuarto de crecimiento a 30C, humedad del 80% e iluminacin 1000 lux. 5.6. Desarrollo de callo. Se prepararon los medios T1 y T1 modificado (16,20). En ellos se sembraron porciones de tallo de las siguientes especies Cephalocereus maxonii Rose, Melocactus ruestii Schumann, Myrtillocactus eichlamii Britt y Rose, Nyctocereus guatemalensis Britt y Rose y Stenocereus eichlamii (Quehl) D.R. Hunt. Especies de las que se posean un mayor nmero de plntulas germinadas.

-3-

Cuadro 1. Componentes del medio T1 y T1 modificado. REACTIVO Medio T1 Macroelementos MS/2 Microelementos MS/2 Fe EDTA MS/2 Tiamina 10 mg Myoinositol 100 mg Acido nicotnico 1 mg Piridoxina HCl 1 mg Glicina 1 mg Extracto de malta 400 mg Casena hidrolizada 100 mg AIB 1 mg 2 iP 2 mg 2,4 D 0.5 mg Sacarosa 30 g Phytagel 3g pH 5.6

Modificacin de T1 MS/2 MS/2 MS/2 10 mg 100 mg 1 mg 1 mg 1 mg 400 mg 100 mg -------0.5 mg 1 mg 30 g 3g 5.6

Posteriormente, luego de transcurridos dos meses, se procedi a la propagacin del callo, sembrando porciones de callo en los mismos medios. 5.7. Variables de respuesta. Las variables de respuesta analizadas fueron las siguientes: porcentaje de induccin de callo y peso fresco de callo (medido en gramos). 5.8. Anlisis Estadstico. Para las variables de respuesta porcentaje de induccin de callo y peso fresco de callo se efectu un anlisis de varianza. El diseo experimental utilizado fue completamente al azar, con 10 tratamientos (cinco especies y dos medios de cultivo) y 20 repeticiones por tratamiento. 5.9. Regeneracin de plntulas. Porciones de callo de las especies Myrtillocactus eichlamii Britt y Rose y Stenocereus eichlamii fueron sembradas en medio Murashige y Skoog conteniendo diferentes concentraciones de ANA (0.5, 1, 1.5 y 1.7 mg/l). Otro grupo contena 3 mg/l de 2,4-D, con la finalidad de inducir la regeneracin de plntulas. 5.10. Variables de respuesta. Las variables de respuesta analizadas fueron las siguientes: porcentaje de regeneracin de plantas y nmero de plantas por callo. 5.11. Anlisis estadstico. Para las variables porcentaje de regeneracin de plantas y nmero de plantas por callo no se efectu anlisis de varianza debido a que nicamente uno de los dos tratamientos produjo regeneracin de plantas en la especie Myrtillocactus eichlamii Britt y Rose.

-4-

6. RESULTADOS Y DISCUSION 6.1. Especies Colectadas En el cuadro 2 se listan las diferentes especies colectadas, su distribucin y el porcentaje de germinacin de cada una. Cuadro 2. Especies de cactaceas colectadas, distribucin geogrfica y porcentaje de germinacin
Especie Acanthocereus pentagonus (L.) Britt y Rose Cephalocereus maxonii Rose Hylocereus undatus (Haworth) Britt, Rose y Britton Lemaireocereus eichlamii Britt y Rose Melocactus ruestii Schumann Parte colectada Brotes Frutos, brotes Brotes Brotes Frutos Distribucin Amrica Guate, Hond. Guate, Mex, Salv Guate, Hond, Salv Guate, Hond. Sitio de colecta Km 74 al Atlntico 145200.5, 900400.5 Km 74 al Atlntico 145200.5, 900400.5 Km 150.5 al Atlntico 145529.0, 893139.5 Km 74 al Atlntico 145200.5, 900400.5 145604.5, 895733.9 Km 101 Aldea manzanal 145557.4, 895107.9 Km 93.5 al Atlntico 145517.4, 895623.5 Km 96 al Atlntico 145604.3, 895733.3 Km 169 al Atlntico 150712.3, 892317.4 Km 88 al Atlntico 145535.8, 895907 Km 88 al Atlntico 145535.8, 895907 Km 74 al Atlntico 145200.5, 900400.5 Km 91 al Atlntico 145508.6, 895743.9 Km 85 al Atlntico 145514.7, 900002.6 Germinacin (%)

92

71

Myrtillocactus eichlamii Britt y Rose Nyctocereus guatemalensis Britt y Rose Opuntia decumbens SalmDyck Opuntia eichlamii Rose Pachycereus lepidanthus (Eichlam)Britt y Rose Pereskia autumnalis (Eichlam)Rose Stenocereus eichlamii Britt y Rose

Frutos, brotes Frutos, brotes Frutos, brotes Frutos, brotes Brotes Frutos Frutos, brotes

Endmica

56

Endmica Guate, Mex Endmica Endmica Guate, Salv, Hon, Nic Endmica

83 56 42

58 55

Se colectaron un total de doce especies, de ocho de ellas se colectaron frutos y se tienen plntulas in vitro en el laboratorio. De las otras cuatro se colectaron brotes los cuales se mantienen en el invernadero. Cinco especies colectadas son endmicas de Guatemala. 6.2. Formacin de Callo 6.2.1. Porcentaje de induccin de callo El anlisis de varianza para la variable de respuesta porcentaje de induccin de callo detect diferencias significativas para las fuentes de variacin genotipo y medio de

-5-

cultivo (cuadro 3). Se observa que en cuanto al genotipo las especies Myrtillocactus eichlamii y Nyctocereus guatemalensis produjeron un mayor porcentaje de callo respecto de las otras tres especies (cuadro 4). El medio de cultivo T1 modificado produjo una mayor formacin de callo (70%) respecto al medio T1 (52%), como se puede apreciar en el cuadro 5. Cuadro 3. Anlisis de varianza para el porcentaje de induccin de callo porciones de tallo en cinco especies de cactaceas. Grados de Suma de Valor Fuente de variacin libertad cuadrados de Fc Genotipo 4 15876.3513 11.09 Medio de Cultivo 1 2372.8395 6.63 Interaccin Genotipo por 4 1809.6846 1.26 Medio de Cultivo Error 15 5366.6666 Total 24 25984.0000
Coeficiente de variacin = 31.11%

a partir de Pr > Fc 0.0002 ** 0.0211 * 0.3270 NS

Cuadro 4. Efecto del genotipo sobre el porcentaje de induccin de callo. Agrupamiento Duncan al 5% Media Genotipo A 98.33 Myrtillocactus eichlamii A 82.50 Nyctocereus guatemalensis B 46.67 Cephalocereus maxonii B 36.67 Melocactus ruestii B 33.33 Stenocereus eichlamii

Cuadro 5. Efecto del medio de cultivo sobre el porcentaje de induccin de callo. Agrupamiento Duncan al 5% Media Medio de Cultivo A 70.00 T1 modificado B 52.31 T1

6.2.2. Peso fresco de callo El anlisis de varianza para la variable de respuesta peso fresco de callo (cuadro 6) detect diferencias altamente significativas para la fuente de variacin genotipo y tambin para la interaccin genotipo por medio de cultivo. El anlisis de la interaccin genotipo por medio de cultivo nos indica que todas las especies, con excepcin de Myrtillocactus eichlamii, produjeron igual peso fresco de callo en los dos medios de cultivo (T1 y T1 modificado). La especie Myrtillocactus eichlamii produjo un mayor peso fresco de callo en el medio de cultivo T1 que en el medio de cultivo T1 modificado (figura 1).

-6-

Cuadro 6. Anlisis de varianza para la variable de respuesta peso fresco de callo, en gramos por explante, en cinco especies de cactaceas. Grados de Suma de Valor de Fuente de variacin Pr > Fc libertad cuadrados Fc Genotipo 4 8.7094 39.29 0.0001 ** 0.1335 Medio de Cultivo 1 0.1262 2.28 NS Interaccin Genotipo por Medio de 4 0.8788 3.96 0.0045 ** Cultivo Error 134 7.4258 Total 143 18.5807
Coeficiente de variacin = 48.52%.

1 0.9 0.8 P 0.7 e 0.6 s 0.5 o 0.4 0.3 (g)0.2 0.1 0 Melo Myrt Nycto Cephal Steno

T1 T1 modif

Genotipo
Figura 1. Interaccin genotipo por medio de cultivo para la variable de respuesta peso fresco de callo, en gramos por explante.

6.3. Regeneracin de Plantas De las dos especies de las cuales se sembraron callos, en cinco medios de cultivo para inducir la regeneracin de plntulas, nicamente la especie Myrtillocactus eichlamii produjo una respuesta positiva. El callo proveniente del medio de cultivo T1 fue el nico que regener plntulas, razn por la que no se realiz un anlisis de varianza, nicamente se reportan porcentajes de regeneracin de plantas y nmero de plantas por callo. Se observ que el medio MS (Murashige y Skoog, 1962), suplementado con 0.5 1 mg/L de cido naftalenactico (ANA), fueron los medios que propiciaron los mayores porcentajes de regeneracin de plantas (20%). El medio MS, suplementado con 1 mg/L de ANA, fue el que indujo el desarrollo de un mayor nmero de plantas por callo (1.75), como se puede apreciar en el cuadro 7.

-7-

Cuadro 7. Regeneracin de plantas, en medio MS, a partir de porciones de callo provenientes del medio de cultivo T1, para la especie Myrtillocactus eichlamii. 2,4-D ANA ANA ANA ANA Variable (3.0 mg/L) (0.5 mg/L) (0.7 mg/L) (1.0 mg/L) (1.5 mg/L) PRP 10 20 15 20 10 NPC 1.0 1.0 1.0 1.75 1.5
PRP = Porcentaje de regeneracin de plantas NPC = Nmero de plantas por callo

7. CONCLUSIONES Se colectaron un total de 12 especies de cactaceas; cinco de ellas endmicas de Guatemala. El medio de cultivo T1 modificado mostr mayor respuesta en cuanto a porcentaje de explantes que produjeron callo en las cinco especies. Todas las especies, con excepcin de Myrtillocactus eichlamii, produjeron igual peso fresco de callo en los dos medios de cultivo (T1 y T1 modificado). La especie Myrtillocactus eichlamii produjo un mayor peso fresco de callo en el medio de cultivo T1 que en el medio de cultivo T1 modificado. El medio MS (Murashige y Skoog, 1962), suplementado con 0.5 1 mg/L de cido naftalenactico (ANA), fueron los medios que propiciaron los mayores porcentajes de regeneracin de plantas (20%). El medio MS, suplementado con 1 mg/L de ANA, fue el que indujo el desarrollo de un mayor nmero de plantas por callo (1.75). La regeneracin de plntulas se obtuvo nicamente cuando los callos se produjeron en el medio de cultivo T1.

8. RECOMENDACIONES Se recomienda utilizar el medio de cultivo T1 modificado para la induccin de callo en las especies Cephalocereus maxonii Rose, Melocactus ruestii Schumann, Myrtillocactus eichlamii Britt y Rose, Nyctocereus guatemalensis Britt y Rose y Stenocereus eichlamii (Quehl) D.R. Hunt. Para regenerar plntulas, a partir de porciones de callo, en la especie Myrtillocactus eichlamii Britt y Rose, se recomienda el medio MS conteniendo 1 mg/L de ANA.

-8-

9. BIBLIOGRAFIA 1. Abdelnour-Esquivel, A.; Escalant, J.V.. 1994. Conceptos bsicos del cultivo de tejidos vegetales. CATIE, Turrialba, Costa Rica. 36 pp. 2. Amador, D. 1999. Manual de Prcticas de Laboratorio: Curso de Tcnicas de Cultivo de Tejidos Vegetales. Maestra en Biotecnologa de Plantas. Facultad de Agronoma. 3. Azurdia, C. 1997. Coleccin Nuclear, una alternativa para el manejo de colecciones de germoplasma: caso del zapote en Guatemala. En: Ciencia y Tecnologa, Enero/Junio, No. 1, USAC. 4. Castillo, L.M. 1992. Proyecto de Biotecnologa. ICTA Guatemala. Trifoliar. 5. Consejo Nacional de Areas Protegidas CONAP-. 2002. Lista Roja de Especies de Flora. Diario de Centroamrica Nmero 27, 9 de enero. Pg. 5-12. 6. Davis, S. 1986. Plants in Danger. What do we know? International Union of Conservation of Nature and Natural Resources, Switzerland. 7. George, E.F.; Puttock, D.J.M.; George, H.J. 1987. Plant Culture Media. Vol. 1. Formulations and Uses. Exegetics Limited. Inglaterra. 8. International Plant Genetic Resources Institute IPGRI-. 1997. conservation technologies and strategies. Annual Report. pp 53. Ex situ

9. Jones, S. B. 1987. Sistemtica Vegetal. 2da. Ed. McGraw-Hill, Inc. Mxico. 511 pp. 10. Montoya, L.M. 1991. Cultivo de Tejidos Vegetales. Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Departamento de Agronoma. 77 pp. 11. Ordoez, A. 2002. Evaluacin de diferentes niveles y combinaciones de los reguladores de crecimiento bencilaminopurina (BAP) y cido naftalenactico (ANA) en la propagacin in vitro de Mammillaria woburnensis Scheer, Lond. Tesis licenciatura, Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia, Universidad de San Carlos de Guatemala. Guatemala. 12. Orozco, C. 1996. Cultivo de tejidos; su aplicacin en agricultura. En: Memoria I Simposio nacional sobre cultivo de tejidos vegetales. ICTA. 129 p. 13. Oxford University Press. 1993. Flowering Plants of the World. USA. 325 pp.

-9-

14. CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical). 1991. Cultivo de tejidos en la agricultura: Fundamentos y aplicaciones. Roca, W.M. y Mroginski, L.A. (eds.). Cali, Colombia, p xii, 970. 15. SIGMA. 2001. Biochemicals and Reagents for Life Sciencie Research. USA. 2848 pg. 16. Sondahl, M.R.; Nakamura, T. ; Medina-Filho, H.P.; Carvalho, A.; Fazuoli, L.C.; Costa, W.M. 1987. Coffe. En: Handbook of Plant Cell Culture; V.3. Cap. 21. Macmillan Publishing Company. p. 564-590. 17. Soto, G.J. 1992. Objetivos y Planes Generales del Proyecto de Biotecnologa. ICTA. 10 p. 18. Standley, P.; Steyermark, J. 1958. Flora of Guatemala. Fieldiana Botany. 13 volmenes. 19. Suchini, A.E. ; Coronado, L.E.; Rosales, A.C.; Cazali, G.M.; Lou, S.; De Poll, E.; Vliz, M.E.; Marroqun, A.E.; Castillo, N.A.; Ordez, N. 2000. Evaluacin y Conocimiento del Patrimonio Florstico del pas. DIGI (Direccin General de Investigacin), Universidad de San Carlos de Guatemala. Guatemala. 92 p. 20. Suchini, A.E. 2002. Respuesta de una especie endmica de Guatemala (Hoffmania sessilifolia L.) a la micropropagacion. Tesis de graduacin Maestra Biotecnologa de Plantas. Fac. de Agronoma, USAC. 21. Usui, K.; Okabe, K.; Vctores, R.; Ramrez, A.E. 1996. Principios Bsicos del Cultivo de Tejidos Vegetales. ICTA-JICA-Voluntarios japoneses en Cooperacin Tcnica con el Extranjero. 166 p.

- 10 -