FUNDAO UNIVERSIDADE FEDERAL TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITRIO DE GURUPI CULTIVO DE CLULAS ANIMAIS

PRATICA: PURIFICAO DE CLULAS PERIFRICAS MONONUCLEARES DO SANGUE

Professor: Kelvinson Acadmica: Sandy Emilly Lima Nascimento - 2010111086

Gurupi - To Setembro de 2013

1. INTRODUO Fisiologicamente o sangue, atravs das mais diversas funes, faz com que a vida continue. A circulao distribui as substncias nutritivas e o oxignio a todas as clulas do organismo transportando aos rgos excretores, tais como rins e pulmes, os resduos dos processos metablicos que recebe dos tecidos. Um organismo adulto contm em mdia 5 litros de sangue que circulam constantemente (CHANDLER, 2013). O sangue composto basicamente de gua (aproximadamente 90%), e dividido em plasma (60%) e clulas. O plasma o componente lquido do sangue, e contm (alm de gua) protenas, nutrientes, hormonas, sais e resduos do metabolismo. Tem cor amarela, devido presena de bilirrubina (proveniente da degradao dos hemos). As protenas plasmticas so sintetizadas pelo fgado, e desempenham uma grande variedade de papis: transporte de molculas importantes, manuteno da presso osmtica e coagulao (SILVA, 2002). O sistema imune compreende uma complexa rede de clulas importantes na manuteno da homeostasia. Estas clulas, tais como leuccitos polimorfonucleares (neutrfilos, eosinfilos e basfilos), moncitos, dentre outras, so ativadas quando microrganismos patognicos conseguem romper as barreiras naturais de proteo. Funcionalmente, estas clulas formam a primeira linha de defesa do hospedeiro contra microrganismos invasores. Complementando a frente de resistncia a patgenos esto os linfcitos que permitem ao sistema imune responder a um vasto nmero de antgenos introduzidos em qualquer parte do organismo (CRUZ, 2010). Uma simples gota de sangue contm 250 milhes de clulas produzidas pelo organismo. A colorao do sangue para estudos microscpicos se baseia na mistura de corantes. Com essa colorao, as clulas do sangue podero exercer quatro comportamentos: basofilia, corando-se pelo azul-de-metileno e tornando-se azulada; acidofilia, corando-se pela eosina e tornando-se rosa-amareladas; azurofilia, corandose pelos azures e tornando-se prpura e neutrofilia, corando-se por uma mistura complexa e tornando-se salmo (CHANDLER, 2013). A colorao compreende trs etapas: Fixao, onde a preparao a ser corada dever ser previamente fixada. O fixador rotineiro mais usado em hematologia o metanol, que deve ser aplicado sobre a lmina por 01 a 03 minutos. O corante, preparado em soluo alcolica, quando aplicado sobre a lmina (nesse perodo de tempo) realiza esta etapa; a colorao obtm-se adicionando-se gua de colorao

(gua tamponada, pH=7,0 ou gua destilada, recentemente fervida) sobre o corante, onde ionizam-se os sais contidos na soluo; e a lavagem, que feita aps a colorao, onde as lminas so lavadas com gua e em seguida secas ao ar (DASY, 2013). 2. OBJETIVO Purificar e analisar microscopicamente as clulas mononucleares perifricas do sangue. 3. MATERIAIS E MTODOS

Coletou-se 20 ml de sangue com uma seringa previamente lubrificada com heparina anticoagulante. Homogeneizou-se o sangue na seringa para tambm para evitar coagulao, e em seguida transferiu-se o sangue para um tubo falcon, derramando o mesmo pela parede do tubo. Em 5 outros tubos, um para cada aluno, adicionou-se 4,5 ml de Ficol 1119, e em seguida mais 4,5 ml de Ficol 1.077, lentamente, purificao. Acrescentou-se 10 ml de PBS (soluo tampo fosfato-salino, que contm cloreto de sdio e fosfato de sdio) no tubo que continha o sangue, para que o mesmo fosse suficiente para todos os alunos, e em seguida homogeneizou-se mais uma vez. Adicionou-se 6 ml dessa mistura de sangue com PBS em cada um dos tubos que continham Ficol, onde o primeiro ml adicionado exigiu cuidados para que formasse um anel no tubo, e o restante (5 ml) foi adicionado normalmente. Em seguida os tubos foram levados para uma centrifuga, para que houvesse a separao das clulas. Aps 30 minutos, retirou-se os tubos da centrfuga, onde ficou perceptvel a separao, e retirou-se, com auxlio da pipeta, as clulas mononucleares, formando um total de 5 ml de clulas. Colocou-se os 5 ml de clulas retiradas em outro tudo falcon, e completou-se o contedo com 15 ml de PBS, em seguida, levou-se os tubos novamente para a centrfuga e, aps 10 minutos, retirou-se os tubos e descartou-se a parte lquida, ficando apenas o precipitado que continha as clulas de interesse. Retirou-se com a pipeta uma pequena quantidade da soluo contendo as clulas, colocou-se em uma lmina circular e esperou-se secar. Depois de secas, foi feita a coragem das clulas utilizando os corantes Metanol, para fixao das clulas, Hematoxilina e leucina para a evitando a mistura dos dois, pois pode prejudicar a eficincia da

coragem das organelas, ncleos e membranas, mergulhando a lmina 5 vezes em cada corante. Aps a coragem, mergulhou-se a lmina em gua, e por fim colocou-se para secar novamente. Depois de seca, ps-se uma gota de hidromalte em uma outra lmina quadrada, maior e retangular, e colocou-se a lmina circular com as clulas coradas sobre a gota de hidromalte desta outra lmina para que houvesse a colagem, com o lado que continha as clulas virado para baixo em contato com o hidromalte. Esperou-se secar novamente, e em seguida foi feita a observao no microscpio, para identificao das clulas purificadas.

4. RESULTADOS E DISCUSSO

Aps a adio de sangue no tubo que continha o ficol, observou-se o incio de uma separao entre o sangue e o polissacardeo, como mostra a figura 1. Isso acontece porque o ficol utilizado consiste de uma mistura de polissacardeos neutros hidroflicos de alta densidade que se dissolve prontamente em soluo aquosa, e muito utilizado em laboratrios clnicos para separar os componentes celulares do sangue perifrico (eritrcitos, leuccitos, etc.).

Figura 1: Sangue adicionado ao ficol.

Depois da primeira passagem pela centrfuga, a separao das clulas foi ainda mais notvel graas ao ficol, um polissacardeo que agrega eritrcitos tornandoos mais densos, conforme mostra a figura 2, onde as duas fases tornam-se bem visveis e a separao ocorreu da seguinte maneira: na fase superior fica o plasma e seus constituintes solveis, na interface as clulas mononucleares, em seguida o Ficoll e aps os eritrcitos e granulcitos que ficam sob a forma de um sedimento celular no fundo do tubo.

Figura 2: Separao em gradiente de densidade.

Aps todas as etapas de purificao, foi feita a anlise da lmina (Figura 2) no microscpico, e a partir das imagens, foi observado a presena de dois tipos de clulas sanguneas: as mononucleares, como moncitos e linfcitos, presentes em maior quantidade, e as polinucleares, como basfilos e neutrfilos, sendo estas ltimas em menor quantidade (Figuras 3, 4 e 5).

Figura 2: Lmina contendo as clulas coradas.

Anlise microscpica das clulas presentes na lmina. Figura 3. Figura 4.

Figura 5.

5. CONCLUSO A purificao e colorao do sangue a partir de corantes para estudos microscpicos um mtodo eficiente e muito utilizado clinicamente para diagnsticos de possveis problemas de sade, e para outros fins. Na prtica, as clulas foram devidamente purificadas, e assim foi possvel observar alm das clulas mononucleadas de interesse, como moncitos e linfcitos, as polinucleares, como basfilos e neutrfilos. O que mostra que as tcnicas utilizadas e os resultados obtidos foram satisfatrios.

6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS CHANDLER, J. Principais clulas do sangue e suas funes. Disponvel em: < http://www.drjeffchandler.com/2011/11/principais-celulas-do-sangue-e-suas.html> Acessado em: 15 de Setembro de 2013, s 18:40 horas. CRUZ, W.A. da S. Atividade de mieloperoxidade e produo de oxignio singlete em neutrfilos e clulas monocticas. Dissertao de mestrado, USP Programa de psgraduao em farmcia, rea de anlises clnicas. So Paulo, 2010. DASY, D. Tcnica para colorao de lminas de sangue: Esfregao sanguneo corado com wrigh. SILVA, P. Sangue e clulas sanguneas. 2002. Disponvel em: <http://www2.ufp.pt/~pedros/qfisio/sangue.htm> Acessado em: 15 de Setembro de 2013, s 19:30 horas.