LABORATORIO 1

CINETICA DE FERMENTACIONES EN CULTIVO POR LOTE DISCONTINUO- BATCH I. RESULTADOS Y DISCUSIN

CUADRO1: DATOS OBTENIDOS DE APLICAR LAS ECUACIONES DE CURVAS ESTANDAR EN BIOMASA, SUSTRATO Y PRODUCTO PARA LA S. CEREVISIAE
Biomasa Tiempo (h) 0 1 2 3 5 6 7 8 10 24 X(g/L) 0.11 0.14 0.20 0.26 0.58 0.62 0.85 1.16 1.16 1.19 Glucosa S(g/L) 5.30 5.32 5.25 5.04 3.89 3.19 1.78 0.35 0.32 0.31 Act enzimatica P(g/L) 0.000 0.000 0.000 0.000 0.028 0.030 0.033 0.034 0.043 0.043

FIGURA 1: CURVA DE BIOMASA, SUSTRATO Y PRODUCTO PARA LA S. CEREVISIAE

Curva Biomasa, Sustrato y Producto para la S. cerevisiae

6.00 5.00 Concentracion (g/L) 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00 -1.00 0 10 Tiempo (h) 20 30 Biomasa Sustrato Act enzimatica

Segn (held,2010) , el crecimiento exponencial de la levadura se da entre las 3 y 8 horas anexo (figura 4.1) por lo que se comprob en la practica, ya que se obtuvo el mismo tiempo de la fase exponencial como se ve en la figura 1 y cuadro 1. El precultivo se hizo en estufa a 28c sin agitacin por lo que pudo ser un motivo para que lafase lag se prolongue, sin embargo el crecimiento se dio normal a pesar de utilizar una cepa liofilizada como se muestra en la figura 1. Una vez sembrado la turbidez aumento, con lo que se verificara el aumento de biomasa en el matraz y se verifica en los datos obtenidos turbidimetra del cuadro 1. Para todas las temperaturas estudiadas, la actividad especfica mxima observada para la invertasa libre con 5% de sacarosa se produce alrededor de ph 5, y la temperatura ptima fue de 55 c (bergamasco, r. 2000), de acuerdo a esto, se trabajo a medios a ph de 4.5 tratando de usar su act maxima, sin embargo la temperatura usada fue de 28c pudiendo mermar su actividad y productividad. Para la determinacion de actividad de la invertasa , se le considero cero al inicio debido a que primero se leera el azucar del medio, por lo que se corrigio usando cultivo + buffer incativado como blanco para no tener error en la lectura. Para elcuadro 1 se hizo un pequeo ajuste en la hora 10 debido a que no puede dsminuir la produccion de biomasa, por lo que se le considero igual a laconcentracion anterior.

CUADRO1.2: DATOS OBTENIDOS DE APLICAR LAS ECUACIONES DE CURVAS ESTANDAR EN BIOMASA, SUSTRATO Y PRODUCTO PARA EL L. PLANTARUM

Biomasa Tiempo (h) 0 1 2 3 5 6 7 8 10 24 X(g/L) 0.65 1.15 1.84 2.64 6.36 9.27 11.59 13.13 14.03 15.02

Glucosa S(g/L) 24.31 24.31 24.31 24.31 24.28 18.16 14.13 13.48 8.02 4.80

Ac. Lctico (g/L) 0.41 0.45 0.54 0.63 0.99 1.30 1.44 1.53 1.62 1.98

FIGURA 1.2: CURVA DE BIOMASA, SUSTRATO Y PRODUCTO PARA EL L. PLANTARUM

Curva Biomasa, Sustrato y Producto para el L. Plantarum

30.00 Concentracion (g/L) 25.00 20.00 15.00 10.00 5.00 0.00 0 5 10 15 Tiempo (h) 20 25 30 Biomasa Sustrato ac lactico

Para el cuadro 1.2 se realizo un ajuste para los tiempos 0 y 1 en la concentracion de sustrato debido a que esta no puede aumentar, por lo que se concidero la misma de el tiempo 3. Smetankov, (2012), el Lactobacillus plantarum al ser termfilo presenta su desarrollo maximo a temperaturas de 45C aprox. En la prctica se debi llevar a 37C segn lo indicado pero por fallas elctricas se inicio a temperatura ambiente con lo que segn el anexo (figura 4.3) afecta de manera significativa en la produccin de biomasa y con ello pudo no llegas a su mxima productividad. Segn en anexo (figura 4.3) el crecimiento exponencial de este microorganismo se desde las 3 horas hasta las 6 o 7 horas aprox, lo que se comprob enla prctica ya que se obtuvo un creciminto exponencial desde las 3 hasta las 6 horas. El medio MRS es selectivo para baterias cido lcticas debido a que tiene compuestos como monoleato de sorbitn, magnesio, manganeso y acetato, aportan cofactores y pueden inhibir el desarrollo de algunos microorganismos. El citrato de amonio acta como agente inhibitorio del crecimiento de bacterias Gram negativas. Como en el caso anterior al momento de comparar los matrazes se vio la turbidez que se iba generando a travez del tiempo, por lo que al analizarlo por turbidimetria se comprueba el crecimiento de la biomasa.

FIGURA 1.3: TASA DE CRECIMIENTO PARA LA S. CEREVISIAE EN LA FASE EXPONENCIAL

Tasa de Crecimiento para la S. cerevisiae fase logartmica(um)

0.5 0 LN (X) 0 -0.5 -1 -1.5 2 4 6 8 y = 0.2855x - 2.1285 R = 0.9734 10

Tiempo (h)

FIGURA 1.4: TASA DE CRECIMIENTO PARA EL L. PLANTARUM EN LA FASE EXPONENCIAL

Tasa de Crecimiento para el L. Plantarum fase logartmica (um)

2.50 LN (X) 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 0 1 2 3 4 5 6 7 Tiempo (h) y = 0.4219x - 0.2863 R = 0.9987

CUADRO 1.3: VELOCIDAD DE CRECIMIENTO, TIEMPO DE GENERACIN Y PRODUCTIVIDAD HALLADAS DE LAS GRFICAS S. cerevisiae umax (h-1) Tiempo de generacion G (h) Productividad P (g/Lh) 0.286 2.428 0.146 L. Plantarum 0.422 1.643 1.546

De acuerdo a las figuras 1.3 y 1.4 se pudo determinar la tasa de crecimiento de ambos microorganismos, utilizando las pendientes de dichas grficas por lo que resultaron para el caso de S. cerevisiae 0.286h-1, con un tiempo de generacion de 2.4 h comparando con Schuurmans (2008) que encontro 0.35 h-1 con un tiempo de generacion de 2 horas, esta diferencia se puede deber a que se trabajaron con otras temperaturas asi como tambien a que se realizo la experiencia con una cepa liofilizada que por ser una cepa relativamente vieja puede tener una tasa de crecimiento menor. Smetankov, (2012), a 37C en condiciones aerobias el lactobacillus plantarum presenta una velocidad de crecimiento de 0.4 h-1 con un tiempo de generacin de 1.7 horas, muy similar a la que se obtuvo en la prctica que fue de 0.422 h-1 con un tiempo de generacin de 1.6 horas, por lo que sepuede decir que la falla de electricidad influyo en la fase de latencia mas no en la fase exponencial. Segn los autores anteriores se puede demostrar que la tasa de crecimiento de las bacterias es mucho mayor que las levaduras como se comprara en el cuadro 1.3, por lo que si se requiriera hacer algun tipo de estudio se escogerian bacterias ya que ademas de crecer ms rpido tienen una productividad mucho mayor que las levaduras en este caso se ve que es de 1.5 del lactobacillus vs 0.15 de la S. cerevisiae.

CUADRO 1.4 : VELOCIDADES DE CONSUMO DE SUSTRATO (rs), PRODUCCIN DE METABOLITO (rp) Y BIOMASA (rx) , VELOCIDADES ESPECFICAS (, ); PARA LA S. CEREVISIAE

Biomasa Tiempo (h) 0 1 2 3 5 6 7 8 10 24 X(g/L) 0.11 0.14 0.20 0.26 0.58 0.62 0.85 1.16 1.16 1.19

Glucosa S(g/L) 5.304 5.319 5.248 5.037 3.895 3.190 1.780 0.350 0.317 0.308

Act enzimatica P(g/L) 0.000 0.000 0.000 0.000 0.028 0.030 0.033 0.034 0.043 0.043

rx

rs

rp (U/Lh) 0.000 0.000 0.000 0.014 0.002 0.003 0.001 0.005 0.000

(g/Lh) (g/Lh) -

0.225 0.298 0.223 0.273 0.068 0.270 0.268 0.000 0.001

0.000 0.000 0.000 0.024 0.003 0.003 0.001 0.004 0.000

0.032 -0.014 0.061 0.059 0.159 0.042 0.230 0.312 0.000 0.002 0.070 0.211 0.571 0.705 1.410 1.430 0.017 0.001

Al ver las velocidades de consumo de sustrato, produccin de metabolito y biomasa del cuadro 1.4 ; se puede ver el comportamiento de la levadura, en que momento empieza a actuar la invertasa que es a partir de las 5 horas, se identifica la fase log a partir de las 3 horas hasta las 8 horas; como las velocidades es una comparacion en 2 tiempos, no se tienen datos de velocidades para el tiempo 0.

CUADRO 1.5 : VELOCIDADES DE CONSUMO DE SUSTRATO (rs), PRODUCCIN DE METABOLITO (rp) Y BIOMASA (rx) , VELOCIDADES ESPECFICAS (, ); PARA EL L. PLANTARUM

Biomasa Tiempo (h) 0 1 2 3 5 6 7 8 10 24 X(g/L) 0.65 1.15 1.84 2.64 6.36 9.27 11.59 13.13 14.03 15.02

Glucosa S(g/L) 24.311 24.311 24.311 24.311 24.282 18.165 14.133 13.485 8.015 4.797

Ac. Lctico P(g/L) 0.405 0.450 0.540 0.630 0.990 1.300 1.440 1.530 1.620 1.980

rx (g/Lh) 0.507 0.690 0.795 1.859 2.916 2.316 1.535 0.452 0.070

rs (g/Lh) 0.000 0.000 0.000 0.014 6.118 4.032 0.648 2.735 0.230

rp (g/Lh) 0.045 0.090 0.090 0.180 0.310 0.140 0.090 0.045 0.026

0.439 0.374 0.301 0.292 0.314 0.200 0.117 0.032 0.005

0.039 0.049 0.034 0.028 0.033 0.012 0.007 0.003 0.002

Pasa algo similar en el cuadro 1.5; se puede apreciar el comportamiento, pero en este caso de la bacteria, que presenta su fase log de 3 a 6 horas, el consumo de sustrato comienza a partir de las 5 horas, se produce cido lactico en todo el proceso pero cada que pasa una hora seproduce con menor cantidad.

II.

CONCLUSIONES

Se determinaron las curvas de crecimiento microbiano, consumo de sustrato y formacion de producto en un sistema de fermentacion de cultivo por lotes discontinuoo para Saccharomyces cerevisiae y Lactobacillus plantarum.

Se determinaron parametros cineticos que rigen la fermentacion de cultivo por lotes discontinuo, como es la velocidad de crecimiento microbiano y tiempo de generacion.

La velocidad de crecimiento asi como el tiempo de generacion y productividad de las cepas dependen de varios factores, como son temperatura, ph, sustrato.

III.

BIBLIOGRAFIA

Bergamasco, R. 2000. CHARACTERIZATION OF FREE AND IMMOBILIZED INVERTASE REGARDING ACTIVITY AND ENERGY OF ACTIVATION. Chemical engineering department, state university of maringa. Brazil. Consultado el 27 de mayo del 2013. Disponible en http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0104-

66322000000400051&script=sci_arttext#fig1

Held, Paul. 2010. Monitoring Growth of Beer Brewing Strains of Saccharomyces Cerevisiae. BioTek Instruments. USA. Consultado el 27 de mayo del en linea en

2013.disponible

http://www.biotek.com/assets/tech_resources/SynergyH1_Yeast_Growth_App_N ote.pdf. Schuurmans, J .2008. The effect of altered expression of transcriptional regulators of catabolism on the transcription profile and physiology of Saccharomyces cerevisiae. Chapter 5: Control of specific growth rate in Saccharomyces cerevisiae. Faculty of Science. University of Amsterdam. Consultado el 27 de mayo del 2013. Disponible en http://dare.uva.nl/document/117548. Smetankov, J. 2012. Influence of aerobic and anaerobic conditions on the growth and metabolism of selected strains of Lactobacillus plantarum. Department of Food Technology, Institute of Biotechnology and Food Science, Faculty of Chemical and Food Technology, Slovak University of Technology, Slovak. Consultado el 27 de mayo del 2013. Disponible en : http://www.acs.chtf.stuba.sk/papers/acs_0131.pdf WEEKS, 2008. Microbial Growth. MICROBES AND SOCIETY. SECOND EDITION. MCGRAWHILL. CANADA. CONSULTADO EN LINEA EL 27 DE MAYO DEL 2013. DISPONIBLE EN http://highered.mcgraw-

hill.com/sites/dl/free/0073375233/558786/wiL75233_ch07_126_152.pdf

IV.

ANEXOS

FIGURA 4.1 :CURVA DE CRECIMIENTO DE LA LEVADURA TPICA. SACCHAROMYCES CEREVISIAE CULTIVADO EN MEDIOS YPD A 30 C DURANTE 12 HORAS CON LAS MEDICIONES DE DATOS CADA 2 MINUTOS.

(Held, Paul, 2010)

CUADRO 4.1 : TIEMPO DE GENERACION A TEMPERATURAS ESPECIFICAS.

(WEEKS, 2008)

FIGURA 4.2 : EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LA TASA DE CRECIMIENTO Y DEL TIPO DE MICROORGANISMOS

(WEEKS, 2008)

(WEEKS, 2008)

FIGURA 4.3: CURVAS DE CRECIMIENTO DEL Lactobacillus plantarum CULTIVADO BAJO CONDICIONES AEROBIAS A DIFERENTES TEMPERATURAS(30, 37 Y 45C)

(Smetankov, J. 2012)

FIGURA 4.4: TASA DE CRECIMIENTO ESPECIFICO DEL LACTOBACILLUS DURANTE LAS 48 HORAS DE CULTIVO.

(Smetankov, J. 2012)