Produccin de exoenzimas microbiales en la comida

I. Introduccin
Las enzimas son responsables de la catlisis de casi todas las reacciones bioqumicas. Por siglos, el hombre ha usado bacterias naturales, levaduras y moldes y las enzimas que producen para hacer pan, queso, vino, y dems. Antes de 1950, muy poca informacin estaba disponible acerca de enzimas microbiales. Estudios intensivos empezaron con el aislamiento de proteasas a partir de Aspergillus oryzae y Bacillus subtilis. Hoy en da, una abrumadora cantidad de datos de investigacin est disponible y atributos convenientes de enzimas, la mayora aislados de microorganismos, tienen valor comercial. Se usan aproximadamente 200 enzimas microbiales para un amplio rango de aplicaciones ya sea en la industria alimenticia para mejorar la textura, valores nutricionales, y para generar sabores tpicos y aromas, o son usadas en la industria productora de detergente (Tabla 1). Sin embargo, deterioraciones sustanciales no deseables en alimentos de origen animal, tambin son atribudas a los efectos de proteasas microbiales extracelulares y lipasas. Enzimas endgenas, por otro lado, no causarn cambios severos y son de menor importancia para deterioraciones de alimentos. Ejemplos de cambios no deseables organolpticos causados por proteasas (P) microbiales o lipasas (L) en diferentes tipos de comida de origen animal estn listados en la pgina 61. Se pierde aproximadamente un tercio de la produccin mundial de alimentos como resultado de descomposiciones microbiales y presenta un problema econmicamente significante para los fabricantes, vendedores y consumidores. Se puede definir a la descomposicin como cualquier cambio que vuelve a un producto alimenticio inaceptable para el consumo humano. Para predecir el inicio de descomposicin o para calcular la caducidad del alimento, la cuenta total viable (TVC) o incluso la cuenta de organismos psicrotolerantes puede ser de un valor limitado como indicio de actividad enzimtica. Ninguno de ambos parmetros da alguna clase de informacin en las actividades metablicas de los microorganismos. Alimento procesado recientemente puede contener una variedad de microorganismos y dependiendo de las condiciones ambientales en dicho alimento, slo una pequea parte de los microorganismos es realmente de importancia para descomposicin de productos. En el contexto de descomposicin de pescado, el trmino de organismos especficos de descomposicin (SSO) fue creado por Dalgaard (1995), significa que la flora crece ms rpido que la microflora restante de comida de mar, y eventualmente produce las metabolitas responsables por sabores fuera de lugar y rechazo sensorial del producto durante el almacenaje en condiciones particulares de temperatura, atmsferas, porcentaje de sal, aw, conservadores, y dems. Sin embargo, de acuerdo con Gram (2002), tambin el nmero de SSO presente no predice confiablemente la calidad sensorial de un alimento, por ejemplo Braun y Sutherland (2003) detectaron actividad proteoltica y sntesis de lipasas en temperaturas de 2-6 C cuando las pseudomonadas alcanzaron nmeros de tan slo 104-105 cfu ml-1. En

contraste, Ellis (2002) not una correlacin entre la descomposicin de carne de pollo a 20 C y un TVC de 107 cfu cm-2. An signos sensoriales de descomposicin a veces se correlacionan pobremente con TVC. Dainty observ protelisis nicamente cuando los nmeros de 109 cfu g-1 fueron alcanzados. Como lo cita Fairbairn, una cuenta psicotrfica de al menos 5 x 106 cfu ml-1 es necesaria antes que la protelisis y 107 cfu ml-1 antes que los cambios organolpticos sean detectables. En los siguientes captulos, aspectos generales como la estructura, funcin y clasificacin de enzimas, sern descritos antes de propios estudios en la sntesis y actividad de lipasas microbiales y protasas bajo la influencia de parmentros distintos, sern discutidos con ms detalle.

II. Estructura y funcin de Exoenzimas

Las enzimas son, en su mayora, protenas globulares de tamao variante, que a veces contienen cofactores o coenzimas para funcionar correctamente. stas pueden ser inorgnicas (iones metlicos como el Fe2+, Mg2+, Cu2+, y clusters hierro-sulfurizados) o hemo, biotina, FAD, NAD, o coenzimas como molculas orgnicas (grupos protticos). Las largas cadenas de amino cidos de las enzimas son unidas por enlaces pptidos, ciclados (looped) y doblados (folded) hacia estructuras secundarias y terciarias o cuaternarias por enlaces disulfidos, interacciones hidrofbicas, y puentes de sal para activar su propiedad funcional como la eficiencia y la especificidad. Las enzimas son especficas en las reacciones que catalizan y los sustratos que estn involucrados en estas reacciones debido a su tamao, carga complementaria, hidroflica, o de carcter hidrofobio de la enzima y el sustrato. En una reaccin enzimo-catalizada, el sustrato ajusta perfectamente al llamado sitio activo (usualmente pensado como un espacio pequeo en la molcula) de la enzima. Esto generalmente es referido como el modelo de el candado y la llave para formar un complejo enzimo-sustrato (ES) de vida corta. Entonces el sustrae es convertido en un producto mientras est adherido a la enzima, y finalmente el producto es liberado. Este mecanismo se puede mostrar como: k1 k3 S + E ESP + E k2 S = Sustrato, E = Enzima, P = Producto, k1,k2,k3 = constantes de proporcin. Ya que la enzima no es consumida o cambiada por la reaccin qumica, puede ser usada una y otra ves para catalizar molculas adicionales de sustrato. En 1913, Michaelis y Menten propusieron una teora cuantitativa de cinticas de enzima la cual an es ampliamente usada. Ya que la concentracin de sustrato en Vmax (por ejemplo, el estado donde los sitios activos de la enzima son saturados con sustrato) no puede medirse de manera exacta, las enzimas deben ser caracterizadas por la concentracin de sustrato en la cual el ndice de reaccin est a la mitad de su mximo. Esta concentracin de sustrato es llamada la constante Michaelis-Menten (KM) y cada enzima tiene una KM caracterstica para un sustrato dado.

El ndice metablico en un sustrato constante y concentracin effector y temperatura es proporcional a la concentracin de enzima. El ndice de reaccin es la concentracin de sustrato que desaparece o producto producido por unidad de tiempo (mol litro-1 s-1). La actividad enzimtica es una medida de la cantidad de enzima presente. Est expresada como moles convertidos por unidad de tiempo (ndice x volumen reaccin), la unidad SI es el katal (1 katal = 1 mol s-1). En la prctica, la actividad enzimtica est especificada como unidad de enzima (EU) = 1 micromol min-1. La actividad enzimtica puede ser investigada por cualquiera de los siguientes mtodos: Determinacin del decremento en concentracin de un sustrato crudo sobre un periodo de tiempo Medicin del incrementeo en la concentracin de productos de degradacin durante la reaccin catalizada por la enzima. Para hacer medidas sensibles y especficas de las generalmente pequeas cantidades de enzima, se usa la actividad cataltica de la enzima. La mayora de los mtodos existentes dan resultados muy exactos como, por ejemplo: Medidas fotomtricas, la prueba Hull, la medicin Prescott y Wills, el mtodo Azocasein para protasas. El mtodo pH-estadstico (titracin), el plato Wilhelmy y el mtodo Otead, mtodos espectomtricos, o la Reflektoquant Lipasetest (Merck) para lipasas. Medidas de extincin fotomtrica, sin embargo, son usualmente llevadas a cabo sin excepcin en medios lquidos, los cuales requieren un gasto de acuerdo al dispositivo. Debido a la ejecucin relativamente simple y a su confiabilidad el mtodo de difusin agar en diversas modificaciones es aplicado ampliamente.

III. Clasificacin de Enzimas

Las enzimas son clasificadas por su nmero E.C. determinado por la Unin Internacional de Qumica Pura y Aplicada (IUPAC) y la Unin Internacional de Bioqumica (IUB) en 1992: E.C. 1. Oxireductosas E.C. 2. Transferasas E.C. 3. Hidrolasas E.C. 4. Lyasas E.C. 5. Isomerasas E.C. 6. Ligasas La prdida de caractersticas deseables de alimento y desviaciones sustanciales de un producto son, como ya se mencion, principalmente debido al desarrollo microbial de organismos de descomposicin y para efectos de sus enzimas extracelulares sintetizadas como las lipasas, protasas, carbohidrasas, y oxireductasas que estn descritas a continuacin.

A. Lipasas
Las lipasas como las hidrolasas triacilgliceroladas (E.C. 3.1.1.3) pertenecen a esterasas y catalizan la horquilla de estres insolubles en agua, liberando as, cidos grasos. La reaccin es reversible para que la enzima pueda catalizar la esterificacin de glicerol para formar mono-, di-, y triglicridos. El proceso de la liplisis es a menudo seguido por ms degradacin oxidativa de los cidos grasos liberados hacia alcanos, alquenos, alcoholes, aldehidos, quetonas, y ciclos furnicos que resulta en un contexto de descomposicin conocido como rancidez. Organismos lipolticos tpicos son derivados de los gneros Pseudomonas, Serratia, Micrococcus, Staphylococcus, Alcaligenes, Brevibacterium, Brochothrix, Lactobacillus, levaduras, y moldes que pueden ser detectados por medios que contengan tributirina.

B. Protasas
Enzimas protelicas (E.C. 3.4.) peptido hidrolizan enlaces llevando al desensamblaje de protenas. La separacin hacia molculas pptidas ms pequeas y eventualmente hacia sus componentes amino cidos y ms cerca de amonio, alcohol, dixido de carbono, aminos, e hidrosulfido lleva ya sea a propiedades sensoriales deseables o a no deseables como amargura, gelacin, sabor ptrido, y dems. Las protasas se dividen en dos amplias categoras en base a cmo hiendan (cleave) la cadena polipptido: Exoprotasas hienden (cleave) aminocidos desde el final de la cadena protenica en cualquier N-terminal o C-terminal. Endoprotasas, por otro lado, son capaces de hendir protenas dentro de la protena. En general, el trmino exoprotasas (exoenzimas) tambin es usado como sinnimo para protasas extracelulares que son liberadas por clulas despus de su sntesis y encontradas libres en el medio que las rodea. En contraste, las endoprotasas o enzimas intracelulares se encuentran dentro de las clulas. Sin embargo, la distincin entre estas y las enzimas membrana-enlazadas es generalmente difcil. Las enzimas pueden estar enlazadas con membranas en clulas jvenes y liberadas como exoenzimas a medida que el cultivo entra en la fase estacionaria o solubilizadas por procedimientos relativamente ligeros, incluyendo lavar las clulas con agua. Adems, estos dos grupos estn subdivididos en base al mecanismo de accin en el sitio activo hacia serina, cisteina (thiol), asprtico (cido), y metaloprotasas. Tambin se puede clasificar a las peptidasas por su grados ptimos-pH donde trabajan ms rpido: cido, neutral, y protasas alcalinas. La mayora de las protasas son pequeas, variando de 21,000 a 45,000 Da. Proteolticos importantes, por ejemplo, Pseudomonas, Shewanella, Aeromonas, Acinetobacter, Moraxella, Proteus, Corynebacterium, Lactobacillus, Bacillus, Clostridium, levaduras, y moldes pueden ser detectados usando medios que contienen protenas con aditivos de casena, protena de carne, gelatina, y dems.

C. Carbohidrasas
Carbohidrasas (E.C. 3.2.) hidrolizan polmeros hechos de varios azcares de seis carbonos como la columna vertebral de un polmero. Adems de efectos positivos como acidificacin en procesos de maduracin en deterioraciones de productos fermentados como la aerosis, se puede observar formacin de limo (dextrosa/levano) y metabolizadores como el cido butrico o cidos acticos. La gliclisis se puede evaluar contando las bacterias acido-formadoras en medios que contienen almidn (agar de lactosa azul china).

D. Oxidoreductasas
Todas las enzimas que catalizan oxireducciones pertenecen al grupo de oxireductosas (E.C. 1). El sustrato oxidizado es visto como donante de hidrgeno o electrn. La clasificacin est basada en donante:aceptador oxireductasa. Dehidrogenasas (reductasas) de microorganismos generalmente llevan a decoloraciones (prdida de color) del alimento por producir leucocompuestos. Las reductasas tambin pueden liberar aminos voltiles como la trimetilamina en el pescado que puede ser considerada como una seal inicial de descomposicin. Citocromoxidasas microbiales, sintetizadas, por ejemplo, con Lactobacillus spp., producen perxidos de hidrgeno y son responsables por la decoloracin de salsas.

IV. Sntesis de enzimas

En general, la sntesis de enzimas sigue el esquema de la biosintetizacin de protenas consistiendo de transcripcin traslacin que convierte la informacin gentica del ADN en protenas. Muchas especies, por ejemplo la Psudomonas spp., liberan mltiples lipasas y protasas simultneamente. Adems, Picard mostr que los derivados varan en su actividad proteoltica: un derivado de Pseudomonas fluorescens excret protasas que exhiban actividad muy baja, mientras que otras dos protasas Pseudomonas fluorescens mostraron actividad enzimtica fuerte. En principio, no todas las enzimas sern excretadas, algunas permanecern intracelularmente o ligadas a la clula.

A. Mecanismos de regulacin
Existen dos opiniones principales concernientes a los mecanismos de regulacin de enzimas extracelulares: 1. Abbas-Ali y Coleman (1977) describieron un mecanismo regulatorio basado en competicin en el nivel transcripcional con el resultado que durante el crecimiento exponencial, insignificantes cantidades de protasas extracelulares son sintetizadas debido a la competicin dentro del limitado espacio del contenedor de nucletidos precursores. En el principio de la fase postexponencial del contenedor de estos precursores para sntesis de RNA aumenta, debido al cambio del RNA

estable que finalmente lleva a un incremento en la sntesis. El modelo Coleman parece ser aplicable para organismos Gram-positivos. 2. El modelo induccin-represin de Harder desde 1979 es ms posiblemente apropiado para bacterias Gram-negativas y toma en consideracin que la regulacin est basada en tres grandes pasos: induccin, represin del fin de producto, y/o represin catablica. Asumiendo que los microorganismos producen un bajo nivel basal de enzimas extracelulares en la ausencia de inductores. Cuando sustratos para estas enzimas estn presentes en el ambiente, pequeas cantidades de compuestos inductores sern liberadas por su accin y de esta forma los microorganismos obtienen una seal indicando la presencia de un biopolmero potencialmente til. (p.67)